水培法收集甜椒根系分泌物化學(xué)成分鑒定

韓旭，杜公福，牛玉，曹振木（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州，571737)

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水培法收集甜椒根系分泌物化學(xué)成分鑒定

韓旭，杜公福，牛玉，曹振木
（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州，571737)

摘要：采用水培法收集甜椒的根系分泌物，硅膠柱層析法分離根系分泌物，用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）鑒定各組分的化學(xué)成分。研究結(jié)果表明，甜椒根系分泌物石油醚組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)49個(gè)物質(zhì)峰，相似度大于85%的化學(xué)物質(zhì)共35個(gè)；乙酸乙酯組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)62個(gè)物質(zhì)峰，相似度大于85%的化學(xué)物質(zhì)共35個(gè)；氯仿組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)68個(gè)物質(zhì)峰，相似度大于85%的化學(xué)物質(zhì)共28個(gè)；甲醇組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)51個(gè)物質(zhì)峰，相似度大于85%的化學(xué)物質(zhì)共35個(gè)。甜椒根系分泌物中含有烷烴類、酯類、醇類、酚類、醛類、噻唑類、喹啉類、脲類、醋酸鹽類、胺類化合物。

關(guān)鍵詞：甜椒；根系分泌物；化學(xué)成分；鑒定；水培法

科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（1630032014020）韓旭（1983-），女，博士，助理研究員，主要從事蔬菜栽培生理生態(tài)研究，電話：0898-23301285，

E-mail：hanxu_0216@126.com

曹振木（1972-），男，通信作者，研究員，本科，碩士生導(dǎo)師，主要從事蔬菜作物遺傳育種研究，

電話：0898-23300308，E-mail：caozhenmu2007@163.com

根系分泌物是復(fù)雜的非均一體系，通常指在特定的環(huán)境下，活體植物根系的不同部位釋放到根際環(huán)境中有機(jī)化合物的總稱[1]。根系分泌物所含的有機(jī)化合物一般在200種以上，分為3類，一類是大分子化合物，主要包括糖、蛋白質(zhì)、酶和凝膠等；一類是小分子化合物，主要包括酸、酚、酮等；一類是生長激素、黃酮、甾類等[2]。植物根系分泌物在土壤結(jié)構(gòu)組成、養(yǎng)分活化、植物養(yǎng)分吸收和緩解環(huán)境脅迫等方面具有重要作用[3～5]，所以對根系分泌物的研究越來越引起重視。水培收集法應(yīng)用廣泛，操作簡單，在一定程度上反映某些特定根系分泌物的變化，并排除土壤微生物的干擾[6]。氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀是鑒定植物根系分泌物化學(xué)成分的常用方法，具有需樣量小、靈敏度高、健全數(shù)據(jù)庫比對等特點(diǎn)。因此，采用水培法和氣質(zhì)聯(lián)用法分離鑒定植物根系分泌物的化學(xué)成分是切實(shí)可行的，對于解決連作障礙問題具有重要意義。

甜椒（Capsicum fructescens L.)，俗稱燈籠椒、柿子椒，是茄科辣椒屬辣椒的一個(gè)變種，廣泛種植于我國南北各地，營養(yǎng)豐富，特別是VC含量位居各類蔬菜之首，深受廣大消費(fèi)者喜愛[7，8]。但栽培管理制度的不合理及生產(chǎn)環(huán)境的局限性等因素導(dǎo)致甜椒連作障礙日益加劇，嚴(yán)重影響辣椒生長發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量形成，根系分泌物的逐年累積是導(dǎo)致連作障礙的重要因素。因此，本研究通過水培法收集甜椒的根系分泌物，采用硅膠柱層析法分離和GCMS鑒定根系分泌物的化學(xué)成分，為甜椒根系分泌物的深入研究提供理論基礎(chǔ)，對減緩甜椒的連作障礙具有重要指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試甜椒品種為熱甜5號，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所瓜菜研究室提供。

