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    大鼠成熟的肺表面活性蛋白B的原核表達(dá)及純化

    2016-05-10 09:41:59張瀟駿王萬(wàn)能周繼紅顧仕苓周代君袁丹鳳劉大維
    關(guān)鍵詞:原核表達(dá)

    張瀟駿,王萬(wàn)能, ,周繼紅,劉 欽,顧仕苓,周代君,邱 俊,代 維,袁丹鳳,劉大維

    (1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,重慶 400054;2. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第四研究室,重慶 400042)

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    大鼠成熟的肺表面活性蛋白B的原核表達(dá)及純化

    張瀟駿1,王萬(wàn)能1,2*,周繼紅2*,劉欽1,顧仕苓1,周代君2,邱俊2,代維2,袁丹鳳2,劉大維2

    (1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,重慶 400054;2. 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第四研究室,重慶 400042)

    摘要:為表達(dá)和純化SP-B蛋白,先對(duì)SP-B基因進(jìn)行稀有密碼子優(yōu)化,PCR反應(yīng)獲得SP-B 片段,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX4T-1/SP-B,轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá);用SDS-PAGE與Western blot進(jìn)行檢測(cè);用GSTPrep FF 16/10對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化。經(jīng)雙酶切鑒定證實(shí)質(zhì)粒中插入基因長(zhǎng)250 bp,測(cè)序結(jié)果與大鼠SP-B cDNA 序列相符;質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),在分子質(zhì)量約34 ku處出現(xiàn)1個(gè)新條帶,與pGEX4T-1/SP-B蛋白預(yù)期大小一致,且該融合蛋白能可溶性表達(dá)并被純化。結(jié)果表明成功構(gòu)建了pGEX4T-1/SP-B 重組質(zhì)粒,表達(dá)、純化得到GST/SP-B蛋白,為研究肺表面活性物質(zhì)替代藥物奠定了基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:肺表面活性蛋白B;原核表達(dá);免疫印跡;蛋白純化;大鼠

    肺表面活性物質(zhì)通過(guò)肺表面活性蛋白起到降低肺泡表面張力,增加肺順應(yīng)性,維持大小肺泡容積相對(duì)穩(wěn)定,防止肺不張和肺水腫的作用[1],目前已知有4種肺表面活性蛋白,分別是SP-A、B、C和D 4種亞型,其中成熟的SP-B來(lái)源于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞,分子質(zhì)量為8.7 ku,是構(gòu)成肺表面活性物質(zhì)的小分子疏水性蛋白之一,屬于鞘脂激活蛋白樣蛋白超家族[2],是一種多樣的脂質(zhì)相互作用蛋白[3],主要功能是促進(jìn)磷脂分子擴(kuò)散,使磷脂快速吸附于氣液界面成為單分子層,增加單分子膜的穩(wěn)定性,提高脂質(zhì)復(fù)合物的表面活性[4-6],參與管狀髓磷脂的形成[7],具有調(diào)節(jié)肺泡液-氣界表面張力及參與肺器官局部防御體系等重要的生理功能[8-10]。SP-B合成減少、活性降低及組分的改變,會(huì)導(dǎo)致呼吸衰竭和肺不張,說(shuō)明SP-B是維持呼吸的關(guān)鍵因素;SP-B基因突變會(huì)導(dǎo)致某些肺部疾病如特發(fā)性的肺纖維化的發(fā)生[11];Nogee等指出,SP-B基因的失活會(huì)影響SP-C基因的表達(dá),導(dǎo)致SP-C蛋白表達(dá)水平降低,進(jìn)而引起間質(zhì)性肺病,同時(shí)會(huì)增加病原感染的可能性,這也說(shuō)明SP-B在肺功能維持和修復(fù)中起著不可替代的作用。

