大黃酸調(diào)控Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路抑制卵巢癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與侵襲

唐 敏，李 鴻，周國(guó)梅，謝一泓，阮和云，黎丹戎

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西南寧 530021）

大黃酸調(diào)控Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路抑制卵巢癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與侵襲

唐 敏，李 鴻，周國(guó)梅，謝一泓，阮和云，黎丹戎

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西南寧 530021）

目的 探討大黃酸對(duì)卵巢癌淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移SKOV3-PM4細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的影響，揭示大黃酸調(diào)控Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路與抑制卵巢癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲作用的機(jī)制。方法 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察大黃酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響，Matrigel-Transwell方法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，激光共聚焦掃描顯微鏡和掃描電鏡觀察大黃酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架超微結(jié)構(gòu)的影響，Western blot分別檢測(cè)Rac1/LIMK1/cofilin通路上Rac1、LIMK1、PAK1、cofilin蛋白的表達(dá)。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，大黃酸能抑制SKOV3-PM4細(xì)胞侵襲和遷移能力，濃度為8.8、17.60、26.40 μmol·L－1的大黃酸處理24 h后，細(xì)胞體外遷移和侵襲能力均明顯下降（P＜0.05）；細(xì)胞出現(xiàn)偽足減少，細(xì)胞內(nèi)微絲斷裂、分布紊亂，質(zhì)膜凹凸不平、細(xì)胞間的間隙變寬等超微結(jié)構(gòu)改變；Western blot結(jié)果表明大黃酸能明顯下調(diào)Rac1蛋白的表達(dá)水平，并呈濃度依賴性。卵巢癌細(xì)胞經(jīng)大黃酸及Rac1抑制劑處理后，磷酸化LIMK1、cofilin、PAK1蛋白水平與空白對(duì)照組比較明顯下降，且大黃酸聯(lián)合Rac1抑制劑處理后的磷酸化蛋白下調(diào)更為明顯（P＜0.05）；而Rac1激活劑聯(lián)合大黃酸組比大黃酸組磷酸化蛋白上調(diào)明顯（P＜0.05）。結(jié)論 大黃酸為潛在的Rac1小分子抑制劑，其作用機(jī)制可能是調(diào)控Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路，抑制卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲的能力。

卵巢癌；大黃酸；Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路；細(xì)胞骨架；轉(zhuǎn)移與侵襲；Rac1抑制劑；Rac1激活劑

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，病死率居?jì)D科惡性腫瘤首位。卵巢癌早期發(fā)病隱匿，60％患者就診時(shí)已出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移特別是淋巴道轉(zhuǎn)移的晚期癥狀，且70％患者雖經(jīng)過(guò)手術(shù)和放化療但仍在2年內(nèi)復(fù)發(fā)并伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［1］。腫瘤細(xì)胞經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移侵入外周正常組織引起癌癥的擴(kuò)散，是惡性腫瘤患者死亡的主要原因，近40年來(lái)卵巢癌晚期患者5年存活率所占比例不足30％。臨床上卵巢癌常以直接蔓延和種植播散的方式侵襲子宮、骨盆和腹腔，也可經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移至腹腔外的重要器官。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是卵巢惡性腫瘤的重要生物學(xué)特性，50％以上晚期卵巢癌病例發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈旁和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的總生存期比陰性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的總生存期明顯縮短，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)。而目前對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療既無(wú)特異的靶點(diǎn)，更無(wú)特效的藥物。臨床上卵巢癌化療所采用的鉑類與紫杉醇聯(lián)合化療標(biāo)準(zhǔn)方案更多的是針對(duì)卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)特征，現(xiàn)有靶向治療藥物貝伐單抗和奧拉帕尼主要是抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的生物效應(yīng)和用于治療攜帶BRCA突變基因的卵巢癌患者。因此，尋找卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)卵巢癌轉(zhuǎn)移具有抑制作用的藥物及其作用機(jī)制具有重要的意義［2］。

