2013年- 2015年景德鎮(zhèn)市流感病原學監(jiān)測分析

涂智杰，胡芹，余慧宏，閔文光

(景德鎮(zhèn)市疾病預防控制中心，江西景德鎮(zhèn)333000)

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2013年- 2015年景德鎮(zhèn)市流感病原學監(jiān)測分析

涂智杰1，胡芹，余慧宏，閔文光

(景德鎮(zhèn)市疾病預防控制中心，江西景德鎮(zhèn)333000)

摘要:目的分析景德鎮(zhèn)市近3年流感病原學監(jiān)測數(shù)據(jù)，為流感防控提供參考。方法采集哨點醫(yī)院流感樣病例和不明原因肺炎的咽拭子標本，通過Real-PCR方法對標本進行流感病毒核酸檢測和分型，流感病毒核酸檢測陽性標本接種到MDCK細胞進行病毒分離，以人紅細胞凝集及凝集抑制試驗對流感病毒進行鑒定分型。結(jié)果共采集標本2554份，核酸檢測陽性標本265份，分離出流感病毒184株，新甲型H1N1、A（H3N2）亞型和B型毒株均有發(fā)現(xiàn)。2013.4-2014.3年以新甲型H1N1和A(H3N2)為流行優(yōu)勢株，B型毒株兩個系都有出現(xiàn)，但新甲型H1N1從2014年3月之后就沒有再次出現(xiàn)；2014.4-2015.9主要流行株則為A（H3N2及B（Yamagata）少量出現(xiàn)的特點。數(shù)核酸陽性A(H3N2)亞型流感的MDCK細胞陽性分離率從85.71%降至59.02%，病毒血凝抑制效價也從1280降低到最低的40；核酸陽性B型流感病毒的MDCK細胞陽性分離率從62.07%上升到90.91%，病毒血凝抑制效價一般都在1280及以上。結(jié)論景德鎮(zhèn)地區(qū)2013年4月-2015年9月期間，流感流行表現(xiàn)為新甲型（H1N1）短暫流行后，夏季主要以A(H3N2)流感為主，冬春季以B（Yamagata）型流感高發(fā)；A(H3N2)亞型的分離率逐年降低，B型流感病毒分離率上升；A（H3N2）亞型的抗原性變異較大，而B型的抗原性較穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：流感病毒；分離鑒定；血凝抑制效價；流感分型

流感是由流感病毒及其變異株引起的急性呼吸道傳染病，是人類面臨的主要健康問題之一。由于流感病毒易發(fā)生抗原性變異，人群對變異株普遍易感，因此流行具有周期性，并容易迅速導致世界性的大流行，對人群健康、甚至對社會穩(wěn)定和發(fā)展產(chǎn)生重大影響，危害極大。本市在2014年4月的監(jiān)測樣品中就檢出過1例輸入性H7N9病例，因此流感監(jiān)測的意義尤為重要?，F(xiàn)將我市2013年4 月-2015年9月流感病原學監(jiān)測結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1標本采集以景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院為哨點醫(yī)院，根據(jù)《全國流感監(jiān)測方案（2010）》[1]要求，于2013年4月-2015年9月間采集哨點醫(yī)院內(nèi)科門診、內(nèi)科急診、發(fā)熱門診、呼吸科住院部具有流感樣癥狀（體溫≥38℃，伴咳嗽或咽痛之一）或不明原因肺炎，發(fā)熱3d內(nèi)的流感樣病例咽拭子標本，放入3ml采樣液的采樣管中，4℃保存，48h內(nèi)運送至流感網(wǎng)絡實驗室進行檢測。

1.2病毒核酸檢測

1.2.1流感病毒核酸（RNA）提取標本經(jīng)震蕩后，采用Rneasy Mini Kit (QIAGEN) RNA提取試劑盒進行流感樣標本的核酸提取。提取的RNA保存于-80℃低溫冰箱。

