鈉鉀ATP酶抑制劑通過調(diào)節(jié)DNA損傷感應(yīng)復(fù)合體Mre11/Rad50/Nbs1的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞周期阻滯

徐忠偉，王鳳梅，王聰聰，單娜娜，徐瑞成，3

（1.中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院，天津 300309；2.天津市第三中心醫(yī)院，天津 300170；3.天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300309）

鈉鉀ATP酶抑制劑通過調(diào)節(jié)DNA損傷感應(yīng)復(fù)合體Mre11/Rad50/Nbs1的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞周期阻滯

徐忠偉1，王鳳梅2，王聰聰1，單娜娜1，徐瑞成1，3

（1.中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院，天津 300309；2.天津市第三中心醫(yī)院，天津 300170；3.天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300309）

目的 研究鈉鉀ATP酶抑制劑華蟾毒配基（cinobufa-gin）對人肝癌HepG2細(xì)胞DNA損傷修復(fù)阻斷及其發(fā)生機(jī)制。方法 免疫組化分析人肝癌臨床組織標(biāo)本、正常肝組織中鈉鉀ATP酶α1亞單位的表達(dá)；以人肝癌細(xì)胞HepG2為靶細(xì)胞，實(shí)驗分為對照組、5 μmol·L－1華蟾毒配基作用6、12 和24 h組；單細(xì)胞電泳檢測DNA雙鏈斷裂，Real time-PCR 和Western blot檢測損傷修復(fù)基因Mre11、Rad50、Nbs1和p53的表達(dá)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。結(jié)果 肝癌組織鈉鉀ATP酶α1亞單位表達(dá)與癌旁組織相比明顯升高（P＜0.05）；華蟾毒配基誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞DNA斷裂的發(fā)生率與作用時間高度相關(guān)，作用時間延長斷裂效應(yīng)更加明顯（P＜0.05），Mre11，Nbs1，Rad50和p53表達(dá)隨藥物作用時間延長逐漸升高（P＜0.05），流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期對照組S期細(xì)胞比例為（21.32±4.21）％，5 μmol·L－1華蟾毒配基處理6 h后為（33.25±5.72）％，處理12 h后為（56.72± 6.29）％，作用24 h后為（67.32±9.42）％。結(jié)論 華蟾毒配基激活Mre11/Rad50/Nbs1損傷感應(yīng)復(fù)合體介導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞周期阻滯。

華蟾毒配基；HepG2細(xì)胞；DNA雙鏈斷裂；鈉鉀ATP酶；細(xì)胞周期；細(xì)胞周期相關(guān)蛋白

原發(fā)性肝癌（簡稱肝癌）是臨床中最常見的惡性腫瘤之一。蟾酥為寶貴的中藥之一，已被作為藥物使用近千年，《本草綱目》記載“蟾酥，療疳積，消臌脹，解疔毒之藥也”。而華蟾毒配基（cinobufagin）是中藥蟾酥的主要抗癌活性成分之一，目前是我國臨床治療中晚期肝癌的首選中藥制劑，藥物作用靶點(diǎn)為細(xì)胞膜表面鈉鉀ATP酶（Na＋，K＋-ATPase）［1］。研究證實(shí)非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌和乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中鈉鉀ATP酶呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展［2－3］。前期的研究顯示華蟾毒配基可下調(diào)肝癌細(xì)胞周期蛋白A（cyclin A）表達(dá)引發(fā)細(xì)胞周期S期阻滯現(xiàn)象［4－5］。然而蟾酥制劑在治療肝癌中的作用機(jī)制仍然不明確。因此，研究華蟾毒配基抑制肝癌細(xì)胞生長，探討其作用機(jī)制，意義重大。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肝癌細(xì)胞株HepG2購自協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫，華蟾毒配基為Sigma公司產(chǎn)品，無水乙醇溶解成母液，濃度為1 mmol·L－1，－20℃避光保存；H-DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清購自Gibco公司。TRIzol為Invitrogen公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、碘化丙啶（PI）和二甲基亞砜（DMSO）購自于Sigma公司；PrimeScriptTMRT逆轉(zhuǎn)錄試劑購自于TaKaRa公司；SYBR GreenⅠ染料為Roche公司產(chǎn)品，一抗兔抗人Mre11、Nbs1、Rad50和p53單克隆抗體購自Abcam公司，二抗和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自KPL公司。