    SP-B在肺組織的含量極少,僅占肺表面活性蛋白總含量的1%~1.5%,從動(dòng)物體內(nèi)大量提取異源性SP-B并應(yīng)用于臨床藥物存在許多困難,且容易產(chǎn)生免疫原反應(yīng)[12]。Surfaxin(KL4-surfactant)是Discovery laboratories公司根據(jù)成熟SP-B設(shè)計(jì)的人工合成多肽[13],但是Palmblad M等[14]研究結(jié)果表明,KL4與SP-B的作用仍存在差異,其作用機(jī)制可能與SP- C相似,無(wú)法完全替代SP-B在肺表面活性物質(zhì)的完整功能。迄今為止,尚未見(jiàn)到成功表達(dá)并純化成熟SP-B的相關(guān)報(bào)道。

    本試驗(yàn)旨在通過(guò)克隆SP-B基因,構(gòu)建一個(gè)含有成熟SP-B蛋白基因片段的原核表達(dá)載體,利用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)成熟SP-B蛋白,并且初步摸索純化條件,為大量表達(dá)、純化成熟SP-B蛋白,開(kāi)發(fā)肺表面活性物質(zhì)替代藥物奠定了基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1菌株與載體pGEX4T-1、E.coliDpα、E.coliBL21(DE3),重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院生物工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.2試劑2×Master MixTaq聚合酶、T4 DNA 連接酶,廣州復(fù)能基因有限公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI,美國(guó)NEB公司產(chǎn)品;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜,中國(guó)Biosharp公司產(chǎn)品;兔抗鼠SP-B多克隆抗體,美國(guó)Merck Millipore公司產(chǎn)品;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L),北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;GSTPrep FF 16/10預(yù)裝柱,美國(guó)GE公司產(chǎn)品。

    1.2方法

    1.2.1SP-B基因合成與引物設(shè)計(jì)通過(guò)查詢、獲得大鼠SP-B cDNA序列(GenBank accession number:HQ267704),用Condon Adaptation Tool進(jìn)行稀有密碼子優(yōu)化,合成模版SP-B并構(gòu)建在pMD19-T質(zhì)粒上。依據(jù)pGEX4T-1質(zhì)粒圖譜及pMD19-T/SP-B DNA序列分析,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物:上游引物:5′- TTTGGATCCATGGAGGGTTAGGGAGACG-3′,下游引物:5′- AAACTCGAGAGTGGAACAGCGGAGGACCAG

    GCC-3′;上、下游引物分別引入限制性酶切位點(diǎn)BamH I、XhoI,目的基因大小為258 bp。

    1.2.2SP-B的PCR擴(kuò)增條件94℃變性5 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物純化按DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    1.2.3pGEX4T-1/SP-B原核表達(dá)載體的構(gòu)建將pGEX4T-1和SP-B 片段進(jìn)行BamH I、XhoI雙酶切并切膠回收酶切產(chǎn)物,T4 DNA 連接酶4 ℃過(guò)夜連接。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDpα感受態(tài)細(xì)胞, LA 固體培養(yǎng)基(含50 μg/mL 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基)涂布,37 ℃培養(yǎng);隔天挑取單菌落做菌落PCR鑒定。對(duì)初步鑒定后的菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒做雙酶切鑒定,將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為pGEX4T-1/SP-B,送公司測(cè)序。

    1.2.4IPTG誘導(dǎo)SP-B表達(dá)將重組質(zhì)粒pGEX4T-1/SP-B轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中。分別挑取單菌落接種于LA液體培養(yǎng)基,37 ℃、250 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)。次日以10 mL/L轉(zhuǎn)接于新鮮LA液體培養(yǎng)基中,37 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng),至菌液OD 600 nm 值為0.8,12 000 r/min離心收集菌體作為誘導(dǎo)前對(duì)照;其余菌液中加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L[15],于37 ℃、16 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng),并于3、6、9、12 h時(shí)分別離心收集菌體,表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE分析。

