大鼠成熟的肺表面活性蛋白B的原核表達(dá)及純化

張瀟駿,王萬(wàn)能， ,周繼紅,劉　欽,顧仕苓,周代君,邱　俊,代　維,袁丹鳳,劉大維

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054；2. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第四研究室，重慶 400042)

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大鼠成熟的肺表面活性蛋白B的原核表達(dá)及純化

張瀟駿1,王萬(wàn)能1，2*,周繼紅2*,劉欽1,顧仕苓1,周代君2,邱俊2,代維2,袁丹鳳2,劉大維2

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054；2. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第四研究室，重慶 400042)

摘要：為表達(dá)和純化SP-B蛋白，先對(duì)SP-B基因進(jìn)行稀有密碼子優(yōu)化，PCR反應(yīng)獲得SP-B 片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX4T-1/SP-B，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)；用SDS-PAGE與Western blot進(jìn)行檢測(cè)；用GSTPrep FF 16/10對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化。經(jīng)雙酶切鑒定證實(shí)質(zhì)粒中插入基因長(zhǎng)250 bp，測(cè)序結(jié)果與大鼠SP-B cDNA 序列相符；質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在分子質(zhì)量約34 ku處出現(xiàn)1個(gè)新條帶，與pGEX4T-1/SP-B蛋白預(yù)期大小一致，且該融合蛋白能可溶性表達(dá)并被純化。結(jié)果表明成功構(gòu)建了pGEX4T-1/SP-B 重組質(zhì)粒，表達(dá)、純化得到GST/SP-B蛋白，為研究肺表面活性物質(zhì)替代藥物奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：肺表面活性蛋白B；原核表達(dá)；免疫印跡；蛋白純化；大鼠

肺表面活性物質(zhì)通過(guò)肺表面活性蛋白起到降低肺泡表面張力，增加肺順應(yīng)性，維持大小肺泡容積相對(duì)穩(wěn)定，防止肺不張和肺水腫的作用[1]，目前已知有4種肺表面活性蛋白，分別是SP-A、B、C和D 4種亞型，其中成熟的SP-B來(lái)源于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，分子質(zhì)量為8.7 ku，是構(gòu)成肺表面活性物質(zhì)的小分子疏水性蛋白之一，屬于鞘脂激活蛋白樣蛋白超家族[2]，是一種多樣的脂質(zhì)相互作用蛋白[3]，主要功能是促進(jìn)磷脂分子擴(kuò)散，使磷脂快速吸附于氣液界面成為單分子層，增加單分子膜的穩(wěn)定性，提高脂質(zhì)復(fù)合物的表面活性[4-6]，參與管狀髓磷脂的形成[7]，具有調(diào)節(jié)肺泡液-氣界表面張力及參與肺器官局部防御體系等重要的生理功能[8-10]。SP-B合成減少、活性降低及組分的改變，會(huì)導(dǎo)致呼吸衰竭和肺不張，說(shuō)明SP-B是維持呼吸的關(guān)鍵因素；SP-B基因突變會(huì)導(dǎo)致某些肺部疾病如特發(fā)性的肺纖維化的發(fā)生[11]；Nogee等指出，SP-B基因的失活會(huì)影響SP-C基因的表達(dá)，導(dǎo)致SP-C蛋白表達(dá)水平降低，進(jìn)而引起間質(zhì)性肺病，同時(shí)會(huì)增加病原感染的可能性，這也說(shuō)明SP-B在肺功能維持和修復(fù)中起著不可替代的作用。

