依那西普滴眼液用于小鼠干眼癥的效果及其機(jī)制

馮剛，李世瑋，李暉

(1 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000；2 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院東院)

依那西普滴眼液用于小鼠干眼癥的效果及其機(jī)制

馮剛1，李世瑋2，李暉2

(1 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000；2 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院東院)

目的 觀察依那西普滴眼液用于小鼠干眼癥的效果，并探討其作用機(jī)制。方法 將苯扎氯銨溶液誘導(dǎo)的30只干眼癥小鼠隨機(jī)分為干眼組、PBS組、依那西普組，每組10只。干眼組不予任何處理，PBS組、依那西普組分別給予PBS、0.1%依那西普滴眼液滴眼，連用14天。滴眼前(第0天)及滴眼第7、14天檢測(cè)淚液分泌量、淚膜破裂時(shí)間和角膜熒光素鈉染色評(píng)分(角膜染色評(píng)分)。滴眼第14天處死小鼠，檢測(cè)結(jié)膜組織IL-1β、IL-17、TNF-α表達(dá)。結(jié)果 各組滴眼前淚液分泌量、淚膜破裂時(shí)間和角膜染色評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與滴眼前比較，依那西普組滴眼第7、14天淚液分泌量增加、淚膜破裂時(shí)間明顯延長(zhǎng)，角膜染色評(píng)分明顯降低(P均<0.05)，干眼組各指標(biāo)變化不明顯(P均>0.05)；與PBS組、干眼組滴眼第7、14天比較，依那西普組同時(shí)間點(diǎn)淚液分泌量增加、淚膜破裂時(shí)間明顯延長(zhǎng)，角膜染色評(píng)分明顯降低(P均<0.05)，而PBS組、干眼組同期上述各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。滴眼第14天，依那西普組結(jié)膜組織上清液炎癥因子IL-1β、IL-17和TNF-α水平明顯低于干眼組(P均<0.05)，而PBS組、干眼組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 依那西普滴眼液可減輕苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼癥小鼠的臨床癥狀，其機(jī)制可能與抑制IL-1β、IL-17、TNF-α等炎癥因子水平有關(guān)。

干眼癥；依那西普；炎癥因子；小鼠

干眼癥是指任何原因造成的淚液質(zhì)或量異常，或淚液的動(dòng)力學(xué)異常，導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降，并伴有眼部不適和(或)眼表組織病變特征的多種疾病的總稱[1]。主要表現(xiàn)為眼睛干澀，有異物感、癢感、燒灼感，并有畏光、眼部充血、視物模糊、易疲勞等。目前對(duì)干眼癥的常規(guī)治療是人工淚液滴眼，但僅能緩解癥狀。已有研究證實(shí)，炎癥因子(如TNF-α、IL-1等)可參與眼部多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。在某些眼部炎癥性疾病，如難治性葡萄膜炎、鞏膜炎、周邊潰瘍性角膜炎等，全身應(yīng)用TNF-α抑制劑治療效果較好[2,3]。但全身應(yīng)用TNF-α抑制劑對(duì)干眼癥的效果尚不一致[4～6]。鑒于TNF-α在干眼癥動(dòng)物結(jié)膜組織中高表達(dá)，我們推測(cè)局部應(yīng)用TNF-α抑制劑可改善干眼癥狀，并避免全身用藥引起的肝腎損傷等。2015年9～12月，我們觀察了TNF-α抑制劑依那西普滴眼液對(duì)苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼癥的治療效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性BALB/c小鼠50只，8周齡，體質(zhì)量(18±3)g，由錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(遼)2014-0010。常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(25±1)℃，相對(duì)濕度40%，模擬燈光晝夜更替(9：00～21：00)。主要儀器及試劑：S350S型裂隙燈顯微鏡，上海美沃精密儀器有限公司；酚紅棉線，日本Yokota公司；722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海光學(xué)儀器一廠；苯扎氯銨粉末，上海瑞齊生物科技有限公司；PBS，美國(guó)Gibco公司；依那西IFN-γ普，輝瑞制藥有限公司；戊巴比妥鈉，美國(guó)Sigma公司；熒光素鈉溶液，廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司；小鼠IL-17、TNF-α ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；小鼠IL-1β ELISA試劑盒，上海逸峰生物科技有限公司。

