馬錢苷對糖基化終末產(chǎn)物誘導足細胞損傷的保護作用

吳云皓，陳玉萍，呂 興，周芷若，沈紅勝，戴國英，許惠琴

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210023）

馬錢苷對糖基化終末產(chǎn)物誘導足細胞損傷的保護作用

吳云皓1，2，陳玉萍1，2，呂 興1，2，周芷若1，沈紅勝1，2，戴國英1，2，許惠琴1，2

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210023）

目的 探討山茱萸環(huán)烯醚萜苷特征性成分馬錢苷對糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）誘導腎臟足細胞損傷的保護作用及其機制。方法 體外培養(yǎng)小鼠腎小球足細胞，分為空白對照組、模型組（AGEs組）、馬錢苷組，并設氨基胍組作為陽性對照。MTT法檢測馬錢苷對足細胞存活率的影響；Hoechst 33342/PI雙染觀察足細胞凋亡情況，流式細胞儀檢測細胞凋亡率；Western blot法檢測足細胞AGEs受體（RAGE）、足細胞損傷標志蛋白desmin以及凋亡相關蛋白bax、bcl-2、cleaved caspase-3的表達。結果 馬錢苷能夠抑制AGEs導致的足細胞損傷，下調(diào)足細胞Desmin、RAGE蛋白的表達，明顯降低AGEs誘導的足細胞凋亡率，降低足細胞Bax/Bcl-2的比值和促凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達。結論 馬錢苷能夠改善AGEs誘導的腎小球足細胞損傷，其作用機制與降低RAGE蛋白表達，抑制凋亡通路有關。

山茱萸；馬錢苷；糖基化終末產(chǎn)物；足細胞；糖尿病腎病；凋亡

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥之一，也是引起終末期腎病的首要原因［1］，其特征主要表現(xiàn)為炎癥、系膜基質(zhì)累積、腎小管間質(zhì)纖維化以及血管透明變性［2］。大量研究表明，糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）在DN的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用［3－4］。腎臟中AGEs的累積能夠通過不同的途徑導致腎臟結構漸進性改變以及腎功能衰退［5］。足細胞是位于腎小球基底膜（GBM）外層的終末分化細胞，在維持腎小球濾過屏障的結構和功能上扮演著重要的角色。DN中足細胞受損并且數(shù)量減少，伴隨著腎小球超濾、白蛋白排泄率增加以及GBM增厚，最終導致腎小球硬化［6］。

山茱萸環(huán)烯醚萜苷類成分具有抑制糖尿病大鼠腎皮質(zhì)AGEs的形成，下調(diào)其受體mRNA的表達，降低DN小鼠尿微量白蛋白，減輕腎臟病理學改變的作用［7－8］，并且能夠對抗AGEs對腎小球系膜細胞的損傷作用［9］。馬錢苷為山茱萸環(huán)烯醚萜苷類主要效應成分，能夠降低糖尿病小鼠血糖、改善血脂以及抑制AGEs的生成并下調(diào)其受體的表達［10］。有研究表明AGEs作用于足細胞后能夠對其造成不同形式的損傷，且其受體RAGE被激活后能夠誘導足細胞凋亡［11－13］。因而本實驗采用體外AGEs刺激足細胞的方法，研究馬錢苷對AGEs誘導足細胞損傷的影響，并探討其作用機制，為馬錢苷的臨床應用提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小鼠腎小球足細胞，購自上海瑞鹿生物科技有限公司；馬錢苷，上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)為≥98％，批號：20100528。氨基胍，Sigma公司進口分裝。小鼠重組γ干擾素（IFN-γ），美國Protech公司；DMEM培養(yǎng)基、0.25％胰蛋白酶，美國Gibco公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青公司；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍（MTT），美國Sigma公司；Hoechst 33342/PI雙染試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；RIPA裂解液，碧云天生物技術研究所；RAGE抗體、Desmin抗體，Ab-cam公司；Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3抗體，Affinity公司。

