竹節(jié)參齊墩果烷皂苷對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞SIRT1活性影響及抗炎作用研究

袁 琴，袁 丁，2，周志勇，劉朝奇，王 婷，向婷婷，張長(zhǎng)城

［1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥（腫瘤）管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443002；2.仁和醫(yī)院，三峽大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌 443001］

竹節(jié)參齊墩果烷皂苷對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞SIRT1活性影響及抗炎作用研究

袁 琴1，袁 丁1，2，周志勇1，劉朝奇1，王 婷1，向婷婷1，張長(zhǎng)城1

［1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥（腫瘤）管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443002；2.仁和醫(yī)院，三峽大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌 443001］

目的 探討竹節(jié)參齊墩果烷皂苷（chikusetsu oleanane saponin，COS）對(duì)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞的SIRT1活性影響及抗炎作用。方法Griess法測(cè)定一氧化氮（NO）釋放量；免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素1β （IL-1β）蛋白表達(dá)；免疫熒光分析COS對(duì)細(xì)胞核因子-κB（NF-κB）和沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）核轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。結(jié)果 COS在25～300 mg·L－1與1 mg·L－1LPS共培養(yǎng)時(shí)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響；與LPS組相比，COS能有效抑制NO釋放和抑制TNF-α、IL-1β的分泌；還能抑制NF-κB的核移位，上調(diào)SIRT1的表達(dá)。結(jié)論 COS對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞炎癥具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能是COS上調(diào)SIRT1表達(dá)，促進(jìn)NF-κB去乙?；饔?，從而抑制NF-κB的核移位，減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生。

竹節(jié)參齊墩果烷皂苷；RAW264.7細(xì)胞；脂多糖；一氧化氮；TNF-α；IL-1β；NF-κB；SIRT1

竹節(jié)參為五加科植物竹節(jié)參Panax japonicus.C.A.Mey.的根狀莖及肉質(zhì)塊根，是我國(guó)名貴中草藥，具有補(bǔ)虛強(qiáng)壯、活血祛瘀、止血祛痰等功效。竹節(jié)參的主要有效成分為竹節(jié)參皂苷，竹節(jié)參皂苷提取物主要以竹節(jié)參齊墩果烷皂苷（chikusetsu olean-ane saponin，COS）為主，尚有少量達(dá)瑪烷型皂苷。藥理研究顯示，竹節(jié)參總皂苷具有抗炎等多種藥理作用［1－3］，但是COS及其抗炎機(jī)制的研究報(bào)道甚少。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，擬建立LPS致RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，探討COS對(duì)RAW264.7細(xì)胞的SIRT1活性影響及其抗炎作用，為竹節(jié)參的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 竹節(jié)參采購(gòu)于湖北省恩施椿木營(yíng)竹節(jié)參種植基地，經(jīng)三峽大學(xué)湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄒坤教授鑒定為五加科人參屬植物Panax japonicus C.A.Mey。D101大孔吸附樹脂（上海勤實(shí)科技有限公司）；人參皂苷Re（純度＞98％，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司）；小鼠RAW264.7細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（Scien Cell公司）；脂多糖（LPS，Sigma公司）；一氧化氮（NO）試劑盒（碧云天生物公司）；蛋白預(yù)染marker、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；化學(xué)發(fā)光劑ECL（碧云天生物技術(shù)研究所）；Triton X-100（Solarbio公司）；DAPI（武漢科瑞生物技術(shù)）；NF-κB p65抗體（美國(guó)Cell Signaling公司）；β-actin、TNF-α、IL-1β抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；SIRT1抗體（美國(guó)Millipore公司）；PE標(biāo)記山羊抗小鼠、FITC標(biāo)記山羊抗兔（美國(guó)Santa Cruz公司）。

1.2 主要儀器 NU-4750E型二氧化碳培養(yǎng)箱（Nu Aire公司），CKX41倒置顯微鏡（日本，Olympus公司），NIKON TP1020倒置熒光顯微鏡（上海衡橋儀器有限公司），CT15RT高速冷凍離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司），Thermo全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（芬蘭，Tecan Inpinifetm 200）。