1.2.2流感病毒核酸Real-time PCR檢測使用江蘇碩世生物科技有限公司熒光PCR檢測試劑盒，對標本進行A、B型流感檢測及季節(jié)性A（H1N1）、季節(jié)性A（H3N2）、新甲型H1N1、禽流感H7N9流感病毒分型鑒定。以7.5μl反應緩沖液、5μl混合酶（反轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶）、上下游引物及探針4μl和3.5μl去離子水的比例配制PCR反應液并按每孔20μl分裝，加5μl待檢測RNA模板進行擴增。擴增循環(huán)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄反應30min；95℃預變性5min后，以95℃10s、55℃40s、擴增45個循環(huán)，并在55℃時采集熒光信號。選擇Ct小于38的咽拭子樣品用于病毒分離。

1.3流感病毒分離與鑒定核酸檢測陽性的標本接種MDCK細胞進行病毒分離。病毒分離過程按照《全國流感監(jiān)測方案（2010）》[1]中的程序進行，收獲的標本使用人“O”型血紅細胞進行凝集實驗（HA）分離到的HA≥8的流感毒株再進行紅細胞凝集抑制（HI）實驗，鑒定所用標準血清由CNIC統(tǒng)一提供，符合條件的毒株送中國疾病預防控制中心國家流感中心和江西省CDC疾檢所（國家流感參比實驗室）進行復核，準確率100%。

2　結(jié)果

2.1流感病毒檢出情況2013年4月-2015年9月流感哨點醫(yī)院共采集流感樣病例患者咽拭子標本2554份，核酸檢測陽性標本數(shù)265份，核酸陽性率平均為10.37%；詳見表1。

2.2各型、亞型流感病毒分離情況各監(jiān)測年份，A、B型病毒均可分離，A型病毒核酸陽性標本211份，B型病毒核酸陽性標本53份，共接種264份陽性標本；不明原因肺炎檢測H7N9核酸陽性標本由于生物安全規(guī)定，上送國家流感中心，未在本實驗室進行病毒分離；分離毒株共184份。核酸陽性標本病毒平均分離率分別為A型69.19%、B型71.69%，其中分離到季節(jié)性A（H3N2）亞型流感病毒111株、新甲流H1N1流感病毒35株、B型流感38株（1株為Victoria系，37株為Yamagata系）。A型陽性標本中新甲流H1N1流感病毒的分離率最高87.50%，但2014年4月以后未再出現(xiàn)；而A (H3N2)亞型在MDCK細胞中的分離率從85.70%下降到59.02%，呈逐年下降的趨勢。B型流感病毒的分離率呈現(xiàn)逐年升高的特點，2015年4月以來分離率高達90.91%，詳見表2，圖1）。

2.3流感病毒的季節(jié)分布流感病毒總體流行表現(xiàn)為A、B型流感交替出現(xiàn)的特點，全年流感高發(fā)期有兩個時間段分別為冬春季節(jié)（12月-來年4月）和夏季（6-8月）。2013年4月-2014年3月短暫集中的出現(xiàn)新甲流H1N1之后，2014-2015年新甲流H1N1徹底消失。2014年4月-2015年9月A （H3N2）流感主要流行時間為夏季（6-8月）；B型流感為冬春季節(jié)高發(fā)并且主要以B（Yamagata）型為主。（圖1，圖2）

2.4各分離株與抗血清的抑制效價A(H3N2)病毒的血凝抑制抗體效價從2013.4-2014.3主要集中在640-1280，到2014.4-2015.3為160-640，再到2015.4-2015.9為80-320（圖3）；B型毒株的血凝抑制抗體效價一直在1280或以上；新甲流H1N1病毒只在2013.4-2014.3年出現(xiàn)過，血凝抑制效價320-1280（圖3）。三年內(nèi)均未檢測到季節(jié)性A (H1N1)流感病毒。

3　討論

圖1　景德鎮(zhèn)市2013- 2015年不同月份流感病毒分離情況

圖2　景德鎮(zhèn)市2013.4- 2015.9流感樣病例核酸檢測情況

圖3　毒株鑒定-血凝抑制抗體效價分布圖

表1　景德鎮(zhèn)市2013.4- 2015.9流感核酸檢測結(jié)果

表2　景德鎮(zhèn)市2013.4- 2015.9不同型別（亞型）流感病毒核酸陽性標本病毒分離結(jié)果

流感病毒按H和N抗原差異，H可分為15個亞型（H1-15），N有9個亞型（N1-9）.同型病毒又分若干亞型。抗原變異是流感病毒獨特的和最顯著的特征。正是由于這種不斷發(fā)生的抗原變異而導致流感的反復流行。流感病毒的抗原性變異是指H和N抗原結(jié)構(gòu)的改變，主要是H。甲型流感病毒極易發(fā)生抗原變異，2～3年可發(fā)生一次，乙型流感病毒的抗原變異很慢。一般新舊亞型之間有明顯的交替現(xiàn)象，在新的亞型出現(xiàn)并流行到一個地區(qū)后，舊的亞型就不再能分離到。