1.2 實驗儀器 Synergy HT酶標儀，美國Bio-Tek公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；倒置熒光顯微鏡（Ti型），日本尼康公司；FACSCalibur流式細胞儀，美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 AGEs的制備 將50 g·L－1的牛血清白蛋白與0.5 mol·L－1葡萄糖溶于0.2 mol·L－1磷酸鹽緩沖液（PBS，pH＝7.4）中，37℃避光孵育3個月，使其形成AGEs-BSA。平行條件下配制不加入葡萄糖的上述BSA溶液，以制備無糖基化BSA（0-BSA）作為對照。待AGEs形成后，用孔徑為分子質(zhì)量1萬的透析袋低溫透析24 h，除去未反應的葡萄糖，然后用0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.3.2 細胞培養(yǎng) 未分化的小鼠腎小球足細胞用含10％胎牛血清和10 000 U·L－1的IFN-γ的DMEM低糖培養(yǎng)基在33℃、5％CO2培養(yǎng)箱中使其傳代增生，用不含IFN-γ的DMEM低糖培養(yǎng)基在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14 d使其分化成熟，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的分化成熟細胞，調(diào)整細胞密度至5×107·L－1接種于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。當細胞貼壁生長至80％～90％融合狀態(tài)時，換無FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)23 h，加入氨基胍、馬錢苷（終濃度分別為10、1、0.1 μmol·L－1）預孵1 h后，加入終濃度為100 mg· L－1的AGEs刺激，同時設模型組和空白對照組。24 h后每孔加入5 g·L－1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸棄孔中培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL的DMSO，震蕩混勻10 min，酶標儀測定490 nm處各孔的吸光度（A）值，計算細胞存活率。

1.3.4 Hoechst 33342/PI雙標法檢測細胞凋亡分組與加藥處理同“2.2”項，馬錢苷終濃度分別為0.1、1、10 μmol·L－1。足細胞培養(yǎng)24 h后，離心搜集各組細胞，將105～106個細胞懸浮于1 mL培養(yǎng)基中，再加入10 μL Hoechst 33342染液，混勻，37℃孵育15 min，離心棄去上清，加入1 mL工作液懸浮細胞，加入5 μL PI染液，室溫避光放置15 min后混勻，熒光顯微鏡下觀察（×200）細胞凋亡情況，流式細胞儀檢測細胞凋亡百分率。

1.3.5 Western blot檢測相關蛋白表達 取對數(shù)生長期細胞，以2×108·L－1接種于6孔板，分組與加藥處理同“2.2”項。處理24 h后離心收集細胞，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，并測定蛋白濃度。蛋白樣品加入1/4體積的4×蛋白上樣緩沖液，沸水煮沸5 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉印至PVDF膜上，用含按約0.1 mL·cm－2量加入封閉液封閉1 h，一抗4℃過夜。次日PBST漂洗3次，加入辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育2 h，ECL顯色。利用Image J軟件分析各組灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算各蛋白的變化。

1.3.6 統(tǒng)計學分析 實驗結果使用SPSS16.0進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較方差齊性采用t檢驗。

2 結果

2.1 對AGEs損傷足細胞存活率的影響 給予AGEs刺激24 h后，與空白組比較，模型組細胞存活率明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，氨基胍組在終濃度0.1、1、10 μmol·L－1時，馬錢苷在終濃度1、10 μmol·L－1時，對AGEs損傷足細胞具有明顯的保護作用（P＜0.05、0.01），且呈濃度相關性。見Fig 1。

Fig 1 Effect of loganin on cell viability of podocytes induced by AGEs（±s，n＝6）

2.2 對足細胞RAGE、Desmin蛋白表達的影響給予AGEs刺激24 h后，模型組RAGE、Desmin蛋白表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，氨基胍、馬錢苷各劑量組RAGE、Desmin蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.01）。見Fig 2和Fig 3。

