腦轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型的制備方法及研究進(jìn)展

崔白蘋(píng)，陳 平，孫安陽(yáng)

（1.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院神經(jīng)退行性疾病與修復(fù)實(shí)驗(yàn)室；2.鹽城市第一人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇鹽城 224005）

腦轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型的制備方法及研究進(jìn)展

崔白蘋(píng)1，陳 平2，孫安陽(yáng)1

（1.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院神經(jīng)退行性疾病與修復(fù)實(shí)驗(yàn)室；2.鹽城市第一人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇鹽城 224005）

腦轉(zhuǎn)移瘤（brain metastasis）是指源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到腦組織的顱內(nèi)常見(jiàn)惡性腫瘤。目前腦轉(zhuǎn)移瘤造模有外周接種和直接腦內(nèi)接種瘤細(xì)胞兩大類(lèi)方法。外周接種方法包括造模動(dòng)物左心室或頸動(dòng)脈內(nèi)注射、原位接種等途徑；腦內(nèi)接種方法包括腫瘤細(xì)胞株直接接種于動(dòng)物特定腦區(qū)的簡(jiǎn)化方法和臨床腦轉(zhuǎn)移瘤活檢標(biāo)本直接接種于裸大鼠腦內(nèi)的新方法。該文綜述了腦轉(zhuǎn)移瘤模型的制備方法，包括可選用的接種動(dòng)物、瘤細(xì)胞系、接種方法和模型的檢測(cè)方法，并介紹這一領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展。

腦轉(zhuǎn)移；腫瘤；動(dòng)物模型；裸鼠；細(xì)胞接種；制備方法；檢測(cè)方法

腦轉(zhuǎn)移瘤是成年人最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，外周腫瘤腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為10％～40％，患者數(shù)量大約是原發(fā)性腦腫瘤的10倍。未治療的腦轉(zhuǎn)移瘤患者中位生存期1～2月，治療后延長(zhǎng)為4～6月［1］。腦轉(zhuǎn)移瘤的原發(fā)病灶以肺癌最多見(jiàn)，其次是乳腺癌、惡性黑色素瘤、消化道腫瘤和腎癌；以腫瘤發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的機(jī)率看，以黑色素瘤最易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移（50％左右），其次為小細(xì)胞性肺癌和乳腺癌。兒童腦轉(zhuǎn)移瘤的原發(fā)腫瘤則以白血病、淋巴瘤多見(jiàn)。臨床腦轉(zhuǎn)移瘤雖已嘗試多種治療方法如手術(shù)切除、全腦放療、立體定向放療和化療，但效果欠佳，尚缺乏有效的治療手段。因此，迫切需要建立理想的腦轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停约訌?qiáng)其分子機(jī)制與治療措施的研究。

1 腦轉(zhuǎn)移瘤的轉(zhuǎn)移途徑、部位與分子機(jī)制

腫瘤細(xì)胞向腦內(nèi)轉(zhuǎn)移的途徑主要是通過(guò)血液，其中最多是通過(guò)動(dòng)脈系統(tǒng)，通過(guò)靜脈或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移并不常見(jiàn)。腦室內(nèi)轉(zhuǎn)移見(jiàn)于脊髓腫瘤的上行性侵犯。大多數(shù)患者的腦轉(zhuǎn)移瘤為多發(fā)性，瘤細(xì)胞侵入附近的毛細(xì)血管網(wǎng)，由頸動(dòng)脈和椎動(dòng)脈系統(tǒng)到達(dá)腦內(nèi)形成多個(gè)大小不一的轉(zhuǎn)移灶，常位于大腦中動(dòng)脈分布區(qū)，即額葉和頂葉區(qū)。腦轉(zhuǎn)移瘤80％分布于大腦，15％小腦，5％腦干。另外，急性白血病可見(jiàn)軟腦膜和蛛網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移；兒童惡性淋巴瘤等可見(jiàn)硬腦膜轉(zhuǎn)移。與原發(fā)腦瘤不同，腦轉(zhuǎn)移瘤與周?chē)M織分界清楚。

腫瘤轉(zhuǎn)移經(jīng)歷兩個(gè)階段：①局部侵襲（invasion）、滲入血管（intravasation）與散播（dissemination）；②溢出血管（ex-travasation），進(jìn)入組織，在組織內(nèi)形成瘤細(xì)胞克?。╟oloniza-tion）。腦轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生、發(fā)展是瘤細(xì)胞與腦內(nèi)微環(huán)境（如基質(zhì)）相互作用的結(jié)果［2］，即“種子－土壤”學(xué)說(shuō)。以乳腺癌腦轉(zhuǎn)移為例，腫瘤細(xì)胞通過(guò)非開(kāi)窗型毛細(xì)血管溢入腦組織，其中環(huán)氧合酶COX2、表皮生長(zhǎng)因子受體配體HBEGF和α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6GALNAC5是瘤細(xì)胞通過(guò)血腦屏障的關(guān)鍵介導(dǎo)分子［3］。在上述一系列過(guò)程中起重要作用的分子尚有：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）高表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管新生；表皮生長(zhǎng)因子EGF促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1）［4］、組織蛋白酶cathepsin S［5］促進(jìn)腫瘤侵襲；黏附分子（E-cad-herin）參與腦轉(zhuǎn)移瘤形成的多個(gè)步驟。DNA雙鏈缺口修補(bǔ)基因BARD1、RAD51抵抗自由基毒性，促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移瘤克隆形成。

