纖維微菌海藻糖合成酶基因克隆表達(dá)及酶學(xué)特性鑒定*

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纖維微菌海藻糖合成酶基因克隆表達(dá)及酶學(xué)特性鑒定*

0引言

【研究意義】海藻糖舊稱繭蜜糖和覃糖，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、藻類、植物和無脊椎動物當(dāng)中[1-2]。海藻糖在許多生物中起到維持滲透壓、保護(hù)體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸及生物膜的作用[3-5]，對在高溫、干燥、冷凍、高滲甚至是輻射等極端條件下維持生命的存在起到關(guān)鍵作用，所以被稱為“生命之糖”[1]。海藻糖的優(yōu)異特性使得它在食品、化妝品、醫(yī)藥、保健品等諸多行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[6-9]，隨著海藻糖研究的推進(jìn)，海藻糖將具有更為廣闊的應(yīng)用前景。【前人研究進(jìn)展】海藻糖合成酶可以將麥芽糖通過一步轉(zhuǎn)化作用生成海藻糖，用其制備海藻糖較其他方法具有原料低廉、轉(zhuǎn)化率較高等諸多優(yōu)勢[10-11]。自從在1995年被日本的Nishimoto等[12-13]首次在Pimelobacter sp.R48中發(fā)現(xiàn)，海藻糖合成酶便成為世界各國科學(xué)家積極深入研究的對象?，F(xiàn)已從多種生物中克隆到海藻糖合成酶基因，其中大部分來自細(xì)菌[14]。【本研究切入點】多數(shù)海藻糖合成酶最適反應(yīng)溫度偏低，應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中會造成生產(chǎn)耗能過大、設(shè)備利用率較低等問題，若在偏離生物酶最適作用條件下反應(yīng)則會造成酶活性降低甚至是失活。【擬解決的關(guān)鍵問題】克隆纖維微菌海藻糖合成酶基因(CCTreS)，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)及純化，并對重組酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

纖維微菌(Cellulosimicrobium cellulans)、克隆宿主Escherichia coli Trans10、表達(dá)宿主Escherichia coli BL-21(DE3)及表達(dá)載體pSE380均由本實驗室保藏，pMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2酶和主要試劑

DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等分子生物學(xué)工具酶購自寶生物工程(大連)有限公司和東洋紡(上海)生物科技有限公司；IPTG購自Gibco公司；鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)購自Phamacia公司；果糖、葡萄糖、麥芽糖、海藻糖均為色譜純Sigama公司產(chǎn)品；乙腈購自Fisher公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1CCTreS保守區(qū)的擴(kuò)增

在Genbank數(shù)據(jù)庫中檢索到纖維微菌屬的Cellulosimicrobium cellulans J36和Cellulosimicrobium cellulans LMG 16121等幾種菌的假定的海藻糖合成酶基因，將其與其它幾種海藻糖合成酶基因進(jìn)行blast分析，根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計引物P1：5′-GCACCGCTTCTTCTCCCACC-3′；P2：5′-CGACGCACAGGATCGTCTCC-3′，以纖維微菌總DNA為模板擴(kuò)增海藻糖合成酶基因保守區(qū)。PCR體系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 4 μL，引物P1(10 μmol/L) 1 μL，引物P2(10 μmol/L) 1 μL，纖維微菌總DNA(100 ng/μL) 1 μL，PrimeSTAR DNA Polymerase(2.5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O 補至50 μL。PCR程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物送測序。

1.2.2反向PCR擴(kuò)增保守區(qū)外未知區(qū)域

(1) 酶切處理纖維微菌總DNA

根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中Cellulosimicrobium cellulans J36的全基因測序結(jié)果，查找到位于海藻糖合成酶基因3′端下游位置的KpnⅠ酶切位點，KpnⅠ完全酶切后包含有保守區(qū)的目的片段大小約為2 kb。采用KpnⅠ對纖維微菌總DNA進(jìn)行充分酶切，37℃下反應(yīng)36 h(中間補加兩次酶)，盡量酶切充分。

