乳清蛋白肽對自然衰老小鼠抗氧化效果及腦內(nèi)乙酰膽堿脂酶的影響

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030）

乳清蛋白肽對自然衰老小鼠抗氧化效果及腦內(nèi)乙酰膽堿脂酶的影響

齊微微，卞輯，于廣吉，姚宇秀，郭佩佩，王艷菲，于國萍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030）

利用堿性蛋白酶水解制得的乳清蛋白肽（W PP），以青年小鼠、自然衰老的小鼠和灌胃腦復(fù)康的自然衰老的小鼠作對照，以灌胃低中高劑量乳清蛋白肽即100，200和400mg/(kg·d)自然衰老的小鼠為實驗組，通過體內(nèi)抗氧化指標(biāo)（SOD、MDA、GSH-Px、蛋白質(zhì)羰基）和腦內(nèi)乙酰膽堿脂酶來研究乳清蛋白肽對自然衰老的小鼠抗氧化效果及乙酰膽堿脂酶活力的影響，并探究WPP對老齡小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。灌胃乳清蛋白肽自然衰老小鼠的SOD和GSH-Px活性顯著增加，MDA和蛋白質(zhì)羰基濃度顯著降低，同時乙酰膽堿脂酶的活性也有所降低，高劑量組與腦復(fù)康對照組結(jié)果相近；實驗結(jié)果表明乳清蛋白肽能顯著提高自然衰老小鼠抗氧化能力，并能調(diào)節(jié)腦組織乙酰膽堿酯酶的活性，提高衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能。

乳清蛋白肽；自然衰老的小鼠；體內(nèi)抗氧化；乙酰膽堿脂酶

0 引 言

近年來，生物活性肽以其吸收快和生物活性方面的優(yōu)勢已成為蛋白質(zhì)營養(yǎng)研究的熱點之一。而乳源性活性肽以其獨特的營養(yǎng)價值備受關(guān)注[1]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白的水解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量主要分布在300～1400，并且絕大部分集中在1000以下[2-3]?，F(xiàn)有研究顯示，乳清蛋白水解可得到清除羥自由基的小肽[4-5]；Nagaoka S用胰蛋白酶水解乳清蛋白，成功的分離出一種能夠降低血清膽固醇的五肽[6]；人們還從乳清蛋白的胰凝乳蛋白酶水解物分離出一種對某些神經(jīng)受體具有抑制功能的活性肽[7,8]。包怡紅[3]，彭新顏[9]等研究了乳清蛋白肽對D-半乳糖衰老模型抗氧化的影響，但是關(guān)于乳清蛋白肽對自然衰老的小鼠抗氧化的影響研究少有報道。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

濃縮乳清蛋白(W PC 80)，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)78.29%，堿性蛋白酶，1.75×105U/g，昆明種雌雄小鼠，SOD試劑盒，MDA試劑盒，GSH-Px試劑盒，蛋白羰基試劑盒，AChE試劑盒，其余所有試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

UVmini-1240紫外可見分光光度計，LD 4-2A型低速離心機，萬能粉碎機，RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3方法

1.3.1 乳清蛋白抗氧化肽的制備

乳清蛋白肽的制備參考文獻(xiàn)[10]的方法，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，對乳清蛋白肽進(jìn)行脫鹽、超濾分離，篩選出抗氧化活性最高的組分（分子量小于3 ku），將其冷凍干燥成粉末，以備下一步實驗。

1.3.2 乳清蛋白肽對各組小鼠的作用

動物飼養(yǎng)：取雌雄昆明種小鼠80只，等量、分籠飼養(yǎng)，自然衰老的小鼠16～18月齡，青年小鼠3月齡，體質(zhì)量（20.0±2.0）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用M orris水迷宮系統(tǒng)篩選，剔除漂在水面上的老齡小鼠，剩余72只。隨機分組（如表1），每組12只，每5天稱1次體重，老年模型組（B）和青年對照組（A）每天灌胃等量生理鹽水。腦康復(fù)對照組（C）灌胃200m g/(kg·d)腦復(fù)康藥片。低、中、高劑量組（D、E、F）灌胃的乳清蛋白肽溶液是由超濾分離出的分子量小于3ku的小分子肽凍干粉配制而成。

表1 動物實驗分組方案

按照上面的方法，連續(xù)喂養(yǎng)30 d后，將小鼠禁食24 h，取血后將其脫頸處死，立即取出腦、心臟、腎臟、肝臟組織，計算其臟器指數(shù)，計算公式為

按相應(yīng)試劑盒說明測定血清、肝、腦組織中的超氧化物歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力、丙二醛（M DA）濃度、蛋白質(zhì)羰基濃度和腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力。

1.4 統(tǒng)計分析

文中數(shù)據(jù)均使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所用數(shù)據(jù)均為三次的平均數(shù)，誤差項為標(biāo)準(zhǔn)誤，單因素方差分析（ANOVA）中采用Duncan檢驗，圖表中標(biāo)有相同字母者為差異不顯著，有不同字母者為差異顯著（P≤0.05）。作圖采用Sigma Plot 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 對各組小鼠臟體比的影響

