金黃色葡萄球菌細胞內生物大分子含量變化的光鑷拉曼光譜研究*

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金黃色葡萄球菌細胞內生物大分子含量變化的光鑷拉曼光譜研究*

0引言

【研究意義】金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)簡稱金葡菌，是臨床上重要的病原菌，是引起臨床感染及手術切口感染的主要致病菌之一，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染[1]。它在生長過程中，由于外部環(huán)境的不斷變化，細菌細胞必需實時對環(huán)境信號的刺激作出響應，表現(xiàn)為細胞形態(tài)的改變，細胞內生物大分子組成及含量的變化。金葡菌的代謝狀態(tài)對其耐藥性以及對宿主的毒力作用均有重要影響。因此，深入了解金葡菌生長過程中細胞內生物大分子的變化對理解其致毒機理以及感染的預防和治療具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】生物樣品中的主要成分(核酸、蛋白質、脂類、碳水化合物)可以對入射光進行非彈性散射，產(chǎn)生特征性的拉曼光譜。一個生物樣品的拉曼光譜包含上千個像素點，可以同時涵蓋多種物質成分的信息[2]；另外，由于每種物質的特征峰強度與該物質的濃度成正比，所以拉曼光譜可以同時反映細胞中多種生物大分子含量的動態(tài)變化情況。由于拉曼光譜技術在靈敏度、分辨率、無損傷等方面具有的優(yōu)勢，該技術日益在細胞生物學[3]、微生物學[4]、醫(yī)學診斷[5-6]，藥物研究[7]等領域顯示出良好的應用前景。光鑷拉曼光譜技術(Laser Tweezer Raman Spectroscopy,LTRS)將光鑷技術和拉曼光譜技術結合起來，其原理是利用高度匯聚的激光束，囚禁溶液中的活細胞，同時激發(fā)細胞內分子的拉曼散射[8-9]。該技術充分結合了共焦顯微、光鑷、拉曼光譜的優(yōu)點,進一步提高了檢測的靈敏度、準確度?！颈狙芯壳腥朦c】研究微生物與環(huán)境相互作用過程中細胞內生物大分子變化特點的傳統(tǒng)方法，是對收集的大量微生物樣本破碎細胞后分別提取核酸、蛋白質、脂類等成分，再對每種成分分別定量[10-11]。這種方法樣本需求量大，處理過程復雜，而且無法獲得單細胞水平生物分子動態(tài)變化的信息。因此，本研究擬利用LTRS技術表征金葡菌分批培養(yǎng)各階段的代謝狀態(tài)?！緮M解決的關鍵問題】通過監(jiān)測并分析金葡菌在不同時間點拉曼光譜特征峰的變化，獲知細菌細胞內不同生物大分子的實時動態(tài)變化規(guī)律。

1材料與方法

1.1菌種

金黃色葡萄球菌ATCC 6538購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎上添加15 g/L瓊脂粉。各培養(yǎng)基于121℃滅菌20 min。

1.3細菌培養(yǎng)及樣品制備

挑取LB固體培養(yǎng)基上的金葡菌單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min過夜培養(yǎng)后，以10%比例轉接于含有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37℃，200 r/min 培養(yǎng)31.5 h。分別于1.5 h，3.0 h，4.5 h，6.0 h，7.5 h，9.0 h，10.5 h，13.5 h，16.5 h，19.5 h，22.5 h，25.5 h，28.5 h和31.5 h取1 mL菌液用于測定菌體密度和拉曼光譜。

菌體密度的測定方法：將菌液用無菌水適當稀釋后測量600 nm處的吸光度OD600。用于拉曼光譜測定的菌液先經(jīng)過5 000 r/min離心5 min后，以PBS洗滌2次，然后按照10 μL菌液稀釋為1 mL待測樣品的比例以PBS稀釋，加入0.1%(V/V) Tween 80 渦旋振蕩1 min以制備單細胞懸液。

1.4光譜收集及數(shù)據(jù)處理

實驗中所用的光鑷拉曼光譜系統(tǒng)按照文獻[10-11]所述方法建立。將細菌懸液置于樣品槽內，100×油浸物鏡下光鑷隨機俘獲單個細胞，將目標細胞提升至石英片上方5 μm左右，激光強度調整為45 mW，信號累積時間為30 s，收集目標細胞的拉曼光譜。此時收集的光譜是帶有背景的細胞拉曼光譜。再于細胞附近以相同條件收集背景拉曼光譜，每個樣品收集30個單細胞的拉曼光譜，3個背景光譜。

光譜的預處理采用Matlab 7.0 編寫的程序進行，每個細胞的原始光譜分別經(jīng)過背景扣除，5點Savitzky-Golay平滑，基線校正，得到細胞的實際光譜。光譜圖的繪制及光譜數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析在軟件Origin 8.5中進行。