(2)連接

將酶切純化后的DNA用T4連接酶在16℃條件下連接過夜。

(3) 反向PCR

根據(jù)保守區(qū)測序結(jié)果，分別在擴(kuò)增到的保守區(qū)核苷酸序列212，826，114，864位點設(shè)計兩對反向引物：上游P3：5′-CGGCCACTGGTTCGCCTCGGCG-3′；下游P4:5′-GACGTCGCTGCTGCACTGGGTG-3′；上游P5：5′-TCTCGCAGTTGGTGCCCTCGGC-3′；下游P6：5′-CCGCTCGACTGCGACAACCAGT-3′。以(2)中連接產(chǎn)物為模板，用引物P3、P4進(jìn)行第一次PCR，回收第一次PCR產(chǎn)物做模板，以引物P5、P6進(jìn)行第二次PCR，第二次PCR目的是為了驗證第一次PCR是否擴(kuò)增到含有未知區(qū)域的DNA片段(圖1)。PCR體系：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L) 4 μL，引物a(10 μmol/L) 1 μL，引物b(10 μmol/L) 1 μL，模板DNA 1 μL，KOD DNA Polymerase (2.5 U/μL) 0.5 μL，DMSO 4 μL，甲酰胺 2 μL，ddH2O 31.5 μL。PCR程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。反向擴(kuò)增成功后，將PCR產(chǎn)物送測序。

圖1反向PCR示意圖[15]

Fig.1The process of inverse PCR

1.2.3CCTreS完整ORF的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)來源于Cellulosimicrobium cellulans J36的海藻糖合成酶基因和1.2.2節(jié)的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果設(shè)計CCTreS的上游和下游引物，在上游引物添加酶切位點EcoRⅠ(下劃線部分)，并在起始密碼子后添加6個組氨酸，即P7：5′-CTGAATTCATGCACCATCATCATCATCATGTGACGTTCCCGCGCG ACGCTGCACCGGTC-3′；在下游引物添加酶切位點HindⅢ(下劃線部分)，即 P8：5′-ACAAAGCTTTCACGCGGGGTCGTGCACGAC-

GAGC-3′。以纖維微菌總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 4 μL，引物P7(10 μmol/L) 1 μL，引物P8(10 μmol/L) 1 μL，纖維微菌總DNA(100 ng/μL) 1 μL，PrimeSTAR DNA Polymerase(2.5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O 補至50 μL。程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證后膠回收純化，產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后與表達(dá)載體pSE380連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans10感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組質(zhì)粒pSE380-CCTreS并送測序。

1.2.4重組蛋白表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pSE380-CCTreS轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21(DE3)，37℃培養(yǎng)至OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，20℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h后離心收集菌體。用10 mL Lysis Buffer(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH值為8.0)重懸，超聲波破碎細(xì)胞，破碎條件：工作功率200 W，工作時間7 s，間歇時間10 s，總共時間20 min，4℃。破碎完成后，4℃條件下充分離心，收集上清液即為粗酶液，將粗酶液利用鎳柱親和層法進(jìn)行純化。采用10% SDS-PAGE檢測純化效果，蛋白質(zhì)含量檢測參照Bradford法[16]。

1.2.5重組蛋白酶活力的測定

稀釋適當(dāng)倍數(shù)的純酶10 μL加入190 μL 2%(W/V)的麥芽糖底物中，在一定溫度下反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10 min終止反應(yīng)，去除固體雜質(zhì)后HPLC檢測海藻糖含量。HPLC檢測條件：柱溫24℃，柱壓60 bar，流動相成分為乙腈∶水=79∶21(V/V)，流速1 mL/min。所有實驗數(shù)據(jù)測定均為3個平行實驗。酶活力單位(U)：在特定條件下1 min生成1 μmol海藻糖所需要的酶量為一個活力單位。

1.2.6溫度和pH值對酶活力的影響

溫度的影響：在pH值為7.0的環(huán)境下，以濃度2%的麥芽糖為底物，分別在25～60℃(每隔5℃為一個梯度)條件下反應(yīng)30 min，HPLC測定酶活力，以酶活力最高者為100%，繪制相對酶活力曲線。

pH值的影響：在最適反應(yīng)溫度下，分別在pH值為4.0～9.0(pH值每隔0.5為一個梯度)條件下反應(yīng)30 min，HPLC測定酶活力，以酶活力最高者為100%，繪制相對酶活力曲線。