2 腦轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型的類(lèi)型

由于黑色素瘤自發(fā)性腦轉(zhuǎn)移在臨床較常見(jiàn)，在腦轉(zhuǎn)移瘤模型研制初期試圖從嚙齒類(lèi)動(dòng)物中尋覓黑色素瘤的自發(fā)性模型。發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16-F1來(lái)自于C57BL/6小鼠耳部，經(jīng)反復(fù)接種、篩選獲得的亞系B16-B10b 與B16-B10-n左心室接種有明顯的腦轉(zhuǎn)移潛能［6］。通過(guò)紫外照射或致癌物暴露可誘發(fā)嚙齒類(lèi)或其他動(dòng)物惡性腫瘤，再?gòu)闹泻Y選出腦轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞株。如瘤細(xì)胞與造模動(dòng)物同系，所制備的模型稱(chēng)為同源性模型（syngeneic models）。同源性模型的優(yōu)點(diǎn)為免疫功能保留，可研究瘤細(xì)胞宿主反應(yīng)；缺點(diǎn)是瘤細(xì)胞為動(dòng)物來(lái)源，與患者腫瘤細(xì)胞存在生物學(xué)差異。在80年代以后轉(zhuǎn)向人－鼠異源性模型（xenograft models），即用人源性腫瘤細(xì)胞接種于鼠體內(nèi)造模。異源性模型又以接種部位與原發(fā)腫瘤的異同而分為原位（orthotopic）模型與異位（ectopic）模型。各種異源性與同源性腦轉(zhuǎn)移瘤模型的優(yōu)點(diǎn)與局限性總結(jié)見(jiàn)Tab 1。

3 腦轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型的制備方法

3.1 造模常用動(dòng)物 制備異源性腦轉(zhuǎn)移瘤模型選用免疫缺陷動(dòng)物，常用裸鼠［7］和（或）嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠）［9］等，一般在4～6周齡造模。制備同源性模型常用正常免疫功能的動(dòng)物。

3.1.1 裸鼠 裸鼠包括裸小鼠（nu）和裸大鼠（rnu），是位于第11對(duì)染色體上的裸基因nu隱性突變所致。裸小鼠純合子胸腺僅有殘跡，沒(méi)有T淋巴細(xì)胞正常分化，B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞基本正常，因而缺乏成熟T淋巴細(xì)胞所執(zhí)行的輔助與殺傷功能，不能產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)與移植排斥［7］。裸小鼠隨月齡增長(zhǎng)，T細(xì)胞會(huì)有所增加，故后述的瘤細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)常采用4～6周齡幼鼠。另外，裸小鼠正常的NK細(xì)胞功能也會(huì)制約瘤細(xì)胞的播散。裸大鼠T細(xì)胞缺陷的特征與裸小鼠相似，用于腦轉(zhuǎn)移瘤造模［8］有轉(zhuǎn)移瘤較大、成像或手術(shù)容易、組織與血標(biāo)本量多的優(yōu)點(diǎn)，但維持成本較高。

3.1.2 SCID小鼠 SCID小鼠（severe combined immune defi-ciency mice）是由常染色體隱性突變而來(lái)的另一種免疫缺陷動(dòng)物。SCID小鼠外觀有白毛，但胸腺、脾、淋巴結(jié)的重量是正常的30％以下，組織學(xué)上T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺乏［9］，對(duì)人類(lèi)腫瘤移植的存活率一般高于裸鼠。SCID小鼠的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞功能正常，故仍一定程度地制約瘤細(xì)胞的散播。另需注意的是SCID小鼠有“滲漏”現(xiàn)象，大約15％的SCID小鼠血中仍可檢測(cè)出有限數(shù)量的T細(xì)胞和B細(xì)胞以及一定水平的免疫球蛋白。SCID小鼠的滲漏現(xiàn)象不遺傳，僅需在選種時(shí)對(duì)留種小鼠進(jìn)行免疫球蛋白篩選。