大量研究發(fā)現(xiàn)［3］，Rac1具有潛在的轉(zhuǎn)化和致細(xì)胞癌變能力，直接參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。低血清培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)，若持續(xù)表達(dá)活化的Rac1能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，接種到裸鼠體內(nèi)可導(dǎo)致腫瘤形成，異?；罨腞ac1能啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖、侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的特性。Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路中Rac1可通過(guò)PAK1激活LIMK1，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白，參與微絲肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維和黏著斑形成，調(diào)節(jié)微絲骨架系統(tǒng)從而影響腫瘤細(xì)胞的遷移與轉(zhuǎn)移。文獻(xiàn)報(bào)道大黃酸（Rhein，4，5-Dihydroxyanthraquinone-2-car-boxylicacid）能抑制乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［4］。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，大黃酸對(duì)淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移的卵巢癌細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)增殖抑制作用，但其抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的作用機(jī)制及涉及的信號(hào)傳導(dǎo)通路尚不清楚。因此本文采用具有淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移的卵巢癌細(xì)胞SKOV3-PM4進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，觀察大黃酸靶向調(diào)控Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路的作用，為發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的先導(dǎo)化合物和治療卵巢癌新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大黃酸（南京朗澤醫(yī)藥科技有限公司），以二甲亞砜（DMSO）（北京索萊寶公司）溶解至17.60mmol·L－1，常溫保存。RPMI 1640（美國(guó)Hyclon公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；兔多克隆Phospho-cofilin（Ser3）抗體（美國(guó)Cell Signaling公司）；鼠單克隆抗體LIMK1、兔多克隆抗體LIMK1 （phospho T508）、兔多克隆PAK1、兔多克隆PAK1 （phospho T212）、兔多克隆cofilin抗體、GAPDH內(nèi)對(duì)照抗體、二抗（美國(guó)Abcam公司）；鼠單克隆抗體Rac1（美國(guó)Millipore公司）；Matrigel基質(zhì)膠（BD公司）；ActinGreenTM488 ReadyProbes?Reagent（美國(guó)life公司）；DAPI染液和抗熒光淬滅封片劑（上海碧云天公司）；Rac1抑制劑NSC23766（美國(guó)Selleck公司）；Rac1激活劑PMA（美國(guó)Cayman化工公司）。

1.2 細(xì)胞處理 人卵巢癌淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系（SKOV3-PM4）為本課題組構(gòu)建，并經(jīng)生物學(xué)鑒定［5］。人卵巢癌淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞（SKOV3-PM4）常規(guī)培養(yǎng)于含有10％的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取指數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90％以上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)共分2組：空白對(duì)照組（DMSO的濃度低于2.5 ml·L－1）和不同濃度加藥處理組（藥物濃度對(duì)細(xì)胞的抑制率均低于10％）。

1.3 細(xì)胞體外遷移能力測(cè)定 在6孔板中加入呈指數(shù)生長(zhǎng)的SKOV3-PM4細(xì)胞懸液，貼壁形成單層細(xì)胞后，用消毒后的200 μL槍頭均勻劃2條豎線，用PBS洗細(xì)胞3次，去除懸浮的細(xì)胞。每組每孔分別加入對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率低于10％的3個(gè)濃度梯度，即含終濃度為8.80、17.60、26.40 μmol·L－1的大黃酸的無(wú)血清培養(yǎng)基。在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱孵育0、12、24、48 h后，在顯微鏡下拍照，測(cè)量劃痕閉合寬度。