1.2.7酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性：將純酶分別置于25～60℃(每隔5℃為一個梯度)條件中保溫1 h，在酶的最適反應(yīng)溫度和pH值下反應(yīng)30 min，HPLC測定酶活力，以4℃保存的酶在最適條件下的酶活力為對照，計算相對酶活力。

pH穩(wěn)定性：將酶分別置于pH值為4.0～9.0(pH值每隔0.5為一個梯度)環(huán)境中4℃保存24 h，然后在酶的最適反應(yīng)溫度和pH值下反應(yīng)30 min，HPLC測定酶活力，以未處理的酶做對照，計算每個梯度下的相對酶活力。

1.2.8金屬離子和化學(xué)試劑對酶活力的影響

在酶反應(yīng)體系中添加終濃度為5 mmol/L的金屬離子Ca2+、Mg2+、Fe3+、Ba2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、K+、Co2+、Cu2+以及5 mmol/L的SDS、DTT和10 mmol/L的EDTA，在酶的最適反應(yīng)溫度和pH值下反應(yīng)30 min，HPLC測定酶活力，以不含有金屬離子和化學(xué)試劑的反應(yīng)作為對照，計算各個條件下的相對酶活力。

1.2.9重組酶水解麥芽糖的產(chǎn)物組成分析

以2%(W/V)的麥芽糖為底物，分別在25℃、35℃、45℃及最適pH值條件下反應(yīng)48 h，分別于20 min，40 min，1 h，1.5 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，24 h，36 h，48 h取樣并采用HPLC檢測分析產(chǎn)物變化。

1.2.10底物特異性的研究

酶在最適條件下分別與濃度為2%(W/V)的海藻糖、纖維二糖、果糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽三糖、普魯蘭糖、海藻酮糖、山梨糖、糊精、淀粉反應(yīng)36 h，HPLC檢測產(chǎn)物。

2結(jié)果與分析

2.1目的基因CCTreS的克隆

成功克隆出目的基因CCTreS的保守區(qū)，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計兩對反向PCR引物P3和P4、P5和P6。引物P3與引物P5間距為98 bp，引物P4與引物P6間距為38 bp。如圖2所示，第一次PCR擴(kuò)增得到大小約為1.3 kb的條帶；第二次PCR擴(kuò)增獲得大小約為1.2 kb的條帶。兩次PCR的結(jié)果相差大小符合兩對引物間的距離，表明反向PCR擴(kuò)增到保守區(qū)以外的未知區(qū)域獲得成功。

M1:λDNA/HindⅢ DNA Marker；1:The inverse PCR product of the first time；2:The inverse PCR product of the secend time；M2:W2003 DNA Marker

圖2反向PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析

Fig.2Agarose gel eletrophoresis analysis of inverse PCR product

2.2CCTreS完整ORF的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

成功擴(kuò)增到大小約為1.8 kb的CCTreS完整ORF，并用于構(gòu)建重組質(zhì)粒pSE380-CCTreS。雙酶切驗證結(jié)果顯示出兩條帶，大小分別為1.8 kb和4.3 kb左右(圖3)，這分別與目的基因和pSE380載體大小一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M1:λDNA/HindⅢ DNA Marker；1:CCTreS gene；

2:pSE380-CCTreSdigested with EcoRⅠ and HindⅢ；

M2:W2003 DNA Marker

圖3pSE380-CCTreS重組質(zhì)粒的雙酶切驗證

Fig.3Verification of recombinant plasmid pSE380-CCTreSdigested with EcoRⅠ and HindⅢ

2.3重組酶CCTreS的表達(dá)純化

如圖4所示，粗酶液經(jīng)純化得到大小略微小于66 kDa的單一條帶，表明CCTreS在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)成功，且蛋白純度較高，適合進(jìn)行下一步酶學(xué)性質(zhì)分析。

M1:Protein molecular weight marker；1:Recombinant enzyme purified on nickel column；2:Recombinant strain E.coli BL-21(DE3) containing pSE380-CCTreS；3:Recombinant strain E.coli BL-21(DE3) containing pSE380

圖4表達(dá)產(chǎn)物CCTreS的SDS-PAGE檢測分析

Fig.4SDS-PAGE analysis of recombinant CCTreS

2.4最適溫度和熱穩(wěn)定性

由圖5可知，重組酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，在35℃和40℃具有80%以上相對酶活力，60℃時酶活力不足10%。重組酶在25～35℃保存1 h后仍具有90%以上的相對酶活力，在60℃保存1 h后基本失活。