2 方法

2.1 COS制備 將1 kg竹節(jié)參藥材粉碎，加入10倍量體積分?jǐn)?shù)為0.65的乙醇浸泡2 h，加熱回流提取3次，每次2 h，合并、減壓回收、濃縮得竹節(jié)參醇提物；水溶提取物，用正丁醇萃取直到正丁醇層幾乎無色為止，分離、合并、減壓回收、濃縮得到正丁醇萃取物，將萃取物上樣到D101大孔吸附樹脂上，用體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，將所得到的洗脫物減壓濃縮干燥，即得COS，得率為16.8％。精確稱取干燥的COS粉末和人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 g，置于容量瓶中，精密加入甲醇8 mL，超聲溶解，再加入甲醇定容至10 mL，搖勻過濾，加入到HPLC分析瓶中，記錄COS的HPLC。應(yīng)用HPLC進(jìn)行指紋圖譜分析，并且應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行成分鑒定。實(shí)驗(yàn)前用DMSO溶解配成400 g·L－1的母液，再用培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度。

2.2 COS的HPLC分析 色譜條件：色譜柱為YMC-pack ODS-AQ柱（250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.4％磷酸水溶液（B）；柱溫30℃；洗脫方式為梯度洗脫（0～5 min，5％～5％ A；5～20 min，5％～30％A；20～30 min，30％～30％A；30～50 min，30％～85％A；50～60 min，85％～85％A）；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL·min－1。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.4 COS對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響RAW264.7細(xì)胞懸液以5×104/孔接種于96孔板，每孔100 μL，貼壁4 h后，設(shè)置正常對(duì)照組（細(xì)胞＋培養(yǎng)基）、模型LPS組（細(xì)胞＋LPS）、陰性對(duì)照組（細(xì)胞＋DMSO）、實(shí)驗(yàn)組（細(xì)胞＋COS），每組4個(gè)復(fù)孔。COS給藥質(zhì)量濃度為25、50、100、150、200、300、400 mg·L－1，20 h后吸取上清液，在每孔中加入終濃度為0.5 g·L－1MTT（5 g·L－1，PBS配制）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速震蕩10 min，在570 nm處測(cè)量各孔的吸光度。

2.5 不同濃度COS對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞懸液按2× 105/孔接種于96孔板中，每孔50 μL，貼壁4 h后，加入25 μL不同濃度的COS（正常對(duì)照組或LPS模型組加入25 μL培養(yǎng)基）孵育2 h，給藥質(zhì)量濃度為50、100、150、200、300 mg·L－1，每組4個(gè)復(fù)孔，再加入25 μL終濃度為1 mg·L－1的LPS刺激（正常對(duì)照組加入25 μL培養(yǎng)基）20 h，Griess法測(cè)定上清液中NO含量。

2.6 Western blot法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β表達(dá) RAW264.7細(xì)胞懸液按1×106/孔接種于6孔板，每孔1 mL，4 h貼壁后，先加入100、200、300 mg·L－1的COS 500 μL（正常對(duì)照組或LPS模型組加入500 μL培養(yǎng)基）孵育2 h，再加入1 mg ·L－1LPS 500 μL刺激（正常對(duì)照組加入500 μL培養(yǎng)基）20 h后，提細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白濃度，95℃滅活蛋白5 min，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5％脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯色。

2.7 SIRT1、NF-κB的免疫熒光分析 取對(duì)數(shù)期RAW264.7細(xì)胞懸液（調(diào)細(xì)胞密度為1×106/孔）每孔1 mL接種于6孔板內(nèi)無菌蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁50％即可給予300 mg·L－1的COS 500 μL干預(yù)（正常對(duì)照組或LPS模型組加入500 μL培養(yǎng)基），孵育2 h后加入1 mg·L－1LPS 500 μL刺激（正常對(duì)照組加入500 μL培養(yǎng)基）12 h后，棄去培養(yǎng)基，在6孔板中將已經(jīng)爬好細(xì)胞的爬片用PBS浸洗3次，每次5 min；4％多聚甲醛固定爬片20 min，PBS浸洗3次，每次5 min；1％Triton X-100（PBS配制）37℃通透30 min，PBS浸洗3次，每次5 min；滴加5％山羊血清37℃封閉1 h，棄掉封閉液，直接加入一抗（1 ∶100，PBS稀釋）4℃過夜；24 h后PBS浸洗3次，每次5 min，再加入熒光二抗（1∶200，PBS稀釋）37℃避光孵育1 h，PBS浸洗3次，每次5 min；滴加DAPI避光孵育5 min，PBS浸洗3次，每次5 min，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5軟件，Western blot結(jié)果采用Image J軟件分析，計(jì)量資料采用±s表示，全部數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以單因素方差分析進(jìn)行多組比較。