SCID小鼠已發(fā)展一些變種，如與非肥胖性糖尿病小鼠NOD雜交獲得NOD/SCID小鼠以及再合并白介素-2受體γ-鏈基因敲除的NOD/SCID/IL-2Rγ－/－（NSG）小鼠，其N(xiāo)K細(xì)胞活性明顯降低，有利于瘤細(xì)胞的散播，適用于原位模型的制備［15，24，30］。

3.1.3 同源性模型可用免疫正常動(dòng)物 同源性模型可用裸鼠或者常規(guī)動(dòng)物造模，后者降低了動(dòng)物可得性難度。同源性模型成模較快（2周左右），但缺陷是腦轉(zhuǎn)移的特異性不高，腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移率較低。Zhang等［10］將Lewis肺癌細(xì)胞經(jīng)頸動(dòng)脈內(nèi)注射入4月齡C57BL/6NCrj小鼠，注射后12 d腦內(nèi)即檢測(cè)到大量瘤細(xì)胞，小鼠存活22 d。Hochman等［11］用近交系BALB/c乳鼠（出生后7 d）腹腔注射小鼠T細(xì)胞惡性淋巴瘤Rev-2-T-6細(xì)胞系，接種后9～14 d先轉(zhuǎn)移至蛛網(wǎng)膜下腔、脈絡(luò)叢、顱神經(jīng)，但大腦皮質(zhì)以及白質(zhì)受累遲（＞1月）而少（＜30％）。

出于成像或注射方便，國(guó)內(nèi)有研究者采用較大接種動(dòng)物，如張貴祥等［12］采用新西蘭大白兔頸總動(dòng)脈注射兔VX2肝癌細(xì)胞制備腦轉(zhuǎn)移瘤模型。該造模方法在注射瘤細(xì)胞前5 ～10 min先行注射20％甘露醇5 ml·kg－1以開(kāi)放血腦屏障，接種瘤細(xì)胞數(shù)量大（約需106～108個(gè)），造模兔存活期短于1個(gè)月。該兔模型也有顱外與腦膜成瘤比例偏高、腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移特異性低等缺點(diǎn)。

3.1.4 轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠 通過(guò)遺傳技術(shù)導(dǎo)入癌基因或失活抑癌基因，可制備腫瘤的遺傳性小鼠模型，但由于原發(fā)瘤發(fā)展過(guò)快而導(dǎo)致轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生機(jī)率不高。僅少數(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)基因或基因敲除途徑制備的小鼠腫瘤模型可發(fā)生多器官（包括腦）轉(zhuǎn)移，例如癌基因Ret轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的皮膚黑色素瘤；HCCR-2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的乳腺癌；肺上皮細(xì)胞Trp53與Rb1條件性基因敲除［13］產(chǎn)生的小細(xì)胞肺癌。另一方面，將轉(zhuǎn)基因或基因敲除技術(shù)與瘤細(xì)胞心內(nèi)注射方法結(jié)合起來(lái)［5，14－15］可用以研究特定基因或分子對(duì)腫瘤腦轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用或提高造模成功率。如前所述，裸鼠或SCID小鼠尚存NK細(xì)胞活性，而重組激活基因Rag2－/－與白介素-2受體γ鏈IL-2Rγ－/－雙基因敲除小鼠則缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，可替代裸鼠或SCID小鼠成功用于Her2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移瘤造模［14］?？傊?，基因工程小鼠腫瘤模型或技術(shù)代表著腦轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型研制的一個(gè)新方向。

3.2 造模常用的腫瘤細(xì)胞系 制作腦轉(zhuǎn)移瘤模型選用的細(xì)胞系因原發(fā)瘤不同而異，以乳腺癌和肺癌腦轉(zhuǎn)移模型研究與應(yīng)用得最多。

乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型通常采用三陰性乳腺癌（triple-nega-tive breast cancer）細(xì)胞系造模。三陰性乳腺癌細(xì)胞不表達(dá)雌激素受體（ER）、孕酮受體（PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2 （Her2/neu），對(duì)于常規(guī)化療不敏感。三陰性乳腺癌初始細(xì)胞系MDA-MB-231并無(wú)形成腦轉(zhuǎn)移的特異性。Yoneda等［16］將MDA-MB-231母代細(xì)胞系經(jīng)若干次“外周接種－腦轉(zhuǎn)移－傳代培養(yǎng)－外周接種”循環(huán)篩選后，篩出優(yōu)先轉(zhuǎn)移到腦（brain-seeking）的乳腺癌細(xì)胞亞系MDA-MB-231BR，在裸小鼠心內(nèi)注射后僅產(chǎn)生腦轉(zhuǎn)移。通過(guò)病理學(xué)或MRI成像顯示，2％的注射細(xì)胞在腦內(nèi)形成較大的轉(zhuǎn)移灶，5％的注射細(xì)胞仍然呈休眠狀態(tài)［17］。為了方便成像，231BR細(xì)胞又轉(zhuǎn)染增強(qiáng)綠色熒光蛋白（eGFP）或者螢火蟲(chóng)熒光素酶，但轉(zhuǎn)染熒光素酶可改變瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，降低腦轉(zhuǎn)移的特異性，轉(zhuǎn)染eGFP則影響較小。因而，MDA-MB-231BR或再表達(dá)eGFP的細(xì)胞系是目前乳腺癌腦轉(zhuǎn)移造模最常用的細(xì)胞系。其他的人乳腺癌細(xì)胞系如MA11、MCF-7等，因造模潛伏期過(guò)長(zhǎng)或腦轉(zhuǎn)移特異性不高已很少使用。