    1.2.5Western blot檢測(cè)SP-B的表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后,蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,根據(jù)Marker剪下GST/SP-B所在區(qū)域,用含5 g/100 mL 脫脂奶粉的 TBS-T(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,1 mL/L Tween-20,pH 7.5)封閉1 h;加入兔抗鼠SP-B多克隆抗體(1∶5 000 稀釋),4℃孵育過(guò)夜;隔天用TBS-T洗滌后加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶5 000 稀釋),室溫孵育1 h,膜經(jīng)TBS-T洗滌后滴加Chemiluminescent HRP Substrate發(fā)光液,用Tanon 6200 發(fā)光成像工作站成像。

    1.2.6GST/SP-B蛋白的純化按10 mL/L接種量將重組菌接種于LA 液體培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)12 h后離心收集所有菌體。用20 mmol/L PBS(含0.1 mmol/L PMSF,pH7.4)重懸菌體沉淀,400 W×5 s×5 s超聲破菌20 min,12 000 r/min離心收集上清, 上清用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。表達(dá)蛋白用GSTPrep FF 16/10預(yù)裝柱進(jìn)行純化,先后用洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L還原性谷胱甘肽,pH8.0)和結(jié)合緩沖液(10 mmol/L PBS,pH7.4)平衡層析柱。上清液上樣GSTPrep FF 16/10,流速為5 mL/min,收集穿透液。用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白,收集洗脫峰,洗脫體積約20 mL。用5 ku超濾管濃縮至5 mL,取濃縮后蛋白收集物10 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析,Western blot檢測(cè)方法同1.2.6,并用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

    2結(jié)果

    2.1稀有密碼子的優(yōu)化

    用Condon Adaptation Tool針對(duì)大鼠SP-B序列進(jìn)行稀有密碼子優(yōu)化后,得到如圖1所示的SP-B cDNA基因序列。經(jīng)過(guò)分析,密碼子優(yōu)化后的成熟SP-B氨基酸排列順序與天然成熟SP-B的氨基酸排列沒(méi)有發(fā)生改變。

    圖1 密碼子優(yōu)化后的SP-B cDNA 序列

    2.2SP-B基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建

    以pMD19-T/SP-B為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)所得目的條帶約在250 bp(圖2 A),符合SP-B cDNA閱讀框的大小。菌落PCR篩選出陽(yáng)性菌落與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致(圖2 B)。質(zhì)粒用BamH I和XhoI進(jìn)行雙酶切,在約4 960 bp和約250 bp處得到兩條條帶(圖2 C),目的條帶單一、位置正確,與pGEX4T-1和SP-B大小符合,初步證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果顯示,pGEX4T-1質(zhì)粒GST標(biāo)簽后多克隆位點(diǎn)BamH I、XhoI酶切位點(diǎn)中間插入長(zhǎng)240 bp的基因片段,為一開(kāi)放閱讀框架,與GenBank中公布的大鼠SP-B cDNA基因序列、氨基酸序列皆完全一致。圖3為載體構(gòu)建的示意圖。

    A.SP-B PCR擴(kuò)增結(jié)果;1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;2.不加模版空白對(duì)照組; 3、4.SP-B PCR擴(kuò)增片段

    B.菌落PCR篩選鑒定結(jié)果;1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;2.SP-B PCR 擴(kuò)增片段;3~7.菌落PCR篩選鑒定結(jié)果

    C.陽(yáng)性菌落雙酶切鑒定結(jié)果;1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;2.pGEX4T-1/SP-B經(jīng)BamH I、XhoI雙酶切產(chǎn)物;3.未酶切的pGEX4T-1/SP-B質(zhì)粒

    A.Results of SP-B PCR;1.DNA Marker DL 2 000;2.Blank control;3,4.SP-B PCR fragment

    B.Results of colony PCR screening and identification;1.DNA Marker DL 2 000;2.SP-B PCR fragment;3-7.Colony PCR screening and identificationv

    C.Identification results of positive colony by double enzyme digestion;1.DNA Marker DL 2 000;2.Products of pGEX4T-1/SP-B digested byXhoI andBamH I;3.pGEX4T-1/SP-B