SP-B在肺組織的含量極少，僅占肺表面活性蛋白總含量的1%～1.5%，從動(dòng)物體內(nèi)大量提取異源性SP-B并應(yīng)用于臨床藥物存在許多困難，且容易產(chǎn)生免疫原反應(yīng)[12]。Surfaxin(KL4-surfactant)是Discovery laboratories公司根據(jù)成熟SP-B設(shè)計(jì)的人工合成多肽[13]，但是Palmblad M等[14]研究結(jié)果表明,KL4與SP-B的作用仍存在差異，其作用機(jī)制可能與SP- C相似，無(wú)法完全替代SP-B在肺表面活性物質(zhì)的完整功能。迄今為止，尚未見(jiàn)到成功表達(dá)并純化成熟SP-B的相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)旨在通過(guò)克隆SP-B基因，構(gòu)建一個(gè)含有成熟SP-B蛋白基因片段的原核表達(dá)載體，利用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)成熟SP-B蛋白，并且初步摸索純化條件，為大量表達(dá)、純化成熟SP-B蛋白，開(kāi)發(fā)肺表面活性物質(zhì)替代藥物奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與載體pGEX4T-1、E.coliDpα、E.coliBL21(DE3)，重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院生物工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑2×Master MixTaq聚合酶、T4 DNA 連接酶，廣州復(fù)能基因有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI，美國(guó)NEB公司產(chǎn)品；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜，中國(guó)Biosharp公司產(chǎn)品；兔抗鼠SP-B多克隆抗體，美國(guó)Merck Millipore公司產(chǎn)品；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；GSTPrep FF 16/10預(yù)裝柱，美國(guó)GE公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1SP-B基因合成與引物設(shè)計(jì)通過(guò)查詢、獲得大鼠SP-B cDNA序列(GenBank accession number:HQ267704)，用Condon Adaptation Tool進(jìn)行稀有密碼子優(yōu)化，合成模版SP-B并構(gòu)建在pMD19-T質(zhì)粒上。依據(jù)pGEX4T-1質(zhì)粒圖譜及pMD19-T/SP-B DNA序列分析，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物：上游引物：5′- TTTGGATCCATGGAGGGTTAGGGAGACG-3′，下游引物：5′- AAACTCGAGAGTGGAACAGCGGAGGACCAG

GCC-3′；上、下游引物分別引入限制性酶切位點(diǎn)BamH I、XhoI，目的基因大小為258 bp。

1.2.2SP-B的PCR擴(kuò)增條件94℃變性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物純化按DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3pGEX4T-1/SP-B原核表達(dá)載體的構(gòu)建將pGEX4T-1和SP-B 片段進(jìn)行BamH I、XhoI雙酶切并切膠回收酶切產(chǎn)物，T4 DNA 連接酶4 ℃過(guò)夜連接。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDpα感受態(tài)細(xì)胞， LA 固體培養(yǎng)基(含50 μg/mL 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基)涂布，37 ℃培養(yǎng)；隔天挑取單菌落做菌落PCR鑒定。對(duì)初步鑒定后的菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒做雙酶切鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為pGEX4T-1/SP-B，送公司測(cè)序。

1.2.4IPTG誘導(dǎo)SP-B表達(dá)將重組質(zhì)粒pGEX4T-1/SP-B轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中。分別挑取單菌落接種于LA液體培養(yǎng)基，37 ℃、250 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)。次日以10 mL/L轉(zhuǎn)接于新鮮LA液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)，至菌液OD 600 nm 值為0.8，12 000 r/min離心收集菌體作為誘導(dǎo)前對(duì)照；其余菌液中加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L[15]，于37 ℃、16 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，并于3、6、9、12 h時(shí)分別離心收集菌體，表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE分析。

1.2.5Western blot檢測(cè)SP-B的表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，根據(jù)Marker剪下GST/SP-B所在區(qū)域，用含5 g/100 mL 脫脂奶粉的 TBS-T(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，1 mL/L Tween-20，pH 7.5)封閉1 h；加入兔抗鼠SP-B多克隆抗體(1∶5 000 稀釋)，4℃孵育過(guò)夜；隔天用TBS-T洗滌后加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶5 000 稀釋)，室溫孵育1 h，膜經(jīng)TBS-T洗滌后滴加Chemiluminescent HRP Substrate發(fā)光液，用Tanon 6200 發(fā)光成像工作站成像。

1.2.6GST/SP-B蛋白的純化按10 mL/L接種量將重組菌接種于LA 液體培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)12 h后離心收集所有菌體。用20 mmol/L PBS(含0.1 mmol/L PMSF，pH7.4)重懸菌體沉淀，400 W×5 s×5 s超聲破菌20 min，12 000 r/min離心收集上清, 上清用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。表達(dá)蛋白用GSTPrep FF 16/10預(yù)裝柱進(jìn)行純化，先后用洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L還原性谷胱甘肽，pH8.0)和結(jié)合緩沖液(10 mmol/L PBS，pH7.4)平衡層析柱。上清液上樣GSTPrep FF 16/10，流速為5 mL/min，收集穿透液。用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫峰，洗脫體積約20 mL。用5 ku超濾管濃縮至5 mL，取濃縮后蛋白收集物10 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析，Western blot檢測(cè)方法同1.2.6，并用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