1.2 干眼模型制備 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周制備干眼癥模型：每日8：00、18：00給予0.2%苯扎氯銨溶液5 μL(0.2 g苯扎氯銨粉末溶于99.8 mL去離子水)滴眼，連用14天。第15天評(píng)估干眼情況，記錄淚液分泌量，取最接近均數(shù)的30只小鼠納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 動(dòng)物分組及藥物干預(yù) 選取干眼小鼠30只，隨機(jī)分為干眼組、PBS組、依那西普組，每組10只。PBS組次日開始給予PBS 2 μL滴眼，依那西普組給予0.1%依那西普滴眼液(依那西普25 mg加入25 mL PBS中)2 μL滴眼，6 h滴眼1次，連用14天。干眼組不予任何處理。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 淚液分泌量、淚膜破裂時(shí)間和角膜熒光素鈉染色評(píng)分(角膜染色評(píng)分) 淚液分泌量：滴眼前(第0天)及滴眼第7、14天當(dāng)日15：00，腹腔注射1%戊巴比妥40 mg/kg全身麻醉后拉開下瞼，用眼科顯微鑷夾持酚紅棉線，將其置于下結(jié)膜囊中外1/3處，停留60 s取出。顯微鏡下讀取濕潤(rùn)變紅的酚紅棉線長(zhǎng)度(mm)。淚膜破裂時(shí)間：淚液分泌量檢測(cè)后用玻璃棒蘸取1%熒光素鈉溶液1 μL，滴入結(jié)膜囊內(nèi)，手動(dòng)瞬目3次，扒開瞼裂，裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察。秒表計(jì)時(shí)，記錄最后一次瞬目到角膜第1個(gè)黑斑出現(xiàn)的時(shí)間。重復(fù)3次，取平均值。角膜染色評(píng)分：上述熒光素鈉滴入90 s時(shí)，裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察角膜上皮熒光素鈉染色情況。參照Lemp等[7]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)著染；1分為點(diǎn)狀著染；2分為斑塊狀著染，并有部分融合區(qū)；3分為大量融合的斑塊狀著染或片狀著染。角膜分為中央?yún)^(qū)、鼻側(cè)區(qū)、顳側(cè)區(qū)、上區(qū)、下區(qū)，5個(gè)區(qū)得分相加即為染色評(píng)分。最低0分，最高15分。得分越高表示干眼癥越嚴(yán)重。

1.4.2 結(jié)膜組織IL-1β、IL-17、TNF-α水平 滴眼第14天，所有動(dòng)物斷頭處死，立即摘除眼球，取下結(jié)膜組織，置于含蛋白酶抑制劑的裂解液中30 min，以3 000～4 000 r/min離心15 min，收集上清，儲(chǔ)存于-70 ℃，備測(cè)。采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)結(jié)膜組織IL-1β、IL-17、TNF-α，所有操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組淚液分泌量、淚膜破裂時(shí)間、角膜染色評(píng)分比較 見(jiàn)表1。

表1 各組淚液分泌量、淚膜破裂時(shí)間、角膜染色評(píng)分比較

注：與同組第0天比較，*P<0.05；與同組第7天比較，△P<0.05；與干眼組同時(shí)間比較，#P<0.05；與PBS組同時(shí)間比較，▲P<0.05。

2.2 各組結(jié)膜組織IL-1β、IL-17、TNF-α水平比較 見(jiàn)表2。

表2 各組結(jié)膜組織IL-1β、IL-17、TNF-α水平比較

注：與干眼組比較，*P<0.05；與PBS組比較，#P<0.05。

3 討論

苯扎氯銨滴眼可以造成小鼠淚液分泌量減少，淚膜破裂時(shí)間縮短，眼表上皮損傷以及角膜上皮鱗狀化生、杯狀細(xì)胞減少等眼表結(jié)構(gòu)功能的變化，是一種較好的干眼動(dòng)物模型制作方法[7]。近年研究表明，免疫性炎癥可能在干眼癥的發(fā)病中具有重要作用，特別是美國(guó)FDA批準(zhǔn)了免疫制劑——環(huán)孢素A可用于干眼癥的治療，使免疫制劑在干眼癥的研究中越來(lái)越受到關(guān)注。TNF-α是眾多免疫性炎癥因子之一，多種自身免疫性炎性疾病可通過(guò)抑制內(nèi)源性TNF-α的產(chǎn)生來(lái)進(jìn)行治療。研究發(fā)現(xiàn)，膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠全身應(yīng)用TNF-α抑制劑可增加淋巴結(jié)內(nèi)Th1、Th17細(xì)胞數(shù)量，減輕關(guān)節(jié)炎癥狀[8]；抗TNF-α抗體可用于炎癥性腸道疾病和銀屑病等自身免疫性疾病的治療[9，10]；TNF-α是干眼癥患者淚液中主要的炎癥因子之一[11～13]，TNF-α及其受體在干眼癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有重要作用[14]。但關(guān)于TNF-α抑制劑全身用藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性及臨床干眼癥患者的效果尚存爭(zhēng)議。Zhu等[15]在兔干眼模型中發(fā)現(xiàn)，TNF-α抑制基因轉(zhuǎn)染可抑制干眼癥的癥狀。而Vosters等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α抑制劑對(duì)干眼癥小鼠的治療效果一般。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，口服或皮下注射TNF-α抑制劑對(duì)干眼癥患者的療效并不一致[4,6]。而局部應(yīng)用TNF-α抑制劑治療干眼癥的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。局部應(yīng)用TNF-α抑制劑與全身用藥相比，可避免全身用藥的局部注射斑塊、疼痛、靶器官藥物濃度無(wú)法精準(zhǔn)控制等缺點(diǎn)。本研究通過(guò)局部應(yīng)用TNF-α抑制劑——依那西普，觀察了依那西普滴眼液局部應(yīng)用對(duì)干眼癥的臨床效果。