    圖2SP-B PCR擴(kuò)增與表達(dá)載體構(gòu)建鑒定結(jié)果

    Fig.2The results of SP-B PCR and vector construction identification

    圖3 載體構(gòu)建示意圖

    2.3重組蛋白的表達(dá)與分析

    分別于37 ℃、16 ℃條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)6 h 時(shí)取樣進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果如圖4 A 所示,利用ITPG誘導(dǎo),誘導(dǎo)溫度為16 ℃時(shí)所獲得的目的蛋白量較37 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)量相對(duì)大些,將菌體超聲破碎,離心后上清表達(dá)條帶濃度與全菌體表達(dá)條帶濃度較一致,證明在此溫度下,重組蛋白大多形成可溶性上清,因此確定IPTG誘導(dǎo)最佳溫度為16 ℃。

    以確定誘導(dǎo)溫度的重組大腸埃希菌于16 ℃下誘導(dǎo)表達(dá),考察誘導(dǎo)持續(xù)的時(shí)間,分別于誘導(dǎo)后3 h~12 h 取樣進(jìn)行SDS-PAGE 分析,并同時(shí)與未誘導(dǎo)空白對(duì)照組在相同的IPTG 誘導(dǎo)條件下進(jìn)行比較,進(jìn)一步確定IPTG誘導(dǎo)的最佳時(shí)間,結(jié)果如圖4 B 所示。同一溫度和IPTG濃度下,在3 h~12 h 內(nèi),目的蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸最佳,至6 h 后增加量較少,即誘導(dǎo)表達(dá)12 h 可得到最大的誘導(dǎo)量,因此選定誘導(dǎo)時(shí)間為12 h。

    A.不同溫度下IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果;1.未誘導(dǎo)的菌體表達(dá)產(chǎn)物;2.37℃條件下IPTG(終濃度0.2 mmol /L) 誘導(dǎo)產(chǎn)物;3.16 ℃條件下IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物;4.16 ℃條件下IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌體破碎后上清產(chǎn)物;5.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

    B.16 ℃不同誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間重組蛋白表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果;1.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);2.未誘導(dǎo)的菌體表達(dá)產(chǎn)物;3.IPTG誘導(dǎo)3 h表達(dá)產(chǎn)物;4.IPTG誘導(dǎo)6 h表達(dá)產(chǎn)物;5.IPTG誘導(dǎo)9 h表達(dá)產(chǎn)物;6.IPTG誘導(dǎo)12 h表達(dá)產(chǎn)物;7.IPTG誘導(dǎo)12 h菌體破碎上清產(chǎn)物

    A.Results of expression after IPTG induction at different temperatures;1.Blank control;2.E.coliafter induction by IPTG (0.2 mmol /L) at 37℃;3.E.coliafter induction by IPTG (0.2 mmol /L) at 16℃;4.Expression of the supernatant ofE.coliafter induction by IPTG at 16 ℃;5.Protein molecular weight Marker

    B.Results of SDS-PAGE of recombinant protein expressed at 16 ℃ in different inducing time;1.Protein molecular weight Marker;2.Blank control;3.Expression of SP-B induce by IPTG in 3 h;4.Expression of SP-B induced by IPTG in 6 h;5.Expression of SP-B induced by IPTG in 9 h;6.Expression of SP-B induced by IPTG in 12 h;7.Expression of the supernatant of theE.coliinduced by IPTG in 12 h

    圖4不同條件下IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

    Fig.4The results of expression after IPTG induction in different conditions

    2.4Western blot結(jié)果分析

    Western blot顯示,不同誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間SP-B蛋白均為單一條帶,無(wú)明顯降解或非特異性條帶出現(xiàn),說(shuō)明該GST/SP-B蛋白可與特異性抗體結(jié)合發(fā)生抗原抗體反應(yīng),同時(shí)證明了GST/SP-B在E.coliBL21(DE3)超聲破碎后的上清液中得到可溶性表達(dá),且目的蛋白在表達(dá)后超聲處理的過(guò)程中無(wú)降解(圖5)。