Fig 2 Effect of loganin on expression of RAGE in podocytes（±s，n＝3）

Fig 3 Effect of loganin on expression of desmin in podocytes（±s，n＝3）

2.3 對AGEs誘導足細胞凋亡的影響 Hoechst 33342/PI熒光染色結果顯示空白對照組足細胞發(fā)出低藍/低紅色熒光，細胞形態(tài)無明顯改變；模型組足細胞大部分發(fā)出高藍/低紅色熒光，細胞膜通透性增強，呈細胞凋亡形態(tài)改變；氨基胍與馬錢苷組均可不同程度改善細胞狀態(tài)。見Fig 4。

Fig 4 Effect of loganin on apoptosis of podocytes induced by AGEs（Hoechst33342/PI staining）

流式細胞儀檢測結果顯示，AGEs能誘導細胞凋亡，與空白組比較差異具有顯著性（P＜0.01）；與模型組比較，氨基胍組與馬錢苷組能夠明顯降低細胞凋亡率（P＜0.01），改善細胞凋亡。見Tab 1。

Tab 1 Effect of loganin on apoptosis of podocytes induced by AGEs（±s，n＝3）

Tab 1 Effect of loganin on apoptosis of podocytes induced by AGEs（±s，n＝3）

＃＃P＜0.01 vs normal group；**P＜0.01 vs model group

Group Dose/μmol·L－1Apoptosis rate/％ Normal － 4.43±0.34 Model － 17.36±0.77＃＃Aminoguanidine 1 8.26±1.22**Loganin 0.1 13.62±0.58**1 6.42±0.75**10 10.71±0.57**

2.4 對足細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3表達的影響 與空白對照組相比，模型組Bax/Bcl-2比值增加（P＜0.05）；與模型組比較，馬錢苷1、10 μmol·L－1組Bax蛋白表達下調(diào)明顯（P ＜0.05、P＜0.01），但氨基胍組與馬錢苷0.1 μmol ·L－1組差異無顯著性，結果見Fig 5。空白對照組足細胞中cleaved caspase-3幾乎不表達，模型組cleaved caspase-3表達量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，氨基胍組與馬錢苷各劑量組均能明顯降低細胞中cleaved caspase-3的表達（P＜0.01），見Fig 6。

Fig 5 Effect of loganin on expression of Bax/Bcl-2 in podocytes（±s，n＝3）

3 討論

足細胞又稱為腎小球臟層上皮細胞，貼覆于GBM外側。足細胞間由足突相互交聯(lián)形成的裂孔隔膜（SD）相連，是蛋白質(zhì)丟失的最后屏障，也是腎小球中最容易受到損傷的細胞成分。研究發(fā)現(xiàn)，足細胞損傷是導致DN和腎小球硬化的決定性因素［14］。AGEs是非酶糖基化反應的終末產(chǎn)物，糖尿病條件下AGEs形成速率加快，糖基終末化產(chǎn)物受體（RAGE）與AGEs結合后活性增強，致使足細胞產(chǎn)生大量衰退的變化。所有的這些變化都會破壞腎小球濾過屏障，導致白蛋白滲透增加，進而加速DN的發(fā)生發(fā)展。

AGEs對腎臟具有直接毒性作用或通過其受體產(chǎn)生毒性作用，而山茱萸具有補益肝腎、澀精固脫的功效，其環(huán)烯醚萜苷類成分對糖尿病腎病及血管并發(fā)癥均有良好的保護作用［7］。馬錢苷為山茱萸環(huán)烯醚萜苷類主要效應成分，能夠改善DN小鼠三多一少癥狀，降低腎臟和血清AGEs水平，減少腎臟RAGE蛋白以及mRNA表達［15］。因此，本實驗通過AGEs直接刺激腎小球足細胞，進一步研究馬錢苷對AGEs損傷足細胞的保護作用，并探討其作用機制。研究結果表明，馬錢苷能夠減輕AGEs誘導的足細胞損傷，且隨著濃度的升高而增強。Desmin蛋白是一種骨架絲蛋白，可以作為反映足細胞損傷程度的標志性蛋白［16］。正常情況下足細胞無明顯表達，當足細胞受到損傷時可大量表達。實驗結果發(fā)現(xiàn)馬錢苷能夠不同程度降低足細胞Desmin表達，表明馬錢苷對足細胞損傷具有一定的保護作用。同時，研究發(fā)現(xiàn)馬錢苷能夠下調(diào)足細胞RAGE的蛋白表達，提示馬錢苷保護足細胞損傷可能與降低RAGE表達有關。