肺癌腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型研制相對(duì)滯后，目前尚未建立肺癌特異性腦轉(zhuǎn)移的模型。肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞為人肺泡基底上皮腺癌細(xì)胞，裸鼠心內(nèi)注射A549細(xì)胞并不產(chǎn)生腦轉(zhuǎn)移，因而需采用腦內(nèi)直接注射的方法造模［17］。將A549細(xì)胞過(guò)表達(dá)金屬蛋白酶ADAM9增加瘤細(xì)胞的侵襲性，注射后可產(chǎn)生腦內(nèi)微轉(zhuǎn)移灶［18］。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系EBC-1經(jīng)反復(fù)篩選之后獲得高腦轉(zhuǎn)移的細(xì)胞亞系EBC-1/brain，左心室注射后獲得較高幾率的腦轉(zhuǎn)移［19］。雷貝等［20］從中國(guó)人肺腺癌細(xì)胞系CPA-Yang1通過(guò)體內(nèi)外篩選獲得較高腦轉(zhuǎn)移潛能的亞系CPA-Yang1-BR，一次接種可有1/2的裸小鼠產(chǎn)生腦轉(zhuǎn)移。用于轉(zhuǎn)移瘤造模的其他非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系尚有PC-9、PC-14、A925LPE3等［21－22］。另一方面，有研究者采用的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H187、DMS273肺內(nèi)接種，以制備原位小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移模型，腦轉(zhuǎn)移發(fā)生幾率（20％左右）與特異性均不高，但從DMS273篩選的G3H亞細(xì)胞系腦轉(zhuǎn)移能力提高［23］。

人或小鼠的黑色素瘤細(xì)胞系很多，各實(shí)驗(yàn)室用于制備腦轉(zhuǎn)移模型的細(xì)胞系也各不相同。Rozenberg等［24］比較了原位皮下接種11種黑色素瘤細(xì)胞系腦轉(zhuǎn)移模型潛力的差別，發(fā)現(xiàn)其中A375、A2058、RPMI8322、WM2664細(xì)胞產(chǎn)生較高比例的腦轉(zhuǎn)移。將人黑色素瘤多種細(xì)胞系用超順磁性的氧化鐵納米顆粒標(biāo)記后再左心室內(nèi)接種［25］，可方便成像追蹤。人前列腺癌細(xì)胞DU145心內(nèi)注射后并不能形成轉(zhuǎn)移瘤，但其Ras突變亞系DU145/RasB1用于造?？尚纬晒呛湍X轉(zhuǎn)移［26］。

3.3 瘤細(xì)胞接種方法 腦轉(zhuǎn)移瘤異位模型的構(gòu)建通常采取動(dòng)物左心室內(nèi)（Fig 1）或頸動(dòng)脈注射；原位模型目前應(yīng)用較多的是動(dòng)物肺內(nèi)、乳腺脂肪墊或皮下接種。

3.3.1 左心室內(nèi)注射 左心室內(nèi)注射是異位模型最常用的接種方法。以小鼠心內(nèi)盲注射為例：小鼠適當(dāng)麻醉后仰臥固定，胸部消毒備皮。注射瘤細(xì)胞數(shù)量大約為1×106，懸浮于100 μL磷酸鹽緩沖液；用0.25～0.5 ml注射器，27～28 G針頭。在胸骨上切跡與劍突的中點(diǎn)偏左標(biāo)記注射點(diǎn)，從左心室腔正上方可垂直進(jìn)針；也可將注射點(diǎn)向外下移動(dòng)少許，以45°角朝左心室進(jìn)針，以方便使用注射推進(jìn)裝置。待見(jiàn)到明顯回血后即固定針頭位置，分段間斷推注。注射完畢后以輕微負(fù)壓退針。