    2.5重組蛋白的純化結(jié)果

    誘導(dǎo)表達(dá)成功后將含有重組質(zhì)粒pGEX4T-1/SP-B的E.coliBL21(DE3)接種于200 mL LB液體培養(yǎng)基中大量表達(dá),表達(dá)蛋白用GSTPrep FF 16/10進(jìn)行純化(圖6)。取含有目的蛋白的細(xì)菌裂解上清液(純化前)和收集的峰值洗脫液(純化后) 用SDS-PAGE檢測(cè)(圖7A),可見(jiàn)蛋白經(jīng)純化后在電泳圖上蛋白分子質(zhì)量約34 ku處出現(xiàn)一條帶,與預(yù)期的大小一致。對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行Western blot(圖7B),結(jié)果顯示在分子質(zhì)量約34 ku處SP-B有特異性抗體結(jié)合發(fā)生抗原抗體反應(yīng),證明純化后的重組蛋白是GST標(biāo)簽與SP-B的融合蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定的經(jīng)純化并濃縮后的重組蛋白濃度約為52 mg/L。

    1.未誘導(dǎo)的菌體表達(dá)產(chǎn)物;2.IPTG誘導(dǎo)3 h表達(dá)產(chǎn)物;3.IPTG誘導(dǎo)6 h表達(dá)產(chǎn)物;4.IPTG誘導(dǎo)9 h表達(dá)產(chǎn)物;5.IPTG誘導(dǎo)12 h表達(dá)產(chǎn)物;6.IPTG誘導(dǎo)12 h菌體破碎上清產(chǎn)物

    1.Blank control;2.Expression products induced by IPTG in 3 h;3.Expression products induced by IPTG in 6 h;4.Expression products induced by IPTG in 9 h;5.Expression products induced by IPTG in 12 h;6.Expression products induced of the supernatant by IPTG in 12 h

    圖5不同誘導(dǎo)時(shí)間重組蛋白Western blot檢測(cè)

    Fig.5The results of Western blot of recombinant proteins

    in different induction time

    A.洗脫液電導(dǎo)率變化曲線;B.洗脫液蛋白紫外吸收曲線

    A.The change curve of the conductivity of the solution;B.Ultraviolet absorption curve of elution liquid protein

    圖6重組蛋白純化監(jiān)視圖

    Fig.6Monitor map of purified recombinant protein

    A.重組蛋白純化后SDS-PAGE結(jié)果;1.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);2.16 ℃ IPTG誘導(dǎo)12 h菌體破碎上清純化產(chǎn)物

    B.重組蛋白純化后Western blot結(jié)果;1.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);2.未誘導(dǎo)的菌體表達(dá)產(chǎn)物;3.16 ℃ IPTG誘導(dǎo)12 h菌體破碎上清純化產(chǎn)物

    A.SDS-PAGE results of purified recombinant proteins;1.Protein molecular weight Marker;2.Expression of the supernatant ofE.coliinduced by IPTG in 12 h at 16 ℃

    B.Western blot results of purified recombinant proteins;1.Protein molecular weight Marker;2.Blank control;3.Expression of the supernatant ofE.coliinduced by IPTG in 12 h at 16 ℃

    圖7重組蛋白純化后SDS-PAGE與Western blot檢測(cè)