3 結(jié)果

3.1 HPLC圖譜結(jié)果 將竹節(jié)參皂苷提取物再經(jīng)過大孔樹脂進(jìn)一步分離，并進(jìn)行HPLC圖譜分析。竹節(jié)參提取物主要含5個(gè)皂苷成分，即人參皂苷Re、竹節(jié)參皂苷Ⅴ、竹節(jié)參皂苷Ⅱ、竹節(jié)參皂苷Ⅳ和竹節(jié)參皂苷Ⅳa［4］。Fig 1中達(dá)瑪烷型人參皂苷Re已經(jīng)幾乎沒有，而其它4種齊墩果烷型皂苷含量較高，未見多糖吸收峰。因此得出，體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇洗脫大孔樹脂所得的皂苷是COS，即竹節(jié)參皂苷Ⅴ、竹節(jié)參皂苷Ⅱ、竹節(jié)參皂苷Ⅳ和竹節(jié)參皂苷Ⅳa。

Fig 1 90％ethanol elution of Panax japonicus saponins by HPLC analysis

3.2 COS對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 當(dāng)COS在25～300 mg·L－1與1 mg·L－1LPS共培養(yǎng)時(shí)，與正常對(duì)照組相比，對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響；400 mg·L－1時(shí)，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，即細(xì)胞活力明顯下降至53.2％，見Fig 2。

Fig 2 Effect of COS on viability of RAW264.7 cells

3.3 COS對(duì)NO釋放量的影響 如Fig 3所示，與正常對(duì)照組相比，1 mg·L－1LPS刺激24 h后，RAW264.7細(xì)胞釋放NO的量明顯增加，表明LPS能明顯誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO；與LPS組相比，COS能較好地抑制NO釋放，并呈良好的劑量依賴性。

Fig 3 Effect of NO release after intervention of COS in RAW264.7 cells stimulated by LPS

3.4 COS對(duì)TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響 與正常組相比，LPS組的TNF-α表達(dá)升高，IL-1β表達(dá)明顯升高（P＜0.01），而在COS組分存在時(shí)，TNF-α和IL-1β的表達(dá)則受到明顯抑制，并表現(xiàn)一定的劑量依賴性關(guān)系，見Fig 4。

3.5 COS對(duì)NF-κB活性的影響 如Fig 5所示，DAPI將細(xì)胞核染成藍(lán)色，染成紅色的為NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞，及將圖片疊加的結(jié)果。對(duì)于NF-κB來說，正常對(duì)照組中幾乎所有細(xì)胞中NF-κB主要集中在胞質(zhì)部位，使胞質(zhì)染色較深，反映NF-κB為無活性狀態(tài)；LPS組NF-κB陽(yáng)性主要集中在胞核部位，反映NF-κB為活化狀態(tài)；COS組NF-κB活化細(xì)胞明顯少于LPS組。

Fig 4 Effect of TNF-α and IL-1β expression after intervention of COS in RAW264.7 cells stimulated by LPS

Fig 5 Effect of COS on NF-κB p65 translocation in RAW264.7 cells observed under LSCM

Fig 6 Effect of COS on SIRT1 translocation in RAW264.7 cells observed under LSCM

3.6 COS對(duì)SIRT1活性的影響 如Fig 6所示，染成藍(lán)色的是細(xì)胞核，染成綠色的為SIRT1，第3列圖片均為前兩張重合的結(jié)果。和正常對(duì)照組相比，LPS組中SIRT1的表達(dá)降低，COS處理后，SIRT1的表達(dá)增加。由此得出，LPS誘導(dǎo)可使細(xì)胞表達(dá)SIRT1蛋白降低，COS可以促進(jìn)SIRT1蛋白的表達(dá)。

4 討論

炎癥是機(jī)體對(duì)外界刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，是十分常見而又重要的基本病理過程，具有防御和損傷雙重效應(yīng)。巨噬細(xì)胞是主要的炎性細(xì)胞，LPS即革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁組成成分，是引發(fā)機(jī)體炎癥的重要物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到LPS刺激時(shí)活化TLR4受體，會(huì)釋放NO、IL-1β、TNF-α等重要的炎癥細(xì)胞因子［3，5－6］。TNF-α和IL-1β是由單核-巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種重要的前炎細(xì)胞因子，是早期炎癥的標(biāo)志物，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。NF-κB是一種介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB p65是NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。炎癥反應(yīng)各階段的很多分子都受NF-κB的調(diào)控。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制因子IκB形成復(fù)合體，使NF-κB以無活性的形式存在于胞質(zhì)中。當(dāng)受到刺激后，IκB激酶復(fù)合體（Iκ kinase，IKK）活化，使IκB磷酸化而酶解，從而能使NF-κB與IκB解離，游離的NF-κB迅速易位到細(xì)胞核，與DNA相關(guān)元件結(jié)合，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