小鼠心內(nèi)盲注射法為非直視下操作，有一定的注射失敗幾率，部分小鼠還可能在注射點(diǎn)附近的心壁和肺部形成腫瘤。有條件的實(shí)驗(yàn)室可采用小動(dòng)物超聲成像（如Vevo 770高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)）輔助小鼠心室內(nèi)注射［27－28］：動(dòng)物麻醉后仰臥固定，先調(diào)節(jié)好超聲影像探頭位置以清晰顯示左心室超聲心動(dòng)圖像；再將注射器固定于可操縱的推進(jìn)裝置，在動(dòng)態(tài)超聲影像輔助下將針尖推進(jìn)至左心室腔內(nèi)，以準(zhǔn)確注射。與盲注射方法相比，使用小動(dòng)物超聲成像輔助不僅注射準(zhǔn)確，造模成功率提高，造模小鼠死亡率也從20％～25％大大降低到1％～2％，因手術(shù)引起的體重下降也有所緩解。另外，如果注射的瘤細(xì)胞有熒光素酶標(biāo)記，可用小動(dòng)物PET成像來(lái)檢查心內(nèi)注射的準(zhǔn)確性，正確心內(nèi)注射的小鼠其熒光素酶信號(hào)迅速分布于動(dòng)物全身。

即使心內(nèi)注射準(zhǔn)確完成，仍然有一部分造模動(dòng)物在注射瘤細(xì)胞后死亡。瘤細(xì)胞具有促凝血活性，可引起廣泛的血栓形成與栓塞，可能是導(dǎo)致動(dòng)物死亡的主因。Stocking等［29］報(bào)道在瘤細(xì)胞心內(nèi)接種前10 min尾靜脈注射低分子量肝素（enoxaparin）10 mg·kg－1可大大減少隨后瘤細(xì)胞接種引起的造模動(dòng)物死亡。瘤細(xì)胞操作應(yīng)置于冰上。

Fig 1 Brain metastasis formation following intracardiac injection of tumor cells

3.3.2 頸動(dòng)脈接種 頸動(dòng)脈接種也模擬瘤細(xì)胞血行腦轉(zhuǎn)移。頸動(dòng)脈注射雖在直視下操作，但注射技術(shù)要求高，注射瘤細(xì)胞數(shù)量與體積受限，易發(fā)生注射局部腫瘤生長(zhǎng)，故較少應(yīng)用。仍以小鼠頸動(dòng)脈注射為例：小鼠麻醉后仰臥固定，頸部行正中切口，分離出一側(cè)頸總動(dòng)脈。注射瘤細(xì)胞數(shù)量通常在5×104上下，懸浮于5或10 μL磷酸鹽緩沖液，用10～20 μL微量注射器，32～33G針頭。于頸總動(dòng)脈分叉下方5～6 mm處進(jìn)針，可下墊小金屬柄以方便進(jìn)針。注射后用明膠海綿輕壓或絲線結(jié)扎止血，縫合切口。

3.3.3 原發(fā)瘤原位接種 原發(fā)瘤原位接種模型（orthotopic models）與臨床腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生情況最為接近，包括腦轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)。早期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞原位接種不同于臨床晚期，難以形成轉(zhuǎn)移灶。近些年，通過(guò)研制高轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞株、基因工程技術(shù)改變接種的微環(huán)境等手段使原位接種模型研制取得明顯的進(jìn)展。受解剖特點(diǎn)、臨床相關(guān)性等因素影響，腫瘤轉(zhuǎn)移原位模型研究較多的是肺癌、乳腺癌和黑色素瘤。人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H187、DMS273接種至裸鼠肺部，可以在骨、腎和腦形成轉(zhuǎn)移［23］。人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231［15，30］、小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1亞系4TBM［31］也用于乳腺癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移原位模型的制備，通常將癌細(xì)胞接種于裸小鼠乳腺脂肪墊或乳腺導(dǎo)管。黑色素瘤原位接種為皮下注射，因較易操作而被廣泛應(yīng)用。人黑色素瘤細(xì)胞系WM239A的變異株131/4-5B1、131/4-5B2皮下注射后97～180 d檢測(cè)到腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移瘤［32］。裸小鼠皮下接種其他黑色素瘤細(xì)胞系YDFR.CB3、A375、A205890等［24］，大于90 d后可見(jiàn)類(lèi)似的腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移。原位模型的缺點(diǎn)有成模潛伏期較長(zhǎng)，常需要7～12周或以上，一般產(chǎn)生多個(gè)器官的轉(zhuǎn)移。

3.3.4 其它外周接種途徑 尾靜脈注射易于操作，雖曾是小鼠瘤細(xì)胞接種的一個(gè)途徑，但尾靜脈注射后瘤細(xì)胞大部分滯留在肺部，肺部以外的器官如骨、腦發(fā)生轉(zhuǎn)移瘤的概率不高，故現(xiàn)已少用。尾靜脈注射尚因肺癌惡病質(zhì)，易致小鼠在腦轉(zhuǎn)移瘤形成之前死亡。另外，靜脈注射造模方法與臨床患者多由動(dòng)脈血運(yùn)產(chǎn)生轉(zhuǎn)移瘤的情況不一致。