依那西普可通過(guò)拮抗TNF-α的功能，從而抑制炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，各組滴眼前淚液分泌量、淚膜破裂時(shí)間和角膜染色評(píng)分比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明三組動(dòng)物的干眼癥病情基本一致，后續(xù)結(jié)果的差異主要來(lái)自于用藥的不同。與滴眼前相比，依那西普組滴眼第7、14天淚液分泌量增加、淚膜破裂時(shí)間明顯延長(zhǎng)、角膜染色評(píng)分明顯降低，PBS組、干眼組各指標(biāo)變化不明顯；與PBS組、干眼組滴眼第7、14天比較，依那西普組滴眼同期淚液分泌量增加、淚膜破裂時(shí)間明顯延長(zhǎng)、角膜染色評(píng)分明顯降低，而PBS組、干眼組同期上述各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。滴眼第14天，依那西普組結(jié)膜組織上清液炎癥因子IL-1β、IL-17和TNF-α水平均明顯低于PBS組、干眼組，而PBS組、干眼組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明依那西普滴眼液可改善苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼癥小鼠的臨床癥狀。局部應(yīng)用TNF-α抑制劑可直接作用于炎性眼表，效果好于全身用藥[14,16]。而干眼組、PBS組淚液分泌量、淚膜破裂時(shí)間、角膜染色評(píng)分及結(jié)膜組織中炎癥因子在用藥前后并無(wú)明顯變化。表明PBS對(duì)干眼癥狀無(wú)緩解或改善作用。

依那西普制成滴眼液局部應(yīng)用與以往全身用藥對(duì)干眼癥的作用差異可能與以下幾個(gè)方面有關(guān)：①干眼模型的差異。既往全身應(yīng)用TNF-α抑制劑的研究中，應(yīng)用的是自身免疫性疾病干燥綜合癥動(dòng)物模型或患者[4，6，8，15]。干燥綜合征是一個(gè)主要累及外分泌腺體的慢性炎癥性自身免疫性疾病，雖然干燥綜合癥與干眼癥的臨床表現(xiàn)有部分重合，但干燥綜合癥還伴有除淚腺以外的其他外分泌腺功能障礙。因此，干燥綜合癥與干眼癥病理機(jī)制、臨床表現(xiàn)等各方面的差異可能是造成本文與既往研究結(jié)果存在差異的原因。②用藥方式的不同。本研究采用依那西普滴眼液局部用藥，既往研究多采用全身用藥，全身用藥導(dǎo)致靶器官的藥物濃度無(wú)法精確控制，而依那西普的不同濃度對(duì)炎癥的作用并不相同，因此不排除全身用藥后眼結(jié)膜局部的依那西普濃度與本研究0.1%依那西普的濃度差異導(dǎo)致結(jié)果的差異[17]。

分析本研究結(jié)果，依那西普滴眼液可改善干眼癥的臨床癥狀，其機(jī)制可能與抑制TNF-α及其他炎癥因子水平有關(guān)。但本研究觀察時(shí)間較短，其長(zhǎng)期療效還需進(jìn)一步觀察，且用于臨床還需要臨床病例進(jìn)行驗(yàn)證。

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上海健康醫(yī)學(xué)院種子基金項(xiàng)目(HMSF-16-21-013)。

李暉(E-mail： lky0110@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.012

R777

A

1002-266X(2016)24-0037-03

2016-04-20)