1.2 免疫組化檢測肝癌組織與肝癌旁組織中鈉鉀ATP酶α1亞單位表達(dá) 90例肝癌與癌旁組織樣本，年齡（49.8±8.8），均為原發(fā)性肝癌腫瘤。常規(guī)處理，石蠟包埋切片，高壓蒸汽抗原修復(fù)，3％H2O2室溫孵育30 min；兔血清封閉10 min，Na＋，K＋-AT-Pase α1羊單克隆抗體，4℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色5 min，沖洗，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，每張切片隨機(jī)選取3個視野LeicaBM2500拍照，圖像數(shù)據(jù)由Im-age-Pro Plus 6.0軟件分析，測量陽性結(jié)果區(qū)域面積和積分光密度值，計算樣本的平均光密度值，分析肝癌與癌旁組織中Na＋，K＋-ATPase α1亞單位表達(dá)水平。

1.3 單細(xì)胞電泳檢測DNA雙鏈斷裂程度 實(shí)驗分組同前，第1層膠制作：取0.5％常溫熔點(diǎn)瓊脂糖溶液熔化后包被載玻片，冷卻充分凝固。第2層膠制作：100 μL 0.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液中混合500個細(xì)胞，均勻滴在第1層膠上，充分冷卻。玻片浸入預(yù)冷裂解液［10 mmol·L－1Tris-HCl（pH 7.5）2.5 mol·L－1NaC1，100 mmol·L－1四甲基乙二胺四乙酸二鈉，1％Triton X-100和10％二甲基亞砜］，4℃，2 h。置于水平電泳槽中，加入電泳液（1 mmol· L－1四甲基乙二胺，300 mmol·L－1氫氧化鈉），靜置20 min，25 V電泳30 min。25 g·L－1碘化丙啶（PI）75 μL染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。采用CASP1.2軟件分別計算彗星頭部和尾部積分面積（Head Area和Tail Area）與熒光強(qiáng)度（Head DNA and Tail DNA Amount），計算各自熒光密度值，同時檢測彗星尾部遷移長度（Tail Moment）。通過分析彗星頭部光密度值和彗星尾部長度與熒光密度值評估DNA損傷。

1.4 RNA提取和Real time-PCR檢測Mre11、Nbs1、Rad50和p53 mRNA表達(dá) 實(shí)驗分組同前，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按PrimeScriptTMRT試劑反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系為20 μL（上、下游引物各1 μL，模板1 μL，SYBR green試劑4 μL，ddH2O 12 μL）。引物序列見Tab 1，反應(yīng)條件：95℃變性10 min：95℃變性5 s，65℃退火15 s，72℃延伸15 s，共40個循環(huán)。通過相對定量法（2－△△Ct）分析實(shí)驗組目的基因表達(dá)豐度。

Tab 1 Sequences of PCR primers

1.5 Western blot法檢測Mre11、Nbs1、Rad50和p53蛋白表達(dá) 實(shí)驗分組同前，蛋白印跡實(shí)驗參考以前方法［6］，每組60 μg蛋白通過10％SDS-PAGE分離，Bio-rad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜，經(jīng)抗體孵育，經(jīng)ECL液化學(xué)發(fā)光，暗室X線曝光、顯影、定影。Bandscan 5.0軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 接種1×105個HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后加藥，實(shí)驗分組同前，藥物作用6、12和24 h后，收集細(xì)胞，75％冷乙醇固定，PBS洗1次，加入終濃度為50 mg·L－1RNA酶和5 g·L－1碘化乙啶（PI）溶液，孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。