腹腔接種更易操作，也被個(gè)別研究者采用。Hochman等［11］用BALB/c小鼠腹腔接種鼠惡性淋巴瘤細(xì)胞Rev-2-T-6構(gòu)建腦轉(zhuǎn)移的同源性模型，發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞主要經(jīng)脈絡(luò)叢和顱神經(jīng)轉(zhuǎn)移，較少轉(zhuǎn)移至腦實(shí)質(zhì)，說(shuō)明腹腔接種造模也具有明顯的局限性。

3.3.5 直接腦內(nèi)接種 心內(nèi)注射能模擬臨床腫瘤血行腦轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)操作有一定難度，且成模率有限制，一部分研究者采用腫瘤細(xì)胞直接接種到特定腦區(qū)的簡(jiǎn)化方法，以快速成模，尤其適用于一些無(wú)明顯腦轉(zhuǎn)移特性的腫瘤細(xì)胞株。當(dāng)然，這種模型非嚴(yán)格意義上的轉(zhuǎn)移瘤模型，而稱(chēng)之局部生長(zhǎng)模型更為準(zhǔn)確。這種造模方法借助于腦立體定位儀，采用裸大鼠等較大免疫缺陷動(dòng)物，接種部位有尾狀核、丘腦腹后內(nèi)側(cè)核等。人肺腺癌細(xì)胞株A549沒(méi)有腦轉(zhuǎn)移特性，Pishko等［33］將A549細(xì)胞直接接種于裸大鼠腦尾殼核內(nèi)，來(lái)作為肺癌腦轉(zhuǎn)移的大鼠模型，用于VEGF單克隆抗體療效的研究。

有一些研究者為了避開(kāi)應(yīng)用瘤細(xì)胞株，而將臨床腦轉(zhuǎn)移瘤活檢標(biāo)本直接種于裸大鼠腦內(nèi)［34］。這種模型的優(yōu)點(diǎn)是很大程度上保留了臨床腫瘤的原有特性，并部分保留了腫瘤基質(zhì)成分，適用于治療方法研究。

4 腦轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型的檢測(cè)方法

4.1 影像學(xué)檢測(cè) 臨床腦轉(zhuǎn)移瘤檢查方法有CT、正電子發(fā)射成像（PET）和磁共振成像（MRI）等，而動(dòng)物模型腦轉(zhuǎn)移瘤很小，影像學(xué)檢測(cè)方法主要為磁共振成像，且需采用高分辨率儀器與多模式成像（multimodal imaging）等技術(shù)。早期3.0T磁共振成像多用于較大動(dòng)物模型如裸大鼠模型，用于裸小鼠檢測(cè)靈敏度不足，后者需要應(yīng)用7.0T或以上的小動(dòng)物磁共振成像儀。多模式成像技術(shù)包括T2加權(quán)成像、釓增強(qiáng)后T1加權(quán)成像、動(dòng)態(tài)磁敏感對(duì)比增強(qiáng)灌注加權(quán)成像，以顯示腫瘤血管分布與血流灌注情況的變化。用氧化鐵納米顆粒磁標(biāo)記腫瘤細(xì)胞造模，可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)瘤細(xì)胞磁共振腦成像追蹤和全腦自動(dòng)定量［25］。腦轉(zhuǎn)移瘤定期影像檢測(cè)可提供多病灶動(dòng)態(tài)發(fā)展的資料，而單細(xì)胞水平磁共振腦成像對(duì)于追蹤休眠期瘤細(xì)胞或微轉(zhuǎn)移灶有重要價(jià)值。

常規(guī)釓增強(qiáng)MRI僅對(duì)較大腫瘤敏感。為提高檢測(cè)靈敏度，牛津大學(xué)Sibson實(shí)驗(yàn)室發(fā)展了分子MRI方法［35］，用連接抗體的氧化鐵微顆粒作為靶向造影劑對(duì)血管內(nèi)皮黏附分子-1（VCAM-1）進(jìn)行MRI成像。裸小鼠心內(nèi)注射小鼠4T1瘤細(xì)胞和SCID小鼠心內(nèi)注射人MDA-231-BR細(xì)胞制備乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型，在注射瘤細(xì)胞5 d后，VCAM-1靶向分子MRI成像即可檢測(cè)到腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤信號(hào)，檢測(cè)靈敏度較常規(guī)MRI方法提高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。選擇血管形成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與凋亡、組織炎癥特異分子建立各種靶向磁共振成像方法，可以動(dòng)態(tài)檢測(cè)腦轉(zhuǎn)移瘤微環(huán)境的分子與細(xì)胞變化。

4.2 病理生物學(xué)檢測(cè)