1.4 細(xì)胞體外侵襲能力測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別經(jīng)終濃度為8.80、17.60、26.40 μmol·L－1大黃酸的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，消化各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，每孔2×107個(gè)/升，重復(fù)3孔，分別接種于含Matrigel膠的Transwell小室上層，在下層小室加入含有10％胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基。37℃、5％CO2孵育24 h后取出濾膜，擦去Matrigel膠，甲醇固定15 min，蘇木精染色10 min。顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.5 掃描電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化 取細(xì)胞濃度為2×107個(gè)·L－1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，每孔分別加入終濃度為8.80、26.40 μmol· L－1大黃酸的無(wú)血清培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱孵育2、6、12 h后，棄培養(yǎng)液，PBS快速清洗1遍，預(yù)冷3％戊二醛固定10 min，PBS清洗3×10 min，50％酒精脫水10 min，70％酒精脫水至少4h等處理，在掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞骨架的變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3-PM4細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×107個(gè)·L－1制備細(xì)胞爬片，每孔分別加入終濃度為8.80、26.40 μmol·L－1大黃酸的無(wú)血清培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱孵育12 h后，棄培養(yǎng)液，PBS快速清洗1遍，4％多聚甲醛固定后，PBS清洗3次，每次10 min，并用0.5％Triton X-100透膜室溫孵育3 min；PBS洗滌后加入ActinGreenTM488 ReadyProbes?Reagent標(biāo)記F-actin，室溫避光孵育120 min，PBS洗滌3次，DAPI染色劑避光孵育10 min后，PBS洗滌3次，使用抗熒光淬滅劑封片。采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架變化情況。

1.7 Western blot檢測(cè)Rac1、cofilin、P-cofilin、LIMK1、P-LIMK1、PAK1、P-PAK1蛋白的表達(dá)水平 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3-PM4細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度的大黃酸、Rac1抑制劑、Rac1激活劑、大黃酸聯(lián)合Rac1抑制劑、大黃酸聯(lián)合Rac1激活劑孵育細(xì)胞12 h后，收集細(xì)胞并裂解，提取蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白（60～100）μg加入上樣緩沖液混勻后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，冰浴150 mA恒流條件下電轉(zhuǎn)150 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后用封閉液封閉PVDF膜至少2 h，以Rac1（1∶250）、cofilin（1∶250）、P-cofilin（1∶200）、LIMK1（1∶500）、P-LIMK1（1∶100）、PAK1 （1∶500）、P-PAK1（1∶250）或GAPDH一抗（1∶6 000），于搖床孵育PVDF膜4℃過(guò)夜，PBST洗膜3次，每次5 min。于辣根過(guò)氧化物酶共價(jià)的二抗（1∶2 000）室溫孵育PVDF膜2 h，PBST洗膜3次，每次10 min，后滴入化學(xué)發(fā)光液，凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Adobe Photoshop軟件進(jìn)行圖像處理；SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用±s表示，多組比較采用方差分析；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞體外遷移能力測(cè)定 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同濃度的大黃酸處理后，對(duì)SKOV3-PM4細(xì)胞遷移的距離進(jìn)行測(cè)量分析，大黃酸能抑制細(xì)胞的遷移，而且呈時(shí)間和劑量的依賴效應(yīng)。濃度越高、孵育時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞的遷移能力越弱（Fig 1）。

Fig 1 Effect of Rhein on migrating ability of SKOV3-PM4 cells

2.2 細(xì)胞體外侵襲能力測(cè)定 SKOV3-PM4細(xì)胞經(jīng)大黃酸0、8.80、17.60、26.40 μmol·L－1濃度藥物處理24 h后，穿膜細(xì)胞數(shù)目分別為（37.8±1.72）、（25.4±1.84）、（16.6±1.85）和（12.6±2.57）。經(jīng)不同濃度的大黃酸處理SKOV3-PM4，隨著藥物濃度的升高，體外遷移能力隨之明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），見Fig 2。

2.3 掃描電鏡結(jié)果 電鏡觀察結(jié)果可見，未經(jīng)大黃酸處理的SKOV3-PM4細(xì)胞形態(tài)多樣，表面有豐富的纖毛和偽足（Fig 3紅色箭頭所示），細(xì)胞表面有具有縱橫交錯(cuò)的皺褶，呈指狀或嵴狀突起。與空白組相比，濃度8.80 μmol·L－1大黃酸處理的細(xì)胞纖毛和偽足變化不明顯，而濃度為26.40 μmol·L－1大黃酸處理12h后細(xì)胞收縮明顯，出現(xiàn)圓鈍樣突起，纖毛、偽足、指狀或嵴狀突起均減少，細(xì)胞之間間隙變大，出現(xiàn)質(zhì)膜邊緣凹凸不平，明顯翻折現(xiàn)象（Fig 3白色箭頭所示）。