1.2試驗(yàn)方法

①甜椒根系分泌物的收集采用水培法收集甜椒的根系分泌物。將石英砂高溫高壓滅菌，70℃烘干備用，然后將催芽后的熱甜5號種子播于含有石英砂的培養(yǎng)箱中，待第1片真葉展開，向培養(yǎng)箱中注入過量蒸餾水，慢慢拔出辣椒幼苗，盡量不傷根系，留待種植于水培裝置的培養(yǎng)箱中。用培養(yǎng)箱、泡沫板和通氣泵自制辣椒水培裝置，將Hoagland營養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中，用量是培養(yǎng)箱容積的2/3。在泡沫板上均勻打小孔，然后將辣椒幼苗定植于小孔中，懸浮于培養(yǎng)箱中。室內(nèi)人工光照培養(yǎng)，適時(shí)通氣。每5 d收集1次含根系分泌物的營養(yǎng)液并補(bǔ)充新的營養(yǎng)液，共收集7次，混合各收集液并通過雙層定性濾紙過濾和0.45 μm的水系微孔濾膜抽濾，即得到根系分泌物粗提物。用濾紙拭干甜椒根系并稱質(zhì)量，減壓濃縮到30.0 g/L，即得到辣椒根系分泌物粗提物的原液。

圖1　甜椒根系分泌物石油醚組分GC-MS鑒定結(jié)果

表1　甜椒根系分泌物石油醚組分化學(xué)成分分析

②甜椒根系分泌物化學(xué)成分的分離將50 mL甜椒根系分泌物粗提物原液與5 g硅膠（BDH 200～300目)混勻，40℃水浴蒸干，作為提取物。用石油醚（60～90℃)和100 g硅膠（BDH 200～300目)填充色譜柱（200 mm×30 mm)，靜置過夜。將提取物置于色譜柱頂端，根據(jù)有機(jī)溶劑極性按照從小到大的順序，分別用500 mL石油醚、乙酸乙酯、氯仿和甲醇逐級洗脫，流速控制在1～2 s/滴。分別收集各洗脫液，40℃減壓濃縮至干，并溶于10 mL甲醇（色譜純)，-20℃冰箱保存，進(jìn)一步鑒定化學(xué)成分。

③甜椒根系分泌物化學(xué)成分的鑒定采用氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（ThermoFisher GC-MS，Trace GC ultra-DSQ-AI3000，USA)鑒定甜椒根系分泌物的化學(xué)成分。GC-MS分析條件如下。

a.色譜條件。毛細(xì)管柱DB5-MS（30m×0.25mm，膜厚度0.25μm)；載氣He（流速1.0mL/min)；進(jìn)樣口溫度250℃；程序升溫：柱溫50℃（保持2 min)，以6℃/ min程序升溫至250℃（保持15 min)。

b.質(zhì)譜條件，離子源溫度200℃；EI源（電子轟擊源)；轟擊電壓70 eV；掃描范圍m/z 30～600 amu；1 μL進(jìn)樣，不分流。

c.化學(xué)成分的篩選。根據(jù)數(shù)據(jù)庫篩選的結(jié)果，選擇相似度≥85%的化合物為中椒105根系分泌物的有效化學(xué)成分。

圖2　甜椒根系分泌物乙酸乙酯組分GC-MS鑒定結(jié)果

表2　甜椒根系分泌物乙酸乙酯組分化學(xué)成分分析

2　結(jié)果與分析

2.1石油醚組分GC-MS鑒定結(jié)果

由圖1可見，共出現(xiàn)49個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為6.589 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為49.074 min，主要出峰時(shí)間集中在27～36 min，最大峰面積出現(xiàn)在30.272 min。

如表1所示，熱甜5號根系分泌物石油醚組分中相似度大于85%的化合物共有35個(gè)，其中烷烴類化合物6個(gè)、酯類化合物18個(gè)、醇類化合物4個(gè)，酚類化合物3個(gè)、噻唑類化合物1個(gè)、酰胺類化合物3個(gè)。

2.2乙酸乙酯組分GC-MS鑒定結(jié)果

由圖2可見。共出現(xiàn)62個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為7.244 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為47.553 min，主要出峰時(shí)間集中在28～39 min，最大峰面積出現(xiàn)在30.291 min。

如表2所示，熱甜5號根系分泌物乙酸乙酯組分中相似度大于85%的化合物共有35個(gè)，其中烷烴類化合物13個(gè)、酯類化合物11個(gè)、酚類化合物1個(gè)、醇類化合物3個(gè)、胺類化合物5個(gè)、醋酸鹽類化合物2個(gè)。

圖3　甜椒根系分泌物氯仿組分GC-MS鑒定結(jié)果

2.3氯仿組分GC-MS鑒定結(jié)果

由圖3可知，共出現(xiàn)68個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為7.305 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為46.784 min，主要出峰時(shí)間集中在30～41 min，最大峰面積出現(xiàn)在40.659 min。