2結(jié)果

2.1稀有密碼子的優(yōu)化

用Condon Adaptation Tool針對(duì)大鼠SP-B序列進(jìn)行稀有密碼子優(yōu)化后，得到如圖1所示的SP-B cDNA基因序列。經(jīng)過(guò)分析，密碼子優(yōu)化后的成熟SP-B氨基酸排列順序與天然成熟SP-B的氨基酸排列沒(méi)有發(fā)生改變。

圖1　密碼子優(yōu)化后的SP-B cDNA 序列

2.2SP-B基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建

以pMD19-T/SP-B為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)所得目的條帶約在250 bp(圖2 A)，符合SP-B cDNA閱讀框的大小。菌落PCR篩選出陽(yáng)性菌落與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致(圖2 B)。質(zhì)粒用BamH I和XhoI進(jìn)行雙酶切，在約4 960 bp和約250 bp處得到兩條條帶(圖2 C)，目的條帶單一、位置正確，與pGEX4T-1和SP-B大小符合，初步證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果顯示,pGEX4T-1質(zhì)粒GST標(biāo)簽后多克隆位點(diǎn)BamH I、XhoI酶切位點(diǎn)中間插入長(zhǎng)240 bp的基因片段，為一開(kāi)放閱讀框架，與GenBank中公布的大鼠SP-B cDNA基因序列、氨基酸序列皆完全一致。圖3為載體構(gòu)建的示意圖。

A.SP-B PCR擴(kuò)增結(jié)果；1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；2.不加模版空白對(duì)照組； 3、4.SP-B PCR擴(kuò)增片段

B.菌落PCR篩選鑒定結(jié)果;1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；2.SP-B PCR 擴(kuò)增片段；3～7.菌落PCR篩選鑒定結(jié)果

C.陽(yáng)性菌落雙酶切鑒定結(jié)果;1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；2.pGEX4T-1/SP-B經(jīng)BamH I、XhoI雙酶切產(chǎn)物；3.未酶切的pGEX4T-1/SP-B質(zhì)粒

A.Results of SP-B PCR;1.DNA Marker DL 2 000；2.Blank control；3,4.SP-B PCR fragment

B.Results of colony PCR screening and identification;1.DNA Marker DL 2 000；2.SP-B PCR fragment；3-7.Colony PCR screening and identificationv

C.Identification results of positive colony by double enzyme digestion;1.DNA Marker DL 2 000；2.Products of pGEX4T-1/SP-B digested byXhoI andBamH I；3.pGEX4T-1/SP-B

圖2SP-B PCR擴(kuò)增與表達(dá)載體構(gòu)建鑒定結(jié)果

Fig.2The results of SP-B PCR and vector construction identification

圖3　載體構(gòu)建示意圖

2.3重組蛋白的表達(dá)與分析

分別于37 ℃、16 ℃條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)6 h 時(shí)取樣進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖4 A 所示，利用ITPG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為16 ℃時(shí)所獲得的目的蛋白量較37 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)量相對(duì)大些，將菌體超聲破碎，離心后上清表達(dá)條帶濃度與全菌體表達(dá)條帶濃度較一致，證明在此溫度下，重組蛋白大多形成可溶性上清，因此確定IPTG誘導(dǎo)最佳溫度為16 ℃。

以確定誘導(dǎo)溫度的重組大腸埃希菌于16 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)，考察誘導(dǎo)持續(xù)的時(shí)間，分別于誘導(dǎo)后3 h～12 h 取樣進(jìn)行SDS-PAGE 分析，并同時(shí)與未誘導(dǎo)空白對(duì)照組在相同的IPTG 誘導(dǎo)條件下進(jìn)行比較，進(jìn)一步確定IPTG誘導(dǎo)的最佳時(shí)間，結(jié)果如圖4 B 所示。同一溫度和IPTG濃度下，在3 h～12 h 內(nèi)，目的蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸最佳，至6 h 后增加量較少，即誘導(dǎo)表達(dá)12 h 可得到最大的誘導(dǎo)量，因此選定誘導(dǎo)時(shí)間為12 h。

A.不同溫度下IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果;1.未誘導(dǎo)的菌體表達(dá)產(chǎn)物；2.37℃條件下IPTG(終濃度0.2 mmol /L) 誘導(dǎo)產(chǎn)物；3.16 ℃條件下IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物；4.16 ℃條件下IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌體破碎后上清產(chǎn)物；5.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