細胞凋亡是程序化、多基因調(diào)控的細胞死亡過程。Hoechst 33342/PI染色以及流式細胞檢測結果顯示AGEs能夠有效誘導足細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是在細胞凋亡過程中起關鍵性作用的一類蛋白質(zhì)，主要分為抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等以及促凋亡蛋白如Bax、Bak等［17］。而Caspase家族作為凋亡機制中重要的效應成分，參與多種與凋亡有關的生理和病理過程。Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”，是Caspase家族中的最重要的凋亡執(zhí)行因子之一，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志［18］。本實驗結果表明，馬錢苷能明顯降低反映細胞凋亡程度的Bax/Bcl-2比值以及caspase-3活性形式cleaved caspase-3的表達，提示馬錢苷能夠通過抑制凋亡通路，減少足細胞凋亡，進一步對足細胞產(chǎn)生保護作用。

綜上所述，馬錢苷對AGEs誘導的足細胞損傷具有保護作用，其機制可能與下調(diào)RAGE蛋白表達，抑制凋亡通路的活性相關，但其它作用機制還有待進一步深入研究。

（致謝：本實驗于江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室完成。感謝實驗室老師與全體同學的大力幫助，在此致謝?。?/p>

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Protective effect of loganin on podocyte injury induced by advanced glycation end products

WU Yun-hao1，2，CHEN Yu-ping1，2，LYU Xing1，2，ZHOU Zhi-ruo1，2，SHEN Hong-sheng1，2，DAI Guo-ying1，2，XU Hui-qin1，2
（1.College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica，Nanjing 210023，China）

Aim To explore the protective effect of lo-ganin（an active component in Cornus officinalis）on podocyte injury induced by advanced glycation end products（AGEs）and its possible mechanism.Meth-ods Mouse podocytes were cultured in vitro and di-vided into Normal group，model group（AGEs group），loganin group and aminoguanidine group（set as posi-tive control）.After being incubated with loganin（final concentrations are 0.1，1，10 μmol·L－1）for 1 h，podocytes were stimulated by AGEs of 100 mg·L－1for 24 h.Then，the cell viability was measured by u-sing MTT method.Podocytes apoptosis was evaluated by Hoechst33342/PI staining and flow cytometry.Re-ceptors of advanced glycation end products（RAGE），desmin and apoptosis-related protein like Bax，Bcl-2，cleaved caspase-3 in podocytes were detected by West-ern blot.Results Loganin ameliorated podocyte inju-ry induced by AGEs，down-regulated the expression of desmin and RAGE.Loganin also reduced the apoptotic rate of podocytes and decreased the ratio of Bax/Bcl-2 and the expression of pro-apoptotic protein cleaved caspase-3 in podocytes.Conclusion Loganin could ameliorate podocyte injury，and its mechanism may be related to the decrease of the expression of RAGE and inhibition of the apoptotic pathway.

Cornus officinalis Sieb.et Zucc.；loga-nin；advanced glycation end products；podocyte；dia-betic nephropathy；apoptosis

時間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.016.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.008

A

1001－1978（2016）03－0332－05

R-332；R284.1；R322.61；R329.25；R587.1；R977.6

2015－12－07，

2015－12－21

國家自然科學基金資助項目（No 81374029，81073111）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（No nzyzyxjp1006）

吳云皓（1991－），男，碩士，研究方向：內(nèi)分泌藥理學，E-mail：719807174＠qq.com許惠琴（1961－），女，博士，教授，博士生導師，研究方向：內(nèi)分泌藥理學，通訊作者，E-mail：hqxu309＠sina.com