    Fig.7Western blot and SDS-PAGE detection of purified recombinant protein

    3討論

    本研究中大鼠SP-B的cDNA序列經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后合成獲得,有利于真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)。E.coliBL21(DE3)作為宿主菌,其遺傳背景清楚、穩(wěn)定,培養(yǎng)簡(jiǎn)便并且代謝易于控制,是目前使用廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)[16],但是由于真核生物的基因片段含有在大腸埃希菌表達(dá)體系中難以被高效轉(zhuǎn)錄和翻譯的稀有密碼子,因此,本研究中大鼠SP-B的cDNA序列通過(guò)查詢基因文庫(kù),密碼子優(yōu)化,合成基因,獲得完整的連續(xù)編碼序列,密碼子優(yōu)化有利于提高SP-B在大腸埃希菌原核表達(dá)體系中的轉(zhuǎn)錄、翻譯效率。我們之前的研究通過(guò)提取大鼠肺組織,RT-PCR反應(yīng)獲得成熟SP-B的cDNA片段,雖然這種方法也可以獲得完整的連續(xù)編碼序列,但是因?yàn)榛蛑谐霈F(xiàn)有多個(gè)稀有密碼子,將其轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌Rosetta(DE3)原核表達(dá)體系中也難以達(dá)到高效表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道[17],嘗試采用真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)成熟SP-B,但由于SP-B的疏水性和膜結(jié)合性對(duì)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響,最終無(wú)法成功獲得成熟的SP-B蛋白。

    選用pGEX4T-1表達(dá)質(zhì)粒,其N端多克隆位點(diǎn)及表達(dá)區(qū)域由Ptac啟動(dòng)子控制,Ptac是一種強(qiáng)效的雜合啟動(dòng)子,在IPTG存在的條件下,可在E.coliBL21(DE3)等宿主菌中高效表達(dá)GST標(biāo)簽融合蛋白。本試驗(yàn)中將GST-tag與疏水性較強(qiáng)的SP-B相融合,GST-tag在N端,SP-B在C端,在對(duì)菌體誘導(dǎo)時(shí)該標(biāo)簽?zāi)苄纬煽扇苄缘鞍祝@有利于促進(jìn)SP-B形成可溶性蛋白而非包涵體,與GST介質(zhì)發(fā)生螯合作用可對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化,且可根據(jù)需要由特異性蛋白酶——凝血酶切除。GST-tag不僅簡(jiǎn)化了重組SP-B下游純化的步驟,減少菌體雜蛋白的污染[18],而且可避免后期純化步驟包涵體復(fù)性過(guò)程中強(qiáng)裂解液或復(fù)性液對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白活性的影響,GST-Tag純化的成熟SP-B蛋白可以直接免疫動(dòng)物制備多克隆抗體。

    對(duì)于蛋白的誘導(dǎo)方式,采用較低溫度,時(shí)間較長(zhǎng)的方法,有助于增加重組蛋白在上清液中的溶解。Andreas H等[19]曾用構(gòu)建有SP-B基因的pET-21b質(zhì)粒在37 ℃誘導(dǎo)溫度表達(dá)蛋白,證實(shí)SP-B蛋白形成包涵體,經(jīng)復(fù)性試驗(yàn)后表明蛋白因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)改變而失去活性。用GST作為純化標(biāo)簽特異性比較高,在純化操作過(guò)程中,加大上樣的流速,縮短作用時(shí)間,采用PBS作為裂解緩沖液(含PMSF),有助于防止蛋白降解,減少非特異吸附。用10 mmol/L還原型谷胱甘肽溫和洗脫,也使目的蛋白的活性受到了很好的保護(hù)。

    試驗(yàn)中成功構(gòu)建SP-B的原核表達(dá)載體,并且通過(guò)蛋白純化與Western blot的檢測(cè),證明在大腸埃希菌體內(nèi)確實(shí)能表達(dá)SP-B蛋白,且能形成可溶性蛋白。但是試驗(yàn)后期在研究用凝血酶切除GST-tag,進(jìn)一步純化SP-B蛋白時(shí),通過(guò)SDS-PAGE結(jié)合考馬斯亮藍(lán)R250檢測(cè),發(fā)現(xiàn)GST-tag無(wú)法被凝血酶切下,蛋白分子質(zhì)量大小沒(méi)有發(fā)生改變,無(wú)法形成兩條分子質(zhì)量不同的蛋白條帶,這可能與使用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)不能對(duì)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的翻譯后修飾、折疊,菌體中表達(dá)的GST-tag/SP-B上的凝血酶酶切位點(diǎn)無(wú)法暴露在外面、被表達(dá)的蛋白所包埋有關(guān)系,這也成為下一步工作中的一個(gè)重點(diǎn)。