B.16 ℃不同誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間重組蛋白表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果；1.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.未誘導(dǎo)的菌體表達(dá)產(chǎn)物；3.IPTG誘導(dǎo)3 h表達(dá)產(chǎn)物；4.IPTG誘導(dǎo)6 h表達(dá)產(chǎn)物；5.IPTG誘導(dǎo)9 h表達(dá)產(chǎn)物；6.IPTG誘導(dǎo)12 h表達(dá)產(chǎn)物；7.IPTG誘導(dǎo)12 h菌體破碎上清產(chǎn)物

A.Results of expression after IPTG induction at different temperatures；1.Blank control；2.E.coliafter induction by IPTG (0.2 mmol /L) at 37℃；3.E.coliafter induction by IPTG (0.2 mmol /L) at 16℃；4.Expression of the supernatant ofE.coliafter induction by IPTG at 16 ℃；5.Protein molecular weight Marker

B.Results of SDS-PAGE of recombinant protein expressed at 16 ℃ in different inducing time;1.Protein molecular weight Marker；2.Blank control；3.Expression of SP-B induce by IPTG in 3 h；4.Expression of SP-B induced by IPTG in 6 h；5.Expression of SP-B induced by IPTG in 9 h；6.Expression of SP-B induced by IPTG in 12 h；7.Expression of the supernatant of theE.coliinduced by IPTG in 12 h

圖4不同條件下IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

Fig.4The results of expression after IPTG induction in different conditions

2.4Western blot結(jié)果分析

Western blot顯示，不同誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間SP-B蛋白均為單一條帶，無(wú)明顯降解或非特異性條帶出現(xiàn)，說(shuō)明該GST/SP-B蛋白可與特異性抗體結(jié)合發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，同時(shí)證明了GST/SP-B在E.coliBL21(DE3)超聲破碎后的上清液中得到可溶性表達(dá)，且目的蛋白在表達(dá)后超聲處理的過(guò)程中無(wú)降解(圖5)。

2.5重組蛋白的純化結(jié)果

誘導(dǎo)表達(dá)成功后將含有重組質(zhì)粒pGEX4T-1/SP-B的E.coliBL21(DE3)接種于200 mL LB液體培養(yǎng)基中大量表達(dá),表達(dá)蛋白用GSTPrep FF 16/10進(jìn)行純化(圖6)。取含有目的蛋白的細(xì)菌裂解上清液(純化前)和收集的峰值洗脫液(純化后) 用SDS-PAGE檢測(cè)(圖7A)，可見(jiàn)蛋白經(jīng)純化后在電泳圖上蛋白分子質(zhì)量約34 ku處出現(xiàn)一條帶，與預(yù)期的大小一致。對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行Western blot(圖7B)，結(jié)果顯示在分子質(zhì)量約34 ku處SP-B有特異性抗體結(jié)合發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，證明純化后的重組蛋白是GST標(biāo)簽與SP-B的融合蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定的經(jīng)純化并濃縮后的重組蛋白濃度約為52 mg/L。

1.未誘導(dǎo)的菌體表達(dá)產(chǎn)物；2.IPTG誘導(dǎo)3 h表達(dá)產(chǎn)物；3.IPTG誘導(dǎo)6 h表達(dá)產(chǎn)物；4.IPTG誘導(dǎo)9 h表達(dá)產(chǎn)物；5.IPTG誘導(dǎo)12 h表達(dá)產(chǎn)物；6.IPTG誘導(dǎo)12 h菌體破碎上清產(chǎn)物

1.Blank control；2.Expression products induced by IPTG in 3 h；3.Expression products induced by IPTG in 6 h；4.Expression products induced by IPTG in 9 h；5.Expression products induced by IPTG in 12 h；6.Expression products induced of the supernatant by IPTG in 12 h

圖5不同誘導(dǎo)時(shí)間重組蛋白Western blot檢測(cè)

Fig.5The results of Western blot of recombinant proteins

in different induction time

A.洗脫液電導(dǎo)率變化曲線；B.洗脫液蛋白紫外吸收曲線

A.The change curve of the conductivity of the solution；B.Ultraviolet absorption curve of elution liquid protein

圖6重組蛋白純化監(jiān)視圖

Fig.6Monitor map of purified recombinant protein

A.重組蛋白純化后SDS-PAGE結(jié)果;1.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.16 ℃ IPTG誘導(dǎo)12 h菌體破碎上清純化產(chǎn)物