實驗后摘取各組小鼠的臟器，稱重并計算各臟器指數(shù)，如表2所示。由表2可以看出，與B組相比，A組、C組和乳清蛋白肽劑量組的各臟器指數(shù)均顯著升高，與青A組相比，乳清蛋白肽劑量組的各臟器指數(shù)均顯著降低，與C組相比，乳清蛋白肽中、高劑量組的心臟指數(shù)無顯著性變化，高劑量組的腎指數(shù)無顯著性變化，由此可見，乳清蛋白肽可以使自然衰老小鼠的臟器得到不同程度的修復(fù)。

表2 乳清蛋白肽對各組小鼠心指數(shù)、肝指數(shù)、腎指數(shù)和腦指數(shù)的影響 %

2.2 對各組小鼠血清、肝臟和腦內(nèi)SOD活性的影響

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是重要機體內(nèi)抗氧化酶之一，可以清除自由基，延緩機體衰老。圖1表明，在血清、肝臟和腦組織中，B組的SOD活性顯著低于其它各組，而A組的SOD活性顯著高于其他各組。在血清、肝臟和腦組織中GSH-Px的活性（圖2）與SOD活性的變化相一致；MDA的濃度（圖3）和蛋白羰基濃度（圖4）的變化規(guī)律相反，B組的M DA濃度與蛋白質(zhì)羧基濃度明顯高于其他各組，而A組的則明顯低于其他各組。這表明自然衰老的小鼠體內(nèi)的抗氧化能力降低，通過灌胃乳清蛋白肽或腦復(fù)康藥劑可以提高其抗氧化能力，但是不及青年小鼠自身的抗氧化能力強。

在肝組織中，乳清蛋白肽劑量組的SOD活性高于C組，且各組之間存在顯著性差異；在血清中，乳清蛋白肽D組的的SOD活性顯著低于C組，乳清蛋白肽E、F組顯著高于C組，且兩組之間無顯著性差異；在腦組織中，乳清蛋白肽E組顯著低于腦復(fù)康對照組，高劑量組與腦復(fù)康對照組之間無顯著性差異。由此看來，乳清蛋白肽能夠有效提高衰老小鼠血清、肝組織、腦組織中的SOD活性，且高劑量組效果達(dá)到甚至優(yōu)于腦復(fù)康的效果，說明W PP對衰老小鼠血清、肝和腦的SOD活性具有增強作用，其中血清的SOD活性增強非常顯著，與包怡紅的研究結(jié)果類似[3]。

圖1 各組小鼠血清、肝臟和腦的SOD活性

2.3對各組小鼠血清、肝臟和腦內(nèi)GSH-PX活性的影響

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px)是廣泛存在于機體內(nèi)的一種重要的過氧化物分解酶，可以清除細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的過多的羥自由基和過氧化物，減輕細(xì)胞膜的過氧化作用，GSH同時還能促進(jìn)H2O2分解，從而使過氧化物無法對細(xì)胞膜造成損害[11]，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。在肝臟和腦組織中（圖2），乳清蛋白肽D、E組的GSH-Px活性低于C組，F(xiàn)組高于C組，且各組之間存在顯著性差異，表明隨著乳清蛋白肽劑量的增加，GSH-Px活性逐漸提高，作用越明顯，SOD活性在低中高劑量組的灌胃下的變化（圖1）與GSH-Px活性變化類似，呈現(xiàn)一定劑量依賴關(guān)系；在血清中，乳清蛋白肽各劑量組的GSH-Px活性高于C組，且各組之間存在顯著性差異。由此看來，乳清蛋白肽能夠有效提高衰老小鼠血清、肝組織、腦組織中GSH-Px活性，且高劑量組效果優(yōu)于腦復(fù)康對照組。

圖2 各組小鼠血清、肝臟和腦的GSH-PX活性

2.4 對各組小鼠血清、肝臟和腦內(nèi)MDA濃度的影響

體內(nèi)自由基可以與腦內(nèi)細(xì)胞膜上含量豐富的不飽和脂肪酸相結(jié)合，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成細(xì)胞損傷，同時生成毒性物質(zhì)丙二醛（m alondialdehyde，M DA），M DA能夠影響細(xì)胞代謝及功能、結(jié)構(gòu)的改變，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，抑制生物信息傳遞，降低機體的智力水平和學(xué)習(xí)記憶能力[12,13]。因而測試M DA的量常常可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映機體細(xì)胞的受氧化損傷程度。