本實驗室于2009年新甲流大流行期間加入國家流感監(jiān)測網(wǎng)絡，因加入網(wǎng)絡實驗室的時間較晚，病毒分離工作更晚一些。本次對景德鎮(zhèn)市2013.4-2015.9的完整監(jiān)測數(shù)據(jù)進行研究[2-4]，發(fā)現(xiàn)本地區(qū)近3年來流感病毒總體流行特點如下：

⑴流行亞型多樣化，2013年4月-2014年3月表現(xiàn)為季節(jié)性A(H3N2)、新甲型H1N1、B型交替出現(xiàn)，并且2013年12月到2014年1月兩個月內(nèi)同時出現(xiàn)三種流感病毒。結(jié)合2009年8月-2015 年9月的核酸檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：新甲型H1N1在2009年大量暴發(fā)病例后由于人為接種新甲型H1N1疫苗后，2010年4月以后新甲型H1N1的發(fā)病率直線下降(數(shù)據(jù)為列出)，經(jīng)過三年左右的時間新甲型H1N1于2013年4月又開始出現(xiàn)并于當年的冬季短暫大量的出現(xiàn)，隨后的兩年新甲型H1N1在監(jiān)測樣品中不再檢出，并且流感優(yōu)勢株從新甲型H1N1轉(zhuǎn)變?yōu)锳（H3N2）。提示下個監(jiān)測周期可能會有新甲型H1N1的出現(xiàn)。2014年4月-2015年9月主要以季節(jié)性A(H3N2)為優(yōu)勢流感株高發(fā)于夏季6-8月，冬春季以B(Yamagata)型為主，與本省其它地區(qū)流行趨勢一致[5-7]，提示下個監(jiān)測周期B （Victoria）型可能會成為B型流感的優(yōu)勢株。

⑵景德鎮(zhèn)市地處江西東北部，屬于亞熱帶地區(qū)氣候，流感則更多是在夏季流行。根據(jù)上述監(jiān)測情況發(fā)現(xiàn)本地區(qū)的流感高發(fā)期主要集中在夏季6-8月，因此本地區(qū)現(xiàn)階段具有流感季節(jié)性流行特點，不大可能發(fā)生流感大流行[8]。本地區(qū)3年內(nèi)從未檢出過季節(jié)性H1N1流感，人群對此類病毒缺乏免疫可能造成大面積流感暴發(fā)需要引起足夠重視。

⑶通過病毒分離發(fā)現(xiàn)，季節(jié)性A(H3N2)的分離率從85.70%下降到59.02%，呈逐年下降，MDCK細胞對B型流感的分離率逐年上升，并到達最高90.91%分離率，提示MDCK細胞對季節(jié)性A (H3N2)病毒的敏感性降低，或者A(H3N2)病毒對MDCK細胞攻擊性降低，應加強分析，探索分離率提高的方法。

⑷血凝抑制實驗發(fā)現(xiàn)，A(H3N2)的血凝抑制抗體效價也從1280降到最低40；B型流感血凝抑制抗體效價都在1280或以上。通過上述數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)季節(jié)性A(H3N2)抗原性正在逐年發(fā)生明顯變化，而B型流感的抗原性變化較慢，與相關(guān)研究文獻結(jié)果一致[9，10]。

因此對既往流感監(jiān)測數(shù)據(jù)的分析可以幫助我們更好的了解流感在本地區(qū)的流行趨勢；開展流感監(jiān)測能夠第一時間發(fā)現(xiàn)其他型別的流感病毒，減少此類流感病毒在人群中的傳播具有重要意義。

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·調(diào)查報告·

(收稿日期2015-11-11；修回日期2016-02-06)

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.039

中圖分類號：R511.7

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)02-0235-03