B.重組蛋白純化后Western blot結(jié)果;1.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.未誘導(dǎo)的菌體表達(dá)產(chǎn)物；3.16 ℃ IPTG誘導(dǎo)12 h菌體破碎上清純化產(chǎn)物

A.SDS-PAGE results of purified recombinant proteins;1.Protein molecular weight Marker；2.Expression of the supernatant ofE.coliinduced by IPTG in 12 h at 16 ℃

B.Western blot results of purified recombinant proteins;1.Protein molecular weight Marker；2.Blank control；3.Expression of the supernatant ofE.coliinduced by IPTG in 12 h at 16 ℃

圖7重組蛋白純化后SDS-PAGE與Western blot檢測(cè)

Fig.7Western blot and SDS-PAGE detection of purified recombinant protein

3討論

本研究中大鼠SP-B的cDNA序列經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后合成獲得，有利于真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)。E.coliBL21(DE3)作為宿主菌，其遺傳背景清楚、穩(wěn)定，培養(yǎng)簡(jiǎn)便并且代謝易于控制，是目前使用廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)[16]，但是由于真核生物的基因片段含有在大腸埃希菌表達(dá)體系中難以被高效轉(zhuǎn)錄和翻譯的稀有密碼子，因此，本研究中大鼠SP-B的cDNA序列通過(guò)查詢基因文庫(kù)，密碼子優(yōu)化，合成基因，獲得完整的連續(xù)編碼序列，密碼子優(yōu)化有利于提高SP-B在大腸埃希菌原核表達(dá)體系中的轉(zhuǎn)錄、翻譯效率。我們之前的研究通過(guò)提取大鼠肺組織，RT-PCR反應(yīng)獲得成熟SP-B的cDNA片段，雖然這種方法也可以獲得完整的連續(xù)編碼序列，但是因?yàn)榛蛑谐霈F(xiàn)有多個(gè)稀有密碼子，將其轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌Rosetta(DE3)原核表達(dá)體系中也難以達(dá)到高效表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道[17]，嘗試采用真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)成熟SP-B，但由于SP-B的疏水性和膜結(jié)合性對(duì)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響，最終無(wú)法成功獲得成熟的SP-B蛋白。

選用pGEX4T-1表達(dá)質(zhì)粒，其N端多克隆位點(diǎn)及表達(dá)區(qū)域由Ptac啟動(dòng)子控制，Ptac是一種強(qiáng)效的雜合啟動(dòng)子，在IPTG存在的條件下，可在E.coliBL21(DE3)等宿主菌中高效表達(dá)GST標(biāo)簽融合蛋白。本試驗(yàn)中將GST-tag與疏水性較強(qiáng)的SP-B相融合，GST-tag在N端，SP-B在C端，在對(duì)菌體誘導(dǎo)時(shí)該標(biāo)簽?zāi)苄纬煽扇苄缘鞍祝@有利于促進(jìn)SP-B形成可溶性蛋白而非包涵體，與GST介質(zhì)發(fā)生螯合作用可對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，且可根據(jù)需要由特異性蛋白酶——凝血酶切除。GST-tag不僅簡(jiǎn)化了重組SP-B下游純化的步驟，減少菌體雜蛋白的污染[18]，而且可避免后期純化步驟包涵體復(fù)性過(guò)程中強(qiáng)裂解液或復(fù)性液對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白活性的影響，GST-Tag純化的成熟SP-B蛋白可以直接免疫動(dòng)物制備多克隆抗體。

對(duì)于蛋白的誘導(dǎo)方式，采用較低溫度，時(shí)間較長(zhǎng)的方法，有助于增加重組蛋白在上清液中的溶解。Andreas H等[19]曾用構(gòu)建有SP-B基因的pET-21b質(zhì)粒在37 ℃誘導(dǎo)溫度表達(dá)蛋白，證實(shí)SP-B蛋白形成包涵體，經(jīng)復(fù)性試驗(yàn)后表明蛋白因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)改變而失去活性。用GST作為純化標(biāo)簽特異性比較高，在純化操作過(guò)程中，加大上樣的流速，縮短作用時(shí)間，采用PBS作為裂解緩沖液(含PMSF)，有助于防止蛋白降解，減少非特異吸附。用10 mmol/L還原型谷胱甘肽溫和洗脫，也使目的蛋白的活性受到了很好的保護(hù)。