2 結(jié)果

2.1 人肝癌組織與正常肝組織鈉鉀ATP酶α1亞單位的差異化表達(dá) 通過IPP6.0軟件分析肝癌與癌旁組織中鈉鉀ATP酶α1亞單位表達(dá)的平均光密度。Fig 1顯示，肝癌組織鈉鉀ATP酶α1亞單位密度值為184.74±17.22，癌旁組織為67.21± 8.41，肝癌組織中鈉鉀ATP酶α1亞單位與正常肝臟癌旁組織相比呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Fig 1 Expression level of Na＋，K＋-ATPase α1 subunit in normal liver tissues and hepatoma tissue by｜Immunohistochemistry（×400）

2.2 華蟾毒配基誘發(fā)HepG2細(xì)胞DNA雙鏈斷裂5 μmol·L－1華蟾毒配基可引起HepG2細(xì)胞DNA損傷（Fig 2）。藥物組細(xì)胞電泳后可見彗星狀拖尾，對照組呈現(xiàn)明亮的圓點(diǎn)無拖尾，經(jīng)CASP 1.2軟件分析測量對照組彗星頭部熒光強(qiáng)度為84.21± 9.76，尾部熒光強(qiáng)度4.87±0.58，彗星無拖尾遷移現(xiàn)象發(fā)生；藥物作用6、12和24h后，頭部熒光強(qiáng)度

分別為43.2±5.32、38.46±5.74、18.52±3.21，尾部熒光強(qiáng)度分別為23.2±3.12、31.46±4.64、38.52 ±6.21；彗星尾部長度依次為（26.21±2.47）、（28.42±3.14）、（31.22±5.31）μm，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。研究證實(shí)，5 μmol·L－1華蟾毒配基可誘發(fā)HepG2細(xì)胞DNA雙鏈斷裂。

2.3 華蟾毒配基對HepG2細(xì)胞DNA損傷感應(yīng)基因Mre11、Nbs1、Rad50和p53 mRNA表達(dá)的影響通過相對定量法（2－△△Ct）計算各實(shí)驗組HepG2細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)（Tab 2），5 μmol·L－1華蟾毒配基作用HepG2細(xì)胞6、12和24 h 3個檢測點(diǎn)中，Mre11基因水平分別是對照組的1.29、2.53和7.67倍；Nbs1基因水平分別是對照組的1.16、1.34和1.72倍；Rad50基因水平分別是對照組的1.49、2.97和3.71倍；p53基因水平分別是對照組1.37、3.58和5.94倍。結(jié)果顯示，5 μmol·L－1華蟾毒配基可明顯上調(diào)DNA損傷感應(yīng)相關(guān)基因Mre11、Rad50、Nbs1和p53 mRNA表達(dá)（P＜0.05）。

Fig 2 Levels of DNA double-strand breaks in HepG2 cells treated with 5 μmol·L－1 cinobufagin for different time by SCGE（×400）

Tab 2 Mre11，Nbs1，Rad50 and p53 detected in HepG2 treated with 5 μmol·L－1cinobufogenin by Real time PCR±s）

Tab 2 Mre11，Nbs1，Rad50 and p53 detected in HepG2 treated with 5 μmol·L－1cinobufogenin by Real time PCR±s）

*P＜0.05；**P＜0.01 vs control group

Relative amount（2－△△Ct）Gene Expose time/h 6 12 24 Mre11 0.37±0.21* 1.34±0.37* 2.94±0.34**Nbs1 0.22±0.12 0.42±0.14** 0.78±0.27**Rad50 0.58±0.23 1.57±0.31** 1.89±0.42**p53 0.45±0.32* 1.84±0.37** 2.57±0.49**