2.5最適pH值和pH穩(wěn)定性

由圖6可知，重組酶最適反應(yīng)pH值為7.0，當(dāng)pH值為5.0～7.5時，相對酶活力在75%以上，當(dāng)pH 值小于5.0或大于9.0時，相對酶活力在40%以下；重組酶在pH值為7.0環(huán)境中酶活最高，穩(wěn)定性最好，在pH值為5.5～8.5環(huán)境中穩(wěn)定性也較好，相對酶活力在80%以上。

圖5溫度對CCTreS酶活力影響及熱穩(wěn)定性

Fig.5Effect of temperature on the activity and stability of CCTreS

圖6pH值對CCTreS酶活力的影響及pH穩(wěn)定性

Fig.6Effect of pH on the activity and stability of CCTreS

2.6金屬離子和化學(xué)試劑對重組酶酶活力的影響

由圖7可知，所用金屬離子和化學(xué)試劑對重組酶均沒有激活作用。Cu2+和Co2+對重組酶抑制作用明顯，Ca2+、Mg2+、Ni2+以及5 mmol/L的SDS、DTT和10 mmol/L的EDTA均對重組酶有輕微抑制作用，F(xiàn)e3+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、K+對酶活力的影響不大。

圖7金屬離子和化學(xué)試劑對CCTreS酶活力的影響

Fig.7Effect of metal ions and reagents on CCTreS enzyme activity

2.7產(chǎn)物分析

由圖8～10可知，在最適溫度45℃反應(yīng)1.5 h,海藻糖產(chǎn)物含量達(dá)到最大值，但僅有45.82%，而在25℃和35℃條件下海藻糖最高含量分別能達(dá)到68.18%和59.21%，可見以麥芽糖為底物生產(chǎn)海藻糖的最高轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高而減?。辉诜磻?yīng)48 h內(nèi)，副產(chǎn)物葡萄糖的含量一直呈現(xiàn)增長狀態(tài)，分別于25℃、35℃和45℃條件下反應(yīng)48 h，葡萄糖的含量分別達(dá)到46.81%，79.32%和94.01%，這說明海藻糖合成酶的水解作用會一直伴隨整個反應(yīng)進(jìn)程，溫度越高水解作用越明顯，副產(chǎn)物葡萄糖生成速度越快，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，海藻糖產(chǎn)物含量達(dá)到最大值后逐漸降低，而葡萄糖的含量則逐漸增加。

圖825℃條件下CCTreS水解麥芽糖的產(chǎn)物組成分析

Fig.8Analysis of reaction time at 25℃ on the product composition of CCTreS

圖935℃條件下CCTreS水解麥芽糖的產(chǎn)物組成分析

Fig.9Analysis of reaction time at 35℃ on the product composition of CCTreS

圖1045℃條件下CCTreS水解麥芽糖的產(chǎn)物組成分析

Fig.10Analysis of reaction time at 45℃ on the product composition of CCTreS

2.8底物特異性的研究

由表1可知重組酶除了能催化麥芽糖反應(yīng)外，還可以與海藻糖和蔗糖反應(yīng)，但是催化蔗糖的反應(yīng)是以水解作用為主，生成海藻酮糖的活力非常弱。

表1重組酶對不同底物的作用

Table 1Recombinant enzyme reaction with different substrates

底物Substrate對底物作用Effectonthesubstrate主要產(chǎn)物Mainproduct麥芽糖Maltose+海藻糖Trehalose海藻糖Trehalose+麥芽糖Maltose蔗糖Sucrose+果糖、葡萄糖Fructose,glucose果糖Fructose-葡萄糖Glucose-乳糖Lactose-淀粉Starch-糊精Dextrin-山梨糖Sorbose-麥芽三糖Maltotriose-海藻酮糖Trehalulose-普魯蘭糖Pullulan-纖維二糖Cellbiose-