4.2.1 常規(guī)HE染色 腫瘤組織學(xué)檢測(cè)最基礎(chǔ)的方法是蘇木精－伊紅（HE）染色，腦轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型分析要盡量采用系列的全腦完整切片。HE染色可以觀察組織細(xì)胞的分化程度和異型性大小。腦轉(zhuǎn)移瘤模型的瘤細(xì)胞形態(tài)差異雖較臨床標(biāo)本小，但瘤細(xì)胞核通常染色仍較深、排列密集、易見(jiàn)核分裂。如有必要，HE染色成像后可用1％鹽酸乙醇液脫色，再做免疫組化染色來(lái)獲得腫瘤細(xì)胞來(lái)源等信息。

4.2.2 特殊染色 特殊染色用于顯示組織中的正常結(jié)構(gòu)或病理物質(zhì)，與腦轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)的方法包括改良的Gomori銀氨法和Alcian blue/PAS復(fù)合染色。

Gomori銀氨法將網(wǎng)狀纖維染成黑色，可用于癌與肉瘤的鑒別診斷：癌細(xì)胞間多無(wú)網(wǎng)狀纖維；肉瘤細(xì)胞間多有網(wǎng)狀纖維。Gomori銀氨法還可用于腦轉(zhuǎn)移瘤與原發(fā)瘤的鑒別，轉(zhuǎn)移瘤常有明顯的網(wǎng)狀纖維，而腦內(nèi)大多數(shù)原發(fā)瘤網(wǎng)狀纖維很少。Alcian blue染色顯示硫酸粘多糖。腦轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞分泌的粘蛋白以酸性為主，可被Alcian blue深染成藍(lán)色，而PAS （Periodic Acid-Schiff）染色法檢測(cè)組織中的糖類(lèi)。腦轉(zhuǎn)移瘤組織被Alcian blue/PAS復(fù)合染色顯示為藍(lán)紅色。

4.2.3 免疫組化與免疫印跡 腫瘤組織的分子標(biāo)志物常用免疫組化方法檢測(cè)，例如，Ki-67及增殖細(xì)胞核抗原PCNA是廣泛采用的增殖相關(guān)標(biāo)志物，其免疫反應(yīng)性與腫瘤分級(jí)及預(yù)后相關(guān)。血細(xì)胞簇分化抗原CD系列不僅用于區(qū)分不同發(fā)育階段和不同亞類(lèi)淋巴細(xì)胞，還可用于顯示腫瘤組織血管增殖（如CD31）［36］。一些細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白常用于顯示腫瘤來(lái)源，如角蛋白cytokeratin（上皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞、癌細(xì)胞）、波形蛋白vimentin（間葉組織、肉瘤細(xì)胞）、S-100（神經(jīng)組織、黑色素瘤）等。臨床常用的腫瘤分子標(biāo)志物也可選擇性用于對(duì)應(yīng)的腦轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型檢測(cè)。另外，如果腦轉(zhuǎn)移瘤造模采用表達(dá)綠色熒光蛋白的瘤細(xì)胞系，可在熒光顯微鏡下直接觀察到腦轉(zhuǎn)移瘤病灶。

由于腦轉(zhuǎn)移瘤多發(fā)且大小形狀不一，定量檢測(cè)相對(duì)困難。筆者曾設(shè)計(jì)了腦轉(zhuǎn)移瘤半腦或全腦標(biāo)本采用GFP等標(biāo)簽蛋白免疫印跡方法，結(jié)合全腦片病理學(xué)檢查來(lái)進(jìn)行腦轉(zhuǎn)移瘤的半定量檢測(cè)，并介紹給同事應(yīng)用［37］，取得了良好效果。

5 小結(jié)與展望

臨床腦轉(zhuǎn)移瘤治療困難，預(yù)后較差，持續(xù)推動(dòng)了腦轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型研制成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。不同類(lèi)型的腦轉(zhuǎn)移瘤模型側(cè)重反映轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生發(fā)展的不同環(huán)節(jié)，以原位模型反映的環(huán)節(jié)最為全面。動(dòng)物自發(fā)或誘導(dǎo)的同源性模型保留了宿主的免疫功能，可用于研究瘤細(xì)胞與宿主微環(huán)境之間的相互作用，但由于瘤細(xì)胞為動(dòng)物來(lái)源，所得結(jié)果必須在患者標(biāo)本上加以驗(yàn)證。人－鼠異源性模型是目前方法最成功、應(yīng)用最多的模型。其中的異位模型雖然因左心室或頸動(dòng)脈內(nèi)注射跳過(guò)了原發(fā)瘤生長(zhǎng)、外侵、滲入血管之前的環(huán)節(jié)，但仍可用于惡性腫瘤經(jīng)過(guò)血道轉(zhuǎn)移至腦的機(jī)制研究。另外，異位模型的成模穩(wěn)定性好于原位模型，可用于治療措施的研究。原位模型與臨床腫瘤腦轉(zhuǎn)移最為接近，但成模所需的時(shí)間也最長(zhǎng)，目前在腦轉(zhuǎn)移特異性和成模率上尚有缺陷，期待未來(lái)不斷完善。腦內(nèi)直接接種模型省略了腫瘤腦轉(zhuǎn)移的大部分環(huán)節(jié)，適用于試驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞局部生長(zhǎng)或治療措施。另外，動(dòng)物模型將如何模擬與復(fù)發(fā)有關(guān)的腫瘤休眠（tumor dormancy），尚待進(jìn)一步研究。