2.4 華蟾毒配基對HepG2細(xì)胞DNA損傷感應(yīng)基因Mre11、Nbs1、Rad50和p53蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示（Fig 3），與對照組細(xì)胞相比，5 μmol·L－1華蟾毒配基作用HepG2細(xì)胞后，可上調(diào)DNA損傷感應(yīng)基因Mre11、Nbs1、Rad50和p53蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），以作用24 h處理組差異更為明顯（P＜0.01）。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測HepG2細(xì)胞周期變化 Fig 4所示，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期對照組S期細(xì)胞比例為（21.32±4.21）％，5 μmol·L－1華蟾毒配基處理6 h后為（33.25±5.72）％，處理12 h后為（56.72±6.29）％，作用24 h后為（67.32± 9.42）％，結(jié)果顯示5 μmol·L－1華蟾毒配基引起HepG2細(xì)胞發(fā)生S期阻滯現(xiàn)象，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Fig 3 Mre11，Nbs1，Rad50 and p53 protein levels in HepG2 treated with 5 μmol·L－1cinobufagin for different time by Western blot

Fig 4 Effect of cell cycle on HepG2 cells treated with 5 μmol·L－1cinobufogenin for different time by flow cytometry

3 討論

蟾酥及相關(guān)制劑作為抗腫瘤中藥在我國廣泛用于肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和胃癌等惡性腫瘤的中晚期治療，療效顯著，蟾酥的主要抗癌有效成分為蟾毒配基類，如華蟾毒配基（cinobufagin）和蟾蜍靈（bufa-lin）等，屬于強(qiáng)心甾類固醇（cardiotonic steroids，CTS）。以華蟾素（混合制劑）為代表的藥物在市場中占有重要份額，國際上關(guān)于CTS抗癌作用研究取得重要進(jìn)展，比利時從非洲植物大牛角瓜中提取的CTS經(jīng)半合成得到的新型鈉鉀ATP酶抑制劑UN-BS1450，作為高活性抗癌藥進(jìn)入歐洲臨床，顯示了巨大潛力［7－9］。

研究顯示［1－3］，鈉鉀ATP酶α1亞單位在正常組織和腫瘤組織呈現(xiàn)出差異化表達(dá)，在人前列腺癌PC-3、DU-145細(xì)胞系，非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系，神經(jīng)膠質(zhì)瘤Hs683、U373-MG、U87-MG和T98G細(xì)胞系中鈉鉀ATP酶α1亞單位都呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，課題組研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中鈉鉀ATP酶α1亞單位亦呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，我們前期應(yīng)用哇巴因與華蟾毒配基作用肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2＋和氧自由基（reactive oxygen species，ROS）濃度增加，損傷細(xì)胞DNA，以Cyclin D1為代表的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白生成減少和細(xì)胞周期抑制因子p21CIP1引起細(xì)胞周期S期阻滯。華蟾毒配基可抑制鈉鉀ATP酶活性，繼發(fā)性引起細(xì)胞內(nèi)K＋濃度減少，同時伴隨Na＋濃度增加，從而使細(xì)胞膜Na＋-Ca2＋交換器啟動，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋持續(xù)性升高，破壞線粒體膜電位，氧自由基濃度升高。這些細(xì)胞內(nèi)離子物質(zhì)是損傷細(xì)胞DNA的主要物質(zhì)［10－12］。

由細(xì)胞DNA損傷轉(zhuǎn)變成細(xì)胞周期阻滯信號并引起周期阻滯過程，主要有DNA損傷的識別（感受損傷）和效應(yīng)蛋白分子變化（效應(yīng)器蛋白）兩個部分構(gòu)成［13－14］。本研究發(fā)現(xiàn)華蟾毒配基可引起肝癌細(xì)胞DNA分子雙鏈斷裂，損傷感受蛋白Mre11，Nbs1 和Rad50基因和細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子p53表達(dá)上調(diào)。而Mre11/Rad50/Nbs1（MRN）復(fù)合體能將檢測到的DNA損傷的情況傳遞給效應(yīng)器蛋白分子ATM激酶，其對DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，可將信息傳導(dǎo)到p53蛋白，p53激活，半衰期延長，促進(jìn)p21CIP1表達(dá)，p21CIP1與CyclinA/CDK2/PCNA激酶復(fù)合體結(jié)合，抑制其活性，產(chǎn)生細(xì)胞出現(xiàn)S期阻滯現(xiàn)象，爭取更多的修復(fù)時間，在修復(fù)無法完成時細(xì)胞走向最終的凋亡途徑。