在肝、血清和腦組織中，青年對照組的MDA濃度和蛋白羰基顯著低于其余各組（圖3和4），說明腦復(fù)康藥物、乳清蛋白肽的效果目前還達(dá)不到青年小鼠的程度。在肝組織中（圖3），乳清蛋白肽D組的M DA顯著高于C組，E組顯著低于C組，F(xiàn)與C組之間無顯著性差異；在血清和腦組織中，乳清蛋白肽E、F組的M DA顯著低于C組，D組與C組之間無顯著性差異；由此看來，乳清蛋白肽能夠有效降低衰老小鼠血清、肝組織、腦組織中MDA，且中劑量組和高劑量組之間效果基本相同，效果優(yōu)于腦康復(fù)組，表明W PP對動物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物的生成有較強抑制作用，抗氧化作用明顯。

圖3 各組小鼠血清、肝臟和腦的MDA濃度

2.5 對各組小鼠血清、肝臟和腦內(nèi)蛋白羰基濃度的影響

蛋白質(zhì)羰基是蛋白質(zhì)分子被自由基氧化的重要產(chǎn)物之一，通過測定羰基濃度可以判定蛋白質(zhì)受氧化損傷的程度。

在肝臟中，乳清蛋白肽E、F組蛋白羰基濃度顯著低于D組，而二者之間無顯著性差異（圖4）；在血清和腦組織中，乳清蛋白肽三個劑量組的蛋白羰基濃度之間均存在顯著性差異，但均高于C組。由此看來，乳清蛋白肽雖能夠有效降低衰老小鼠血清、肝組織、腦組織中蛋白羰基濃度，防止中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到自由基的損傷，其中高劑量組效果最好，但均未達(dá)到腦復(fù)康對照組的效果。

圖4 各組小鼠血清、肝臟和腦的蛋白羰基濃度

2.6 對各組小鼠腦內(nèi)乙酰膽堿脂酶（AChE）的影響

乙酰膽堿(A c h)是腦內(nèi)的經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì),與認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等大腦高級神經(jīng)功能有關(guān)。學(xué)習(xí)記憶任務(wù)的完成伴隨著腦內(nèi)乙酰膽堿的變化[14]。AChE是Ach的水解酶，它的活力變化可間接反映腦內(nèi)乙酰膽堿含量和代謝情況。衰老小鼠腦組織中AChE活性顯著升高，造成Ach含量不足，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能下降，甚至智力喪失。因此AChE活性的檢測可以作為評價學(xué)習(xí)記憶功能的主要指標(biāo)。

由實驗結(jié)果可知（圖5），在腦組織中，乳清蛋白肽劑量組的AChE活性顯著低于B組，顯著高于A和C組，說明乳清蛋白肽可以通過降低AChE活性而減少Ach的分解，提高腦組織中Ach的含量，在一定程度上改善自然衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

圖5 各組小鼠腦AChE活性

3 結(jié) 論

灌胃乳清蛋白肽的自然衰老小鼠的SOD和GSH-Px活性明顯增加，M DA和蛋白質(zhì)羰基濃度明顯降低，且呈劑量依賴關(guān)系，高劑量組的效果最好，與腦復(fù)康對照組效果相近。但乳清蛋白肽的效果目前還達(dá)不到青年小鼠的程度。

灌胃乳清蛋白肽降低了老齡小鼠腦內(nèi)AChE活性，證明乳清蛋白肽能夠通過降低AChE的活性來降低Ach的分解，但效果不及腦復(fù)康。

乳清蛋白肽能夠清除機體內(nèi)堆積的自由基，阻止自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，減少細(xì)胞的氧化損傷，從而降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的程度，起到延緩衰老，改善學(xué)習(xí)記憶力的作用。乳清蛋白肽或許也可以通過調(diào)節(jié)中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的活動來改善學(xué)習(xí)記憶能力，關(guān)于具體機制還有待進(jìn)一步探討。

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Influence of whey protein antioxidant peptides on antioxidant and AChE of natural aged mice

QI Wei-wei,BIAN Ji,YU Guang-ji,YAO Yu-xiu,GUO Pei-pei,WANG Yan-fei,YU Guo-ping
(College of food science,N ortheast Agricultural University,Harbin 150030，China)

Whey protein peptides were prepared by alkaline protease hydrolysis.Compared with the young mice,natural aged mice and mice treated by piracetam tabletsas as control groups,them ice were given three different doses of WPP,100,200,400mg/(kg·d)respectively as experimental groups.Whey protein peptides were quantified as the vivo antioxidant index(SOD,MDA,GSH-Px and protein carbonyl)and AChE of brain tissue to observe the affect of Antioxidant and the in aged mice,and learning and memory ability.The results showed that after gavage whey protein peptides,SOD and GSH-Px activity in aged mice were significantly increased,MDA and protein carbonyl content were significantly decreased;AChE activity was also decreased.High-dose group has similar results with the piracetam tablets control group. Whey protein peptide can significantly improve antioxidant ability of natural aged m ice,and adjust activity of AChE of brain tissue,therefore improve the ability of learning and cognitive function.

whey protein peptides;natural aged mice;antioxidant;AChE

Q936

：A

：1001-2230（2016）02-0004-04

2015-07-16

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題（2013BAD 18B07-03）。

齊微微（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)。

于國萍