注：+表示能作用；-表示不能作用

Note：+，work on substrate；-，do not work on substrate

3結(jié)論

本研究成功從纖維微菌克隆到海藻糖合成酶基因，并在大腸桿菌中實現(xiàn)高效表達(dá)。重組酶CCTreS的最適反應(yīng)溫度為45℃，最適pH值為7.0，在50℃以下及pH 值為4.5～9.0時具有較好的穩(wěn)定性。Cu2+對酶活力的抑制作用較為明顯，暫時沒有找到對酶活力有激活作用的金屬離子和化學(xué)試劑。CCTreS屬于中溫酶，但是在最適反應(yīng)溫度45℃條件下，海藻糖最高得率只有45%左右，水解作用較為明顯，需要進(jìn)行分子改造以提高其應(yīng)用價值。與其它海藻糖合成酶不同的是，CCTreS轉(zhuǎn)化蔗糖生成海藻酮糖的活力很弱，可以對其進(jìn)行突變，探究轉(zhuǎn)化海藻酮糖的關(guān)鍵位點。

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(責(zé)任編輯：陸雁)

Clonging，Expressionan and Characterization of a Novel Gene Encoding Trehalose Synthase from Cellulosimicrobium cellulans

曹磊1,2，劉滔滔1,2，張宏濤1,2，謝敏1,2，杜麗琴1,2，梁智群1,2，韋宇拓1,2**

CAO Lei1,2，LIU Taotao1,2，ZHANG Hongtao1,2，XIE Min1,2，DU Liqin1,2，LIANG Zhiqun1,2，WEI Yutuo1,2

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，廣西南寧530005)

(1.College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi，530005，China；2.State Key Laboratory for Conservation and Utilizaiton of Subtropical Agro-bioresources，Nanning，Guangxi，530005，China)

摘要：【目的】開發(fā)適用于海藻糖生產(chǎn)的新型海藻糖合成酶。【方法】通過反向PCR技術(shù)，從一株纖維微菌的基因組DNA中獲知海藻糖合成酶基因完整ORF序列，進(jìn)而克隆得到纖維微菌海藻糖合成酶基因(CCTreS)，將其與表達(dá)載體pSE380構(gòu)建重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，通過鎳柱親和層析純化得到純酶并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測定?！窘Y(jié)果】從纖維微菌中克隆并在大腸桿菌中成功表達(dá)海藻糖合成酶基因(CCTreS)。經(jīng)純化獲得的重組酶(CCTreS)在以麥芽糖為底物生成海藻糖時，最適反應(yīng)pH值為7.0，最適反應(yīng)溫度為45℃，40℃保溫1 h仍具有80%以上的相對酶活力，在pH值5.5～8.5保存24 h，相對酶活力仍保留80%以上。Cu(2+)對其有明顯抑制作用?！窘Y(jié)論】該重組酶具有很好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，具有一定的研究價值和潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：海藻糖合成酶纖維微菌反向PCR酶學(xué)性質(zhì)

Abstract:【Objective】A new trehalose synthase was developed for application in industrial production of trehalose.【Methods】The complete ORF sequense of trehalose synthase gene was obtained from Cellulosimicrobium cellulans by inverse-PCR,and then it was amlified by PCR.The recombinant plasmid pSE380-CCTreS was constructed and transformed into Escherichia coli BL-21(DE3).The expressed protein was purified using nickel-nitrilotriacetic acid agarose resin.At last,the enzymatic characteristics of recombinant enzyme were studied.【Results】The trehalose synthase gene(CCTreS) was cloned from Cellulosimicrobium cellulans and successfully expressed in Escherichia coli.The optimum activity for the purified recombinant enzyme to convert maltose into trehalose was at 45℃ and pH 7.0.CCTreS had a good stability and could be reserved above 80% relative activity when it was placed in the environment at 40℃ for an hour or the environment in pH 5.5～8.5 for 24 hours.Cu(2+ )strongly inhibited the enzyme activity.【Conclusion】The recombinant enzyme has good thermal stability and pH stability,which provide certain research value and potential industrial application value.

Key words:trehalose synthase,Cellulosimicrobium cellulans,inverse-PCR,enzymatic characteristics

中圖分類號：Q785,Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-9164(2016)01-0019-06

作者簡介：曹磊(1991-)，男，碩士研究生，主要從事基因工程菌的構(gòu)建及酶工程研究。

收稿日期：2015-11-16

修回日期：2016-02-26

*國家自然科學(xué)基金項目(31160311)和廣西自然科學(xué)基金項目(2012GXNSFAA053051)資助。

**通訊作者：韋宇拓(1971-)，男，教授，主要從事發(fā)酵與酶工程研究，E-mail：weiyutuo@gxu.edu.cn。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(1):19～24

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-15

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1510.002.html