綜上所述，以華蟾毒配基為代表的鈉鉀ATP酶抑制因子可能將成為一類新的抗肝癌候選藥物，通過破壞癌細(xì)胞離子平衡、能量供應(yīng)，損傷癌細(xì)胞DNA分子，引起細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

（致謝：本文實(shí)驗在武警后勤學(xué)院中心實(shí)驗室完成，徐瑞成主任為研究項目國家自然科學(xué)基金項目負(fù)責(zé)人，徐忠偉老師為主要實(shí)驗操作人員，王鳳梅主任負(fù)責(zé)肝癌與癌旁組織樣本實(shí)驗檢測，王聰聰老師完成實(shí)驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與論文審校工作。）

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Na＋，K＋-ATPase inhibitor induces cell cycle arrest in liver cancer HepG2 cells by regulating expression of DNA damage Mre11/Rad50/Nbs1 complex

XU Zhong-wei1，WANG Feng-mei2，WANG Cong-cong1，SHAN Na-na1，XU Rui-cheng1，3
（1.Logistics University of People’s Armed Police Force，Tianjin 300309，China；2.Dept of Gastroenterology and Hepatology，Tianjin Third Central Hospitaln，Tianjin 300170，China；3.Tianjin Key Laboratory for Biomarkers of Occupational and Environmental Hazard，Tianjin 300309，China）

Aim To explore the relationship between Mre11/Rad50/Nbs1（MRN）complex focus formation and DNA double-strand breaks（DSBs）caused by cinob-ufagin in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells.Methods The Na＋，K＋-ATPase α1 subunit expression level in liver cancer tissues was detected by immunohis-tochemistry.After HepG2 cells were treated with 5 μmol·L－1cinobufagin for 6，12 and 24 h，the drug-in-duced DSBs were assessed by single cell gel electro-phroesis（SCGE），the gene transcription and protein levels of Mrel1，Nbs1，Rad50 and p53 were evaluated by Real time-PCR and Western blot.The cell cycle in parallel was analyzed by flow cytometry.Results The Na＋，K＋-ATPase α1 subunit expression level in liver cancer tissues was significantly increased compared with the tissue adjacent to carcinoma（P＜0.05）.The 5 μmol·L－1cinobufagin could induce the DSBs in a time-dependent manner（P＜0.05），and it could up-regulate the gene expression levels of Mre11，Nbs1，Rad50 and p53 in HepG2 cells（P＜0.05）.The pro-portions of HepG2 cells in S phase were（21.32± 4.21）％in the control group，and（33.25±5.72）％，（56.72±6.29）％and（67.32±9.42）％in HepG2 cells treated with 5 μmol·L－1cinobufagin for 6，12 and 24 h，respectively.The proportions of cells in S phase in cinobufagin groups were significantly increased compared with the control group（P＜0.05）.Conclu-sion Cinobufagin could induce the cell cycle arrest in liver cancer HepG2 cells by activation of Mre11/Rad50/Nbs1 Complex.

cinobufagin；HepG2 cells；DNA double-strand breaks；Na＋，K＋-ATPase；cell cycle；cell cycle associated proteins

時間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.012.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.006

A

1001－1978（2016）03－0323－05

R284.1；R282.74；R329.28；R342.3；R735.7；R977.3；R979.1

2015－11－09，

2015－12－24

國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81273552）；武警后勤學(xué)院博士啟動金項目（No WHB201501）

徐忠偉（1980－），男，博士，講師，研究方向：中藥藥理學(xué)，Tel：022－84876424，E-mail：xzw113＠hotmail.com；徐瑞成（1968－），男，碩士，教授，研究方向：細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通訊作者，Tel：022-84876451，E-mail：xu＿rc＠sohu.com