    有學(xué)者[20-21]嘗試構(gòu)建SP-B與尿激酶融合蛋白,N端融合SP-B信號(hào)肽表達(dá)分泌蛋白的方法,結(jié)果顯示,uPA的溶纖能力與對(duì)照組相比反而大大降低,SP-B也無(wú)法被成功純化,最后證實(shí)只有在N端構(gòu)建uPa及其信號(hào)肽,C端融合SP-B,才能實(shí)現(xiàn)了uPa/SP-B在CHO細(xì)胞中的分泌表達(dá)。此時(shí)可利用SP-B的疏水性和膜結(jié)合性將其作為一種靶向蛋白進(jìn)行研究[22],這也能為測(cè)定分析SP-B與磷脂膜結(jié)構(gòu)的相互作用以及運(yùn)用SP-B靶向蛋白功能治療肺部疾病提供方法。

    總之,根據(jù)E.coli的密碼子偏好性對(duì)成熟的SP-B基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,構(gòu)建了pGEX4T-1/SP-B原核表達(dá)載體,pGEX4T-1攜帶有GST標(biāo)簽,可促進(jìn)重組成熟 SP-B在E.coli中可溶表達(dá)。成熟的SP-B肽鏈?zhǔn)杷院軓?qiáng),在原核系統(tǒng)中極易形成包涵體,影響蛋白質(zhì)的正確折疊與活性,甚至不表達(dá)。通過(guò)親水性標(biāo)簽可提高融合蛋白的水溶性,在疏水蛋白的折疊、組裝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本文提供了一種在E.coli中高效表達(dá)SP-B的方法,實(shí)現(xiàn)了SP-B的原核載體表達(dá),有助于進(jìn)一步的蛋白結(jié)構(gòu)及折疊機(jī)理研究,對(duì)其他重組肺表面活性蛋白質(zhì)的表達(dá)、生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Samuel H,Matthew D,Francis P.Structure and properties of surfactant protein B[J].Biochim Biophy Acta,1998,1408:150-160.

    [2]Barbara O,Begona G,Jesus P.Structure-function correlations of pulmonary surfactant protein SP-B and the saposin-like family of proteins[J].Eur Biophys J,2013,42:209-222.

    [3]Zaltash S,Palmblad M,Curstedt T,et al.Pulmonary surfactant protein B: A structural model and a functional analogue[J].Biochim Biophys Acta,2000,7:179-186.

    [4]Elisa P,Lara H,Ivan L,et al,A combined action of pulmonary surfactant proteins SP-B and SP-C modulates permeability and dynamics of phospholipid membranes[J].Biochem J,2011,438:555-564.

    [5]Nogee L M,De Mello D,Dehner L,et al.Pulmonary surfactant protein B deficiency in congenital pulmonary alveolar proteinosis[J].N Engl J Med,1993,328:406-410.

    [6]Tore C,Jan J.Different effects of surfactant proteins B and C-implications for development of synthetic surfactant[J].Neonatology,2010,97:367-372.

    [7]De Mello D,Nogee L M,Heymans,et al.Molecular and phenotypic variability in the congenital alveolar proteinosis syndrome associated with inherited surfactant protein B deficiency[J].J Pediatr,1994,125:43-50.

    [8]Whitsett J,Weaver T.Hydrophobic surfactant proteins in lung function and disease[J].N Engl J Med,2002,26:2141-2148.

    [9]Nogee L M.Genetics of pediatric interstitial lung disease[J].Curr Opin Pediatr,2006,18(3):287-292.

    [10]Ariki S,Kojima T,Gasa S,et al.Pulmonary collections play distinct roles in host defense againstMycobacteriumavium[J].J Immunol,2011,187(5): 2586-2594.

    [11]Moises S,Hung-mo L,Martha M,et al.Sufactant protein A and B genetic variations predispose to idiopathic pulmonary fibrosis[J].Hum Genet,2003,113(6):542-550.

    [12]Atsuyasu S,Machiko I.SP-B and SP-C containing new synthetic surfactant for treatment of extremely immature lamb lung[J].PLoS One,2012(7):1-11.