2.4 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞骨架變化結(jié)果 分別觀察SKOV3-PM4細(xì)胞經(jīng)不同濃度大黃酸處理12 h后對(duì)細(xì)胞骨架的影響。細(xì)胞內(nèi)綠色熒光標(biāo)志為F-actin，藍(lán)色熒光標(biāo)志為細(xì)胞核。從Fig 4可見空白組的SKOV3-PM3細(xì)胞骨架微絲按細(xì)胞極性成束狀分布，質(zhì)膜邊緣上分布著豐富細(xì)長(zhǎng)纖毛和偽足（Fig 4紅色箭頭示），質(zhì)膜結(jié)構(gòu)完整，線條明顯和細(xì)胞骨架穩(wěn)固，綠色熒光強(qiáng)。隨著藥物濃度增高，纖毛偽足收縮或消失，細(xì)胞骨架微絲分布紊亂，部分微絲斷裂形成點(diǎn)狀分布于胞質(zhì)中（Fig 4白色箭頭示），質(zhì)膜邊緣凹凸不平。

Fig 2 Inhitive of invasive ability of SKOV3-PM4 cells by Rhein

2.5 Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路上各蛋白表達(dá)情況 從Western blot檢測(cè)的結(jié)果Fig 5（A1，A2）可見，隨著大黃酸的濃度升高，Rac1蛋白表達(dá)逐漸降低，位于其下游的PAK1、LIMK1和cofilin的總蛋白沒(méi)有明顯變化，但磷酸化的PAK1、LIMK1和cofilin表達(dá)逐漸降低，且在大黃酸與Rac1抑制劑的共同作用下，磷酸化蛋白表達(dá)比單獨(dú)使用大黃酸降低更明顯，結(jié)果見Fig 5（B1，B2）；而Rac1激活劑處理后的細(xì)胞，磷酸化的PAK1、LIMK1和cofilin蛋白表達(dá)明顯增高，Rac1激活劑聯(lián)合大黃酸使用與單用大黃酸相比，Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路中Rac1蛋白及相關(guān)磷酸化蛋白PAK1、LIMK1表達(dá)也升高，結(jié)果見Fig 5（C1，C2）。

Fig 3 Effect of Rhein on cell morphology of SKOV3-PM4 cells under scanning electron microscope（×2 000）

3 討論

Rac1也稱Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1，大小約為21 ku，是Ras超家族中小分子量G蛋白的成員之一，不僅參與腫瘤新生血管形成、細(xì)胞的分化與凋亡和腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)與遷移，而且它的激活或者抑制狀態(tài)，可調(diào)控下游LIM激酶、肌球蛋白輕鏈以及肌球蛋白輕鏈磷酸酶等，從而調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，影響腫瘤細(xì)胞骨架重排和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲。多項(xiàng)研究表明LIMK1、PAK1、cofilin蛋白分子在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且Rho/Rock/LIMK1/cofi-lin通路上Rac1、LIMK1、PAK1、cofilin能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［6-9］。LIMK1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要參與癌細(xì)胞中微管的拆卸和侵襲轉(zhuǎn)移，可被Rac1通過(guò)PAK1激活，其磷酸化狀態(tài)對(duì)co-filin蛋白的活性具有不同的調(diào)控作用，充當(dāng)細(xì)胞功能改變的“開關(guān)”。Cofilin是低分子肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，能維持細(xì)胞形態(tài)及極性，促進(jìn)胞質(zhì)分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與游走，參與血管新生和腫瘤的轉(zhuǎn)移功能［10］。Cofilin能通過(guò)自身磷酸化位點(diǎn)Ser3的磷酸化和Rho家族小G蛋白R(shí)ac下游的效應(yīng)分子PAK1和PAK4分別對(duì)LIMK1第508位和LIMK2第505位蘇氨酸片段的磷酸化［11］而發(fā)揮作用。活化的cofilin是通過(guò)肌動(dòng)蛋白（actin）骨架的解聚和聚合，使多聚體纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）轉(zhuǎn)化為單體的球狀肌動(dòng)蛋白（G-actin），影響細(xì)胞片狀偽足形成而影響細(xì)胞遷移。當(dāng)位于上游的Rac1受到抑制時(shí)，LIMK1和PAK1磷酸化cofilin氨基端Ser3，磷酸化的cofilin活性喪失，F(xiàn)-actin解聚成G-actin能力減弱，從而改變細(xì)胞形態(tài)和抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)?？梢奵ofilin調(diào)控ac-tin骨架的重塑，在腫瘤細(xì)胞的遷移中起到了中樞的作用，Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞遷移、運(yùn)動(dòng)和侵襲作用的重要途徑。