2結果與分析

2.1生長曲線

由金葡菌ATCC 6538生長曲線(圖1)可知，0～1.5 h為延滯期，1.5～9 h為對數(shù)期，9 h到培養(yǎng)終點均為穩(wěn)定期。

2.2拉曼光譜

分別選取延滯期(1.5 h)，對數(shù)生長期(3.5 h)和穩(wěn)定期(19.5 h)金葡菌拉曼光譜的平均光譜(30個細胞的單細胞光譜的平均)，進行特征峰的歸屬指認(表1)及不同生長階段拉曼光譜差別的比較(圖2)。由圖2可以看到，不同生長階段金葡菌的拉曼光譜差別明顯，例如，隨著培養(yǎng)時間的推移，667 cm-1，724 cm-1，1 001 cm-1，1 574 cm-1以及1 662 cm-1等特征峰強度都有不同程度的變化。

圖1金黃色葡萄球菌的生長曲線

Fig.1Growth curve of Staphylococcus aureus

表1金黃色葡萄球菌拉曼光譜主要特征峰歸屬[12-13]

Table 1Assignment of the major Raman bands of Staphylococcus aureus cells

峰位置Peakposition(cm-1)峰歸屬Peakasignment(cm-1)667鳥嘌呤環(huán)呼吸振動Gringbr.724腺嘌呤Adenine781DNAO-P-O伸縮振動;U、C、T環(huán)呼吸振動DNAO-P-Ostr.;U,C,Tringbr.809RNAO-P-O伸縮振動RNAO-P-Ostr.850酪氨酸Tyr1001苯丙氨酸苯環(huán)呼吸峰Pheringbr.1094DNAO-P-O伸縮振動DNAO-P-Ostr.1244A,UNH2環(huán)模A,UNH2ringmode1451蛋白質/脂類CH變形,CH2彎曲振動protein/lipidCHdef,CH2banding1574腺嘌呤,鳥嘌呤環(huán)模A,Gringmode1652蛋白質酰胺Ⅰ帶proteinamideⅠband

圖2不同生長階段金黃色葡萄球菌細胞的拉曼光譜

Fig.2Raman spectra of Staphylococcus aureuscells during various growth stages

2.3拉曼光譜特征峰的動態(tài)變化

細胞內每種生物大分子的不同基團都可能產(chǎn)生拉曼散射，且散射強度與激發(fā)區(qū)域內物質分子的含量成正比，因此不同特征峰強度的時間依賴性變化曲線(圖3)可以追蹤細胞內主要生物分子含量的動態(tài)變化情況，提供細胞代謝狀態(tài)的實時信息。按照不同特征峰的歸屬類別(核酸或蛋白質)以及曲線的動態(tài)變化趨勢可以將曲線分成2組，A組歸屬于核酸(圖3a)，而B組則是來源于蛋白質(圖3b)的特征峰?？傮w而言，源于核酸的拉曼光譜峰強度隨著時間的推移持續(xù)下降(A組)，在延滯期和對數(shù)生長期(1.5～9 h)下降尤其劇烈，其中下降最明顯的3個峰724 cm-1峰，781 cm-1峰和809 cm-1峰在對數(shù)生長期將近結束時(9 h)的峰強度降低為對數(shù)生長期起始時(1.5 h)強度的1/2。這是由于在對數(shù)生長期，絕大多數(shù)細胞處于細胞分裂狀態(tài)，DNA復制活躍，DNA含量加倍，而穩(wěn)定期細胞大多處于靜止狀態(tài)，DNA含量僅相當于復制期的一半。歸屬于蛋白質的特征峰強度(B組，850 cm-1峰，1 001 cm-1峰和1 662 cm-1峰)在對數(shù)生長期顯著增強，而到穩(wěn)定期峰強度基本維持恒定，其中，1 001 cm-1峰來源于蛋白質苯丙氨酸殘基，峰形尖銳，基本對稱，周圍沒有其他物質峰的干擾，是反映樣品內蛋白質含量變化靈敏的標志。蛋白質含量隨生長時間而增加可能是細菌細胞對環(huán)境中營養(yǎng)成分的消耗脅迫所作的響應，這種現(xiàn)象在其他細菌中也可以見到[14]。

圖3金黃色葡萄球菌拉曼光譜各特征峰強度的時間依賴性變化

Fig.3Time dependant changes in the band intensities of Raman spectra of Staphylococcus aureus cells

以上結果表明，光鑷拉曼光譜技術能實時追蹤微生物培養(yǎng)過程中細胞代謝狀態(tài)的變化。與傳統(tǒng)的檢測手段相比，基于拉曼光譜的方法具有以下優(yōu)點：(1)樣品需求量小，10 μL或更少體積的菌液進行適當稀釋后就可以滿足測定需要；(2)樣品處理簡單，可以對活細胞進行實時監(jiān)測；(3)可以同時對樣品中的多種組分進行定量分析，對于每種組分，光譜中可以有多個特征峰與之對應，定量結果相互驗證，進一步提高了結果的可靠性；(4)作為一種單細胞分析手段，可以提供群體中細胞間異質性的信息。