熱甜5號根系分泌物氯仿組分相似度大于85%的化合物共有28個(gè)（表3)，其中酯類化合物10個(gè)、醛類化合物1個(gè)、酚類化合物3個(gè)、喹啉類化合物1個(gè)、烷烴類化合物7個(gè)、醇類化合物2個(gè)、胺類化合物2個(gè)、脲類化合物1個(gè)、醋酸鹽類化合物1個(gè)。

2.4甲醇組分GC-MS鑒定結(jié)果

由圖4可知，共出現(xiàn)51個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為6.050 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為46.767 min，主要出峰時(shí)間集中在27～41 min，最大峰面積出現(xiàn)在40.485 min。

熱甜5號根系分泌物甲醇組分相似度大于85%的化合物共有35個(gè)（表4)，其中酯類化合物18個(gè)、噻唑類化合物1個(gè)、酚類化合物3個(gè)、烷烴類化合物6個(gè)、醇類化合物4個(gè)、酰胺類化合物3個(gè)。

3　討論與結(jié)論

表3　甜椒根系分泌物氯仿組分化學(xué)成分分析

對辣椒根系分泌物的收集通常采用水培的方法[9，10]，雖然水培植物的根毛發(fā)育較少，缺乏土壤的機(jī)械阻力，與植物在土壤中生長分泌的物質(zhì)略有不同，但也能反映根系分泌物中的化學(xué)成分，能夠排除土壤微生物對其的干擾。因此，本研究采用水培法對甜椒的根系分泌物進(jìn)行收集，既保證了甜椒的正常生長，又很好地消除了其他植物或土壤微生物對根系生長的干擾。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，水培法收集的甜椒根系分泌物中主要含有烷烴類、酯類、醇類、酚類、醛類、噻唑類、喹啉類、脲類、醋酸鹽類、胺類化合物。前人研究結(jié)果表明，線椒根系分泌物中主要含有酸類、酮類、胺類、酯類、醇類、酚類、烴類、苯及其他雜環(huán)類物質(zhì)[9]；大白菜根系分泌物中主要含有烷烴類、酸類、酯類物質(zhì)[11]；油菜根系分泌物中主要含有烷烴類、醇類、酯類、酸類物質(zhì)[12]；大豆根系分泌物中含有烷烴類、醇類、酸類、酚類、醛類、酯類化合物[13，14]；花生根系分泌物中含有有機(jī)酸、醇類、醛類、酮類、烴類、酯類物質(zhì)[15]；人參根系分泌物中主要含有烷烴類、酯類、酸類物質(zhì)[16]；丹參根系分泌物中主要含有烷烴類、醇類、酸類、酯類、醛類物質(zhì)[17]；低效刺槐根系分泌物中主要含有酸類、酯類、醇類物質(zhì)[18]。本研究結(jié)果與其基本一致，不同作物根系分泌物含有不同種類的化學(xué)成分。

圖4　甜椒根系分泌物甲醇組分GC-MS鑒定結(jié)果

表4　甜椒根系分泌物甲醇組分化學(xué)成分分析

已有研究表明，植物釋放到環(huán)境中的化感物質(zhì)可分為14大類，包括有機(jī)酸、脂肪族醛和酮、直鏈醇、長鏈脂肪酸和多炔、簡單不飽和內(nèi)酯、苯甲酸及其衍生物、萘醌、蒽醌和復(fù)合醌、肉桂酸及其衍生物、簡單酚、香豆素類、類萜和甾類化合物、類黃酮、單寧、生物堿和氰醇、硫化物和芥子油苷、氨基酸和多肽、嘌呤和核苷[19～22]。本研究中水培甜椒根系分泌物中也可能含有化感物質(zhì)，逐年累積產(chǎn)生化感自毒作用，導(dǎo)致連作障礙的發(fā)生，但哪些化學(xué)成分是化感物質(zhì)，起到化感自毒作用，還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]吳林坤，林向民，林文雄.根系分泌物介導(dǎo)下植物-土壤-微生物互作關(guān)系研究進(jìn)展與展望[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，38（3)：298-310.

[2]陳龍池，廖利平，汪思龍，等.根系分泌物生態(tài)學(xué)研究[J].生態(tài)學(xué)雜志，2002，21（6)：57-62.

[3]Guo T R,Zhang G P,Zhou M X,et al.Influence of aluminum and cadumium stresses on mineral nutrition and root exudates in two barley cultivars[J].Pedosphere,2007,17(4):505-512.