本課題組前期通過(guò)建立裸鼠體內(nèi)荷人卵巢癌SKOV3細(xì)胞并在其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中克隆出亞細(xì)胞系，篩選出具有淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移潛能的亞克隆第四代SKOV3-PM4細(xì)胞，利用該細(xì)胞模型，我們發(fā)現(xiàn)大黃酸處理卵巢癌SKOV3-PM4細(xì)胞后，細(xì)胞的纖毛和偽足減少，質(zhì)膜突起和膜皺褶減少，胞質(zhì)局部微絲出現(xiàn)溶解或斷裂現(xiàn)象，出現(xiàn)斷裂點(diǎn)的點(diǎn)狀分布等細(xì)胞形態(tài)和骨架的超微結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞的遷移和侵襲能力也隨之受到抑制。同時(shí)大黃酸處理后的卵巢癌細(xì)胞Rac1蛋白表達(dá)下降，引起其下游LIMK1、PAK1和cofilin蛋白的磷酸化表達(dá)水平下調(diào)的連鎖反應(yīng)，尤其cofilin的磷酸化表達(dá)水平明顯下降，可能是細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng)能力降低的主要原因。為了明確大黃酸的抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用靶點(diǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)大黃酸聯(lián)合Rac1抑制劑，比單用大黃酸更能引起LIMK1、PAK1和cofilin蛋白的磷酸化表達(dá)水平明顯下調(diào)。而Rac1激活劑聯(lián)合大黃酸使用，Rac1和磷酸化LIMK1、PAK1、cofilin蛋白表達(dá)明顯低于單用Rac1激活劑組和空白組，單獨(dú)大黃酸處理的細(xì)胞其磷酸化LIMK1和PAK1蛋白表達(dá)低于Rac1激活劑和大黃酸的聯(lián)合組，初步證實(shí)大黃酸可作為潛在的Rac1分子抑制劑，參與調(diào)控Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路，通過(guò)降低Rac1/LIMK1/co-filin通路相關(guān)蛋白磷酸化水平，引起cofilin蛋白的活性降低，影響肌動(dòng)蛋白（actin）骨架的解聚和聚合，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的降低，推測(cè)Rac1蛋白可能是調(diào)控卵巢癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力的重要靶點(diǎn)。此外在實(shí)驗(yàn)中還觀察到，大黃酸作用卵巢癌細(xì)胞后，Rac1/LIMK1/cofilin信號(hào)通路上，LIMK1、PAK1、cofilin磷酸化的蛋白表達(dá)與總蛋白表達(dá)水平相差較大，這從另一個(gè)角度說(shuō)明蛋白調(diào)控呈多層次、多時(shí)空、多類型的特點(diǎn)。Rac1激活劑聯(lián)合大黃酸與單用大黃酸比較，磷酸化cofilin的表達(dá)差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是大黃酸在對(duì)抗Rac1激活劑時(shí)，還存在其他的信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制。