3結論

本文研究金黃色葡萄球菌分批生長時拉曼光譜特征峰的時間依賴性變化特點。結果顯示，歸屬于核酸的特征峰，如667 cm-1峰，724 cm-1峰，781 cm-1峰，809 cm-1峰和1 574 cm-1峰隨著培養(yǎng)時間的延長而持續(xù)降低，在對數(shù)生長期下降幅度尤其劇烈，反映了對數(shù)生長期細胞的快速分裂和DNA的活躍復制；同時，與蛋白質相關的特征峰，如850 cm-1峰，1 001 cm-1峰和1 662 cm-1峰，在對數(shù)生長期顯著增強，而到穩(wěn)定期峰強度基本維持恒定，體現(xiàn)了細菌細胞對環(huán)境中營養(yǎng)物質消耗所作的響應。這表明光鑷拉曼光譜技術能實時監(jiān)測微生物細胞內生物大分子的動態(tài)變化，獲取有關代謝狀態(tài)的相關信息，與傳統(tǒng)分析手段相比，具有單細胞無損分析、提供信息豐富、樣本需求量小、高效可靠等優(yōu)勢。

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(責任編輯：尹闖)

Study on Bio-Macromolecular Level Changes in Staphylococcus aureus Cells during Batch Cultivation Using Laser Tweezers Raman Spectroscopy

陶站華1，孫美娟2

TAO Zhanhua1,SUN Meijuan2

(1.廣西科學院生物物理實驗室，廣西南寧530007；2.百色學院物理與電信工程系，廣西百色533000)

(1.Laboratory of Biophysics of Guangxi Academy of Sciences,Nanning,Guangxi,530007,China; 2.Department of Physics and Telecommunication Engineering of Baise University,Baise,Guangxi,533000,China)

摘要：【目的】利用光鑷拉曼光譜技術(Laser Tweezers Raman Spectroscopy,LTRS)研究金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細胞內主要生物大分子含量的動態(tài)變化，探尋監(jiān)測微生物代謝狀態(tài)變化的有效工具?！痉椒ā渴占峙囵B(yǎng)過程不同時間點金黃色葡萄球菌細胞的拉曼光譜，觀察其特征峰依賴時間的變化特點?！窘Y果】歸屬于核酸的特征峰，如667 cm(-1)峰，724 cm(-1)峰，781 cm(-1)峰，809 cm(-1)峰和1 574 cm(-1)峰在整個分批生長階段持續(xù)降低，在對數(shù)生長期下降幅度尤其劇烈，反映了對數(shù)生長期細胞分裂快速，DNA復制活躍；與蛋白質相關的特征峰，如850 cm(-1)峰，1 001 cm(-1)峰和1 662 cm(-1)峰，在對數(shù)生長期顯著增強，而到穩(wěn)定期峰強度基本維持恒定?！窘Y論】光鑷拉曼光譜技術能實時監(jiān)測生物樣品內生物大分子的含量，是單細胞水平上研究微生物代謝狀態(tài)變化的有效工具。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌拉曼光譜激光鑷子單細胞分析

Abstract:【Objective】The dynamic change in content of major biological molecules inside Staphylococcus aureus cells in batch cultivation was investigated using laser tweezers Raman spectroscopy.【Methods】Raman spectra of Staphylococcus aureus cells sampled at various time points of batch cultivation were recorded to observe time-dependent changes of the characteristic peaks.【Results】The intensities of characteristic bands at 667 cm(-1),724 cm(-1),781 cm(-1),809 cm(-1) and 1 574 cm(-1),assigned to nucleic acids,decreased continuously throughout the batch growth,and the intensities of these bands dropped even more drastically,especially during the exponential growth phase,which could be attributed to the rapid cell division and active DNA replication in the exponential growth stage.In the meantime,the intensities of Raman peaks around 850 cm(-1),1 001 cm(-1) and 1 662 cm(-1),associated with proteins,increased significantly during the exponential growth phase,and then remained relatively constant during the stationary phase.【Conclusion】The experimental results show that laser tweezers Raman spectroscopy can monitor the content of bio-macromolecules in real time and serve as an efficient tool for analyzing the changes in metabolic states of microorganisms at single cell level.

Key words:Staphylococcus aureus,Raman spectroscopy,laser tweezers,single cell analysis

中圖分類號：O657.37

文獻標識碼：A

文章編號：1005-9164(2016)01-0031-04

作者簡介：陶站華(1971-)，男，副研究員，主要從事生物光譜學研究。

收稿日期：2015-09-25

*廣西自然科學基金項目(2014GXNSFAA118193)和廣西科學院基本科研業(yè)務費項目(15YJ22SL08)資助。

廣西科學Guangxi Sciences 2016,23(1):31～34

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-15

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1511.018.html