SIRT1是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；福c細(xì)胞衰老、炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激和能量代謝調(diào)節(jié)等細(xì)胞多種功能活動(dòng)有關(guān)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的活性受SIRT1的調(diào)節(jié)，SIRT1可直接去乙?；疦F-κB的p65亞基第310位的賴氨酸殘基，RelA/p65亞單位不能與IκBα結(jié)合，從而使NF-κB進(jìn)入核內(nèi)，誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)。進(jìn)而抑制NF-κB的活性，從而抑制下游基因的表達(dá)［7］。

研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果烷型皂苷經(jīng)水解后可產(chǎn)生齊墩果酸，齊墩果酸具有抗炎、抗氧化［8-9］等多種生物活性。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)竹節(jié)參回流提取、正丁醇萃取所得竹節(jié)參總皂苷提取物進(jìn)行進(jìn)一步分段（體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇洗脫物），應(yīng)用HPLC對(duì)其進(jìn)行指紋圖譜分析，并且應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行成分鑒定，發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇洗脫物主要成分為COS。有研究報(bào)道，齊墩果烷皂苷具有抗炎活性［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞SIRT1表達(dá)減少，使入核的NF-κB蛋白增加。COS可以促進(jìn)SIRT1蛋白的表達(dá)，抑制NF-κB的核移位，從而減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，COS可以激活SIRT1，對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是SIRT1通過去乙?；饔糜贜F-κB的p65亞基第310位的賴氨酸殘基，抑制NF-κB的核移位，進(jìn)而減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生。由此我們相信SIRT1可作為抗炎治療的靶點(diǎn)。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)完成于三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室。感謝醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心和腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)本課題提供的支持與幫助，感謝本課題組全體老師和同學(xué)對(duì)我實(shí)驗(yàn)的幫助。）

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Anti-inflammatory effect of Chikusetsu oleanane saponin on RAW264.7 cell through regulating SIRT1 activity

YUAN Qin1，YUAN Ding1，2，ZHOU Zhi-yong1，LIU Chao-qi1，WANG Ting1，XIANG Ting-ting1，ZHANG Chang-cheng1
（1.Third-grade Pharmacological Laboratory on Traditional Chinese Medicine Approved by Stste Adiministration of Traditional Chinese Medicine，College of Medical Science，China Three Gorges University，Yichang Hubei 443002，China；2.Renhe Hospital，the Second College of Clinical Medical Science，China Three Gorges University，Yichang Hubei 443001，China）

Aim To investigate SIRT1 activity and an-ti-inflammatory effects of Chikusetsu oleanane saponin （COS）on the RAW264.7 macrophage cells induced by lipopolysaccharide（LPS）.Methods The nitric oxide（NO）release was detected with Griess method.Western blot was used to detect the expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin 1β（IL-1β）.Nuclear factor-κB（NF-κB）and silent information ad-justment factor 1（SIRT1）were tested by immunofluo-rescence.Results 1 mg·L－1LPS co-cultured with COS at 25～300 mg·L－1had no significant effect on the growth of RAW264.7 cells.Compared with the LPS group，COS effectively inhibited the NO release and suppressed the expression of TNF-α and IL-1β，and also inhibited the translocation of NF-κB and up-regulation of SIRT1.Conclusion COS has protective effects on RAW264.7 cells stimulated by LPS，which may be related to up-regulating the expression of SIRT1 and promoting the deacetylation of NF-κB，thereby in-hibiting the translocation of NF-κB and reducing the expression of TNF-α and IL-1β.

COS；RAW264.7 cells；LPS；NO；TNF-α；IL-1β；NF-κB；SIRT1

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.022.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.011

A

1001－1978（2016）03－0349－06

R284.1；R329.24；R364.5；R392.12

2015－10－22，

2015－11－30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81273895）；湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No 2013CFA014）

袁 琴（1991－），女，碩士生，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail：780210109＠qq.com；張長(zhǎng)城（1973－），男，博士，教授，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：greatwall＠ctgu.edu.cn