Fig 4 Effect of Rhein on cytoskeleton of SKOV3-PM4 cells（×600）

大黃酸是從大黃、何首烏、虎杖等多種傳統(tǒng)中藥分離純化的有效成分，屬于蒽醌類化合物，具有抗腫瘤、抗炎和瀉下等藥理作用［12］。有文獻(xiàn)報(bào)道，大黃酸能誘導(dǎo)舌癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖［13－14］，能在乏氧條件下可抑制腫瘤細(xì)胞新生血管生成［15－16］，Huang等［17］證實(shí)在乳腺癌細(xì)胞中大黃酸能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，并涉及細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)折疊、糖酵解途徑和轉(zhuǎn)錄控制的失調(diào)等過(guò)程［17］。大黃酸還可通過(guò)TLR4/NF-κB通路減少脂多糖誘導(dǎo)腸道損傷，降低白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α的表達(dá)［18］。而本研究結(jié)果證實(shí)，大黃酸能抑制卵巢癌細(xì)胞Rac1蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的遷移與侵襲，靶向調(diào)控Rac1/LIMK1/cofilin通路上相關(guān)蛋白磷酸化的表達(dá)水平，大黃酸可能是潛在的Rac1蛋白的小分子抑制劑。

（致謝：本文實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，特此致謝。）

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Rhein inhibits the movement and invasion of human ovarian carcinoma cells through Rac1/LIMK1/cofilin signaling pathway

TANG Min，LI Hong，ZHOU Guo-mei，XIE Yi-hong，RUAN He-yun，LI Dan-rong
（Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

Aim To investigate the effect of Rhein on the movement and invasiveness of human ovarian carci-noma cells with directional high lymphatic metastasis SKOV3-PM4 cells and explore the role of Rac1/LIMK1/cofilin signaling pathway.Methods Migration assay and invasion assay were used to observe the effect of Rhein on the metastatic and invasive ability of SK-OV3-PM4 cells in vitro.The effect of Rhein on the morphology and cytoskeleton ultrastructure of ovarian cancer cells was observed by laser scanning confocal microscope and scanning electron microscope.The protein expression level of Rac1，LIMK1，PAK1 and co-filin were detected by Western blot，respectively.Re-sults Rhein inhibited the abilities of cell invasion and migration of SKOV3-PM4 cells，and the inhibitory rate increased along with the increase of the concentration and treatment duration.After treated with 8.80 μmol· L－1，17.60 μmol·L－1，26.40 μmol·L－1of Rhein for 24 h，the abilities of migration and invasion of SK-OV3-PM4 cells were inhibited（P＜0.05）；the mor-phology and cytoskeleton ultrastructure of SKOV3-PM4 cells were changed，cellular pseudopod reduced，cell microfilament fractured and its distribution disordered，plasma membrane was uneven and cell gap widened.After treatment of Rhein and Rac1 inhibitor，Rac1 protein expression and the expression of P-LIMK1，P-PAK1 and P-cofilin notably decreased in a dose-de-pendent manner compared with the control group（P＜0.05）.After Rhein and Rhein plus Rac1 inhibitor treatment，P-LIMK1，P-cofilin，P-PAK1 protein levels of SKOV3-PM4 cells significantly decreased compared with the control group，and the group of Rac1 inhibi-tor plus Rhein treatment，the phosphorylated protein decreased more significantly（P＜0.05）.After Rac1 activator plus Rhein treatment，phosphorylated protein expression of P-LIMK1，P-PAK1 and P-cofilin upregu-lated significantly（P＜0.05）.Conclusions Rhein may be a potential inhibitor of Rac1 and can inhibit the migrating and invasive capabilities of directional high lymphatic metastasis SKOV3-PM4 cells through down-regulating the phosphorylation of Rac1/LIMK1/cofilin pathway associated protein.

ovarian neoplasms；Rhein；Rac1/LIMK1/cofilin signaling pathway；cytoskeleton；mi-gration and invasion；Rac1 inhibitor；Rac1 activator

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.028.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.014

A

1001－1978（2016）03－0366－07

R284.1；R329.24；R73-37；R737.310.22

2015－11－04，

2015－12－21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81360502）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 2014GXNSFAA118161）；區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（No GKE2015-ZZ17）

唐 敏（1989－），女，碩士生，研究方向：抗腫瘤藥物，E-mail：361669785＠qq.com；黎丹戎（1963－），女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：抗腫瘤藥物，通訊作者，Tel：0771-5358131，E-mail：dan-rongli＠163.com