[4]Xie MJ,Yan C L,Ye J.Effect of phenanthrene on the secretion oflowmolecule weight organic compounds by rye grass root[J].EcologyandEnvironment,2008,17(2):576-579.

[5]Zeng F,Chen S,Miao Y,et al.Changes of organic acid exudation and rhizosphere pH in rice plants under chromium stress[J].Environmental Pollution,2008,155(2):284-289.

[6]涂書新，吳佳.植物根系分泌物的研究方法評述[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，19（9)：2 493-2 500.

[7]劉凱歌，宋云鵬，龔繁榮，等.高溫脅迫對甜椒幼苗生長和生理生化指標(biāo)的影響[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（3)：63-67.

[8]孫克香，楊莎，郭峰，等.高溫強(qiáng)光脅迫下外源鈣對甜椒（Capsicum fructescens L.)幼苗光合生理特性的影響[J].植物生理學(xué)報(bào)，2015，51（3)：280-286.

[9]謝振華，趙尊練，武國平，等.線辣椒不同生育階段根系分泌物的組分分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（8)：175-181，206.

[10]張婷玉，林多，楊延杰.辣椒根系分泌物的收集方法研究[J].北方園藝，2014（12)：14-17.

[11]張照然，范黎明，吳毅歆，等.大白菜根系分泌物的GCMS分析[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25（9)：75-77.

[12]張紅，高亞軍，安蓉.油菜根系分泌物的GC-MS檢測方法研究[J].農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2014，31（3)：290-295.

[13]馬鳳鳴，王安娜，吳蕾，等.大豆根系分泌物的鑒定及PAL1，PAL2，C4H的克隆[J].作物雜志，2011（2)：65-71.

[14]吳泉.分析大豆根系分泌物并檢測其化感作用[J].河南科技，2013（5X)：213-221.

[15]李忠，江立庚，唐榮華，等.花生根系分泌物的鑒定和化感作用研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36（5)：48-53.

[16]張愛華，彭洪利，雷鋒杰，等.人參根系分泌物的提取與鑒定[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，42（7)：1-6.

[17]楊先國，劉塔斯，陳斌，等.丹參根際土壤浸提物的GCMS分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（10)：173-177.

[18]石鑫，魏天興，陳玨，等.低效刺槐林根系分泌物的GCMS分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（8)：135-137.

[19]Kong C H,Wang P,Xu X H.Allelopathic interference of Ambrosia trifida with wheat(Triticum aestivum)[J].Agr Ecosyst Environ,2007,119(3-4):416-420.

[20]Wang P,Liang W J,Kong C H.Allelopathic potentials of volatile allelochemicals ofAmbrosia trifida L.on other plants[J].Allelopathy J,2005,15(1):131-136.

[21]Tamura Y,Hattori M,Konno K,et al.Triterpenoid and caffeic acid derivatives in the leaves of ragweed,Ambrosia artemisiifolia L.(Asterales:Asteraceae),as feeding stimulants of Ophraella communaLeSage(Coleoptera:Chrysomelidae)[J].Chemoecology,2004,14(2):113-118.

[22]Blmu U.Allelopathic interactions involving phenolic acids[J].J Nematol,1996,28(3):259-267.

Chemical Components Identification on Root Exudates of Capsicum fructescens L.by Nutrient Solution Culture

HAN Xu,DU Gongfu,NIU Yu,CAO Zhenmu
(Tropical Crops Genetic Resources Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Danzhou,Hainan 571737)

Abstract:In the paper,we collected root exudates of Capsicum fruclescens L.by nutrient solution culture,and isolated root exudates by column chromatography,then identified the chemical components of root exudates by GC-MS.The results showed that,there were 49,62,68 and 51 peaks in GC-MS chromatograms of petroleum ether,ethyl acetate,chloroform and methanol extractions of root exudates of C.fructescens L.separately,and there were 35,35,28 and 35 chemical substances with similarity over 85% correspondingly.The root exudates ofC.fructescens L.were composed of alkane,esters,alcohols,phenols,aldehydes,thiazoles,chinolines,ureas,acetate and amine compounds.

Key words:Capsicum fructescens L.;Root exudates;Chemical component;Identification;Nutrient solution culture

收稿日期：2015-10-20

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金（20153119）；中央級公益性

DOI:10.3865/j.issn.1001-3547.2016.04.020

中圖分類號：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-3547（2016)04-0047-06