試驗(yàn)中成功構(gòu)建SP-B的原核表達(dá)載體，并且通過(guò)蛋白純化與Western blot的檢測(cè)，證明在大腸埃希菌體內(nèi)確實(shí)能表達(dá)SP-B蛋白，且能形成可溶性蛋白。但是試驗(yàn)后期在研究用凝血酶切除GST-tag，進(jìn)一步純化SP-B蛋白時(shí)，通過(guò)SDS-PAGE結(jié)合考馬斯亮藍(lán)R250檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GST-tag無(wú)法被凝血酶切下，蛋白分子質(zhì)量大小沒(méi)有發(fā)生改變，無(wú)法形成兩條分子質(zhì)量不同的蛋白條帶,這可能與使用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)不能對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的翻譯后修飾、折疊，菌體中表達(dá)的GST-tag/SP-B上的凝血酶酶切位點(diǎn)無(wú)法暴露在外面、被表達(dá)的蛋白所包埋有關(guān)系，這也成為下一步工作中的一個(gè)重點(diǎn)。

有學(xué)者[20-21]嘗試構(gòu)建SP-B與尿激酶融合蛋白，N端融合SP-B信號(hào)肽表達(dá)分泌蛋白的方法，結(jié)果顯示，uPA的溶纖能力與對(duì)照組相比反而大大降低，SP-B也無(wú)法被成功純化，最后證實(shí)只有在N端構(gòu)建uPa及其信號(hào)肽，C端融合SP-B，才能實(shí)現(xiàn)了uPa/SP-B在CHO細(xì)胞中的分泌表達(dá)。此時(shí)可利用SP-B的疏水性和膜結(jié)合性將其作為一種靶向蛋白進(jìn)行研究[22]，這也能為測(cè)定分析SP-B與磷脂膜結(jié)構(gòu)的相互作用以及運(yùn)用SP-B靶向蛋白功能治療肺部疾病提供方法。

總之，根據(jù)E.coli的密碼子偏好性對(duì)成熟的SP-B基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，構(gòu)建了pGEX4T-1/SP-B原核表達(dá)載體，pGEX4T-1攜帶有GST標(biāo)簽，可促進(jìn)重組成熟 SP-B在E.coli中可溶表達(dá)。成熟的SP-B肽鏈?zhǔn)杷院軓?qiáng)，在原核系統(tǒng)中極易形成包涵體，影響蛋白質(zhì)的正確折疊與活性，甚至不表達(dá)。通過(guò)親水性標(biāo)簽可提高融合蛋白的水溶性，在疏水蛋白的折疊、組裝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本文提供了一種在E.coli中高效表達(dá)SP-B的方法，實(shí)現(xiàn)了SP-B的原核載體表達(dá)，有助于進(jìn)一步的蛋白結(jié)構(gòu)及折疊機(jī)理研究，對(duì)其他重組肺表面活性蛋白質(zhì)的表達(dá)、生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

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Prokaryotic Expression and Purification of Mature Pulmonary Surfactant Protein B of Rats

ZHANG Xiao-jun1,WANG Wan-neng1 ,2,ZHOU Ji-hong2,LIU Qin1,GU Shi-ling1,ZHOU Dai-jun2,QIU Jun2,DAI Wei2,YUAN Dan-feng2LIU Da-wei2

(1.SchoolofPharmacyandBioengineering,ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing,400054,China;2.Department4,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400042,China)

Abstract:In order to express and purify surfactant protein B(SP-B),and the gene of SP-B from rat was cloned,constructed into the prokaryotic vector pGEX4T-1.Firstly,rare codons of SP-B gene were optimized,and cloned into linear pGEX4T-1 after PCR.Secondly,the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3),and the expression of SP-B was detected by SDS-PAGE and Western blot.Then,the recombinant protein was purified by GSTPrep FF 16/10. The results showed that the SP-B gene was 250 bp and the result of sequencing pGEX4T-1/SP-B was consistent with the SP-B cDNA sequence.At the same time, the E.coli BL21(DE3) was induced by IPTG,and one new band about 34 ku appeared.Those results indicated that the pGEX4T-1/SP-B recombinant plasmid was constructed successfully,and the expression and purification of SP-B could be the foundation of pulmonary surfactant alternative drugs.

Key words:surfactant protein B;prokaryotic expression;Western blot;protein purification;rat

文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0018-06

中圖分類號(hào):S852.21;Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：張瀟駿(1990-)，男，廣東汕頭人，碩士研究生，主要從事微生物與生化藥學(xué)研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (81471865)

收稿日期：2015-09-17