目前的腦轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型在成模方面存在不同動(dòng)物個(gè)體之間的較大差異，使治療措施的試驗(yàn)仍面臨較大挑戰(zhàn)。借助小動(dòng)物活體影像學(xué)動(dòng)態(tài)檢測(cè)與自身前后對(duì)照可克服上述限制，尤其是近幾年發(fā)展了單個(gè)瘤細(xì)胞成像示蹤和分子靶向磁共振等靈敏方法。然而，對(duì)于大多數(shù)無(wú)動(dòng)物磁共振影像檢測(cè)條件的實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)一步研制出更穩(wěn)定、個(gè)體差異小的動(dòng)物模型將有廣泛的實(shí)用價(jià)值。

利用基因工程技術(shù)導(dǎo)入癌基因或失活抑癌基因是腫瘤動(dòng)物模型研制的一個(gè)新方向，可以與傳統(tǒng)造模方法結(jié)合起來(lái)。CRISPR-Cas9新技術(shù)是基因編輯與中止的強(qiáng)有力工具，它通過(guò)人工設(shè)計(jì)具有引導(dǎo)作用的sgRNA（short guide RNA），將核酸酶Cas9引導(dǎo)到基因組的靶點(diǎn)上，對(duì)DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割。麻省理工學(xué)院的研究人員已經(jīng)使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了高效、快速的基因敲除動(dòng)物模型制備新方法。最近他們又報(bào)道了另一個(gè)新方法，將CRISPR-Cas9系統(tǒng)用于高效體內(nèi)篩選全基因組與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的抑癌基因［38］。研究人員先將基因組規(guī)模的sgRNAs文庫(kù)導(dǎo)入無(wú)轉(zhuǎn)移特性的小鼠瘤細(xì)胞系，再將基因突變的細(xì)胞系注射進(jìn)免疫缺陷動(dòng)物，以快速產(chǎn)生轉(zhuǎn)移瘤；通過(guò)在轉(zhuǎn)移瘤中富集的sgRNAs找到其靶點(diǎn)，即與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的抑癌基因。相信通過(guò)類(lèi)似的技術(shù)不久便可找到導(dǎo)致腫瘤腦轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，在此基礎(chǔ)上制備出表型更穩(wěn)定、機(jī)制更明確或與臨床情況更相似的腦轉(zhuǎn)移瘤動(dòng)物模型。

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Animal models of brain metastasis：preparation methods and research progress

CUI Bai-ping1，CHEN Ping2，SUN An-yang1
（1.Laboratory of Neurodegenerative Diseases and Repair，Yancheng Institute of Health Sciences；2.Dept of Oncology，Yancheng First People′s Hospital，Yancheng Jiangsu 224005，China）

Brain metastasis（BM）is a common brain tumor in a-dults，originating from extracranial location in the body.There has been a growing interest in producing suitable animal models for studying BM in vivo.Current BM models take peripheral or brain route for tumor cell inoculation，including intra-cardiac or intra-carotid artery injection or orthotopic injection.Direct im-plantation of patient tumor biopsies into rodent brain bears ad-vantages of clinical relevance.This review presents a compre- hensive introduction to key elements for establishing animal mod-els of BM，with highlights on selections of suitable model ani-mals，brain-seeking tumor cell lines，reasonable inoculation routes，as well as succedent phenotyping methods.In the end，perspectives and future directions in this field are discussed.

brain metastasis；tumor；animal models；nude mice；cell inoculation；model preparation；model evaluation

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.004.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.002

A

1001－1978（2016）03－0304－06

R-05；R363-332；R739.41；R73-37

2015－10－30，

2015－12－20

崔白蘋(píng)（1987－），女，碩士，講師，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病，E-mail：cuibaiping＠126.com；陳 平（1963－），女，主任醫(yī)師，教授，研究方向：腫瘤轉(zhuǎn)移與治療，共同第一作者，E-mail：doc＿pchen＠126.com；孫安陽(yáng)（1966－），男，博士，教授，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病，通訊作者，E-mail：asun08＠fudan.edu.cn