    [13]王鵬,王萬(wàn)能,呂婧,等.疏水性肺表面活性蛋白SPB-結(jié)構(gòu)類似物的研究進(jìn)展[J].華西藥學(xué)雜志,2013,28(6):98-102.

    [14]Palmblad M,Johansson J,Robertson B,et al.Biophysical activity of an artificial surfactant containing an analogue of surfactant protein (SP)-C and native SP-B[J].Biochem J,1999:339:381.

    [15]Thouvenin G,Abou T R,Flamein F,et al.Characteristics of disorders associated with genetic mutations of surfactant protein C[J].Arch Dis Child,2010,95(6):449-454.

    [16]Sorensen H P,Mortensen K K.Advanced genetic strategies for recombinant protein expression inEscherichiacoli[J].J Biotechnol,2005(115):113-128.

    [17]Sui L,Phillips K S,Wilder M R,et al.Structural requirements for intracellular transport of pulmonary surfactant protein B (SP-B)[J].Biochim Biophys Acta,1996,1312:177-185.

    [18]Seltsam A,Grueger D,Blasczyk R,et al.Easy identification of antibodies to high-prevalence Scianna antigens and detection of admixed alloantibodies using soluble recombinant Scianna protein[J].Transfusion,2009,49(10):2090-2096.

    [19]Andreas H,Karen S P,Timothy E W.Single-step purification/solubilization of recombinant proteins:Application to surfactant protein B[J].Bio Tech,1996(20):804-808.

    [20]Clemens R,Poornima M,Malgorzata W,et al.Recombinant production of a hybrid plasminogen activator composed of surfactant protein B and low-molecular-weight urokinase[J].J Thromb Haemost,2008,100(6):1185-1192.

    [21]Ruppert C,Markart P,Schmidt R,et al.Chemical crosslinking of urokinase to pulmonary surfactant protein B for targeting alveolar fibrin[J].Thromb Haemost,2003(89): 53-64.

    [22]Lin S,Akinbi H T,Breslin J,et al.Structural requirements for targeting of surfactant protein B (SP-B) to secretory granulesinvitroandinvivo[J].J Biol Chem,1996(271):19689-19695.

    Prokaryotic Expression and Purification of Mature Pulmonary Surfactant Protein B of Rats

    ZHANG Xiao-jun1,WANG Wan-neng1 ,2,ZHOU Ji-hong2,LIU Qin1,GU Shi-ling1,ZHOU Dai-jun2,QIU Jun2,DAI Wei2,YUAN Dan-feng2LIU Da-wei2

    (1.SchoolofPharmacyandBioengineering,ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing,400054,China;2.Department4,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400042,China)

    Abstract:In order to express and purify surfactant protein B(SP-B),and the gene of SP-B from rat was cloned,constructed into the prokaryotic vector pGEX4T-1.Firstly,rare codons of SP-B gene were optimized,and cloned into linear pGEX4T-1 after PCR.Secondly,the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3),and the expression of SP-B was detected by SDS-PAGE and Western blot.Then,the recombinant protein was purified by GSTPrep FF 16/10. The results showed that the SP-B gene was 250 bp and the result of sequencing pGEX4T-1/SP-B was consistent with the SP-B cDNA sequence.At the same time, the E.coli BL21(DE3) was induced by IPTG,and one new band about 34 ku appeared.Those results indicated that the pGEX4T-1/SP-B recombinant plasmid was constructed successfully,and the expression and purification of SP-B could be the foundation of pulmonary surfactant alternative drugs.

    Key words:surfactant protein B;prokaryotic expression;Western blot;protein purification;rat

    文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0018-06

    中圖分類號(hào):S852.21;Q789

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    作者簡(jiǎn)介:張瀟駿(1990-),男,廣東汕頭人,碩士研究生,主要從事微生物與生化藥學(xué)研究。*通訊作者

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (81471865)

    收稿日期:2015-09-17

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