高效毛細(xì)管電泳法快速測(cè)定乳鐵蛋白原料的純度

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特011500）

高效毛細(xì)管電泳法快速測(cè)定乳鐵蛋白原料的純度

劉宇，陳偉，史玉東，李志偉，高增麗，侯慧敏，陳云

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特011500）

建立了動(dòng)態(tài)涂層毛細(xì)管電泳快速檢測(cè)乳鐵蛋白含量的方法。并運(yùn)用該方法對(duì)不同乳鐵蛋白原料的純度進(jìn)行了檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)4種乳鐵蛋白原料的純度分別為乳鐵蛋白A91.05%，乳鐵蛋白B93.62%，乳鐵蛋白C94.38%，乳鐵蛋白D75.81%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.0%，0.8%，1.2%，0.9%。并與供應(yīng)商所提供的原料純度進(jìn)行比較，討論了造成二者之間略微差異的原因。結(jié)果表明，該動(dòng)態(tài)涂層方法能夠有效抑制毛細(xì)管內(nèi)壁對(duì)乳鐵蛋白的吸附，對(duì)于乳鐵蛋白的檢測(cè)及純度的驗(yàn)證十分有效，為此類蛋白的檢測(cè)提供了一種手段。

高效毛細(xì)管電泳；動(dòng)態(tài)涂層；乳鐵蛋白；純度

0 引 言

牛乳鐵蛋白(Lactoferrin，LF)是一種具有多種生物學(xué)功能的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，主要由乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌[1]。其分子量約為80 ku，等電點(diǎn)為8.0± 0.2，結(jié)構(gòu)與血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、血漿或乳漿中的轉(zhuǎn)鐵蛋白很相似，但是Lf的鐵親和能力是他們的260倍[2]。乳鐵蛋白具有許多特殊的生理活性，既能參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，又能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，同時(shí)具有抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能[3]。許多乳制品公司把乳鐵蛋白作為一種重要的功能性原料，添加到嬰幼兒配方奶粉、兒童奶等高附加值的產(chǎn)品中[4，5]。

目前乳鐵蛋白檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法[6]、放射免疫擴(kuò)散法[7]、表明等離子共振技術(shù)[8]、液相色譜法[9]、分光光度法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]。不同的檢測(cè)方法，精確度、檢出限以及成本等條件各有不同。本試驗(yàn)從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，采用動(dòng)態(tài)涂層法處理石英毛細(xì)管柱，為有效防止蛋白質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性、縮短檢測(cè)時(shí)間，降低檢測(cè)成本。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器及試劑

（1）儀器。P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀并配有紫外檢測(cè)器，Millipore Milli-Elix/RiOs型超純水儀，Z-36HK臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，VORTEXGEMIE2漩渦混合器，1875D超聲波清洗機(jī)，精密pH計(jì)，萬分之一天平，未涂層石英毛細(xì)管柱（型號(hào)為Capillary Tubing-50μm I.D，375μm O.D）。

（2）試劑。氫氧化鈉(分析純)，甲醇（色譜純），三羥甲基氨基甲烷（優(yōu)級(jí)純），戊二胺（優(yōu)級(jí)純），十六烷基三甲基溴化銨（優(yōu)級(jí)純），聚乙二醇（優(yōu)級(jí)純），硼酸(優(yōu)級(jí)純)，尿素（分析純），羥丙基甲基纖維素（分析純），乙二胺四乙酸二鈉（分析純），乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（LF≥96%，HPLC）。

（3）乳鐵蛋白原料。乳鐵蛋白A（純度95%），乳鐵蛋白B（純度95%），乳鐵蛋白C（純度95%），乳鐵蛋白D（純度80%）。

1.2 方法

1.2.1 未涂層毛細(xì)管的活化

截取內(nèi)徑為50μm，總長(zhǎng)度為800 mm（有效長(zhǎng)度為700 mm）的未涂層石英毛細(xì)管柱，用色譜級(jí)甲醇沖洗15 m in，去離子水沖洗15 m in，濃度為1 m oL/L的NaOH沖洗15 m in，靜置20 m in，然后用去離子水沖洗15m in。

1.2.2 未涂層毛細(xì)管內(nèi)壁動(dòng)態(tài)涂層過程

（1）動(dòng)態(tài)涂層試劑的配制。用去離子水準(zhǔn)確配制100 m L動(dòng)態(tài)涂層試劑，使得各成分濃度為三羥甲基氨基甲烷200 mm ol/L，戊二胺60 mm ol/L，十六烷基溴化銨120 mm ol/L，聚乙二醇80 mm o l/L，用濃度為0.1 m ol/L的N aOH調(diào)節(jié)pH值至9.0。

（2）緩沖溶液的配制。用去離子水準(zhǔn)確配制100 m L緩沖溶液，使得各成分濃度達(dá)到如下：硼酸50 mm ol/L，尿素6 mo l/L，戊二胺60 mmo l/L，十六烷基溴化銨120 mm ol/L，羥丙基甲基纖維素0.05%，用濃度為0.1 m o l/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.0。

（3）動(dòng)態(tài)涂層。用濃度為0.1 m ol/L的N aOH沖洗毛細(xì)管內(nèi)壁3 m in，去離子水沖洗3 m in，動(dòng)態(tài)涂層試劑沖洗3 m in，靜置5 m in，緩沖溶液沖洗3 m in，按照以上步驟循環(huán)3次。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及原料的測(cè)定

（1）乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取10 m g乳鐵蛋白于2m L塑料離心管中，然后加入1m L去離子水，漩渦振蕩至充分溶解，靜置1 h，然后依次梯度稀釋至5，2.5，1.25，0.625 g/L（均為質(zhì)量濃度）。

（2）檢測(cè)設(shè)備參數(shù)的確定。檢測(cè)器為紫外光檢測(cè)器、檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm，檢測(cè)溫度為30℃，進(jìn)樣方式為壓力進(jìn)樣，壓力為3.448 kPa，進(jìn)樣時(shí)間為15 s，工作電壓為25 kV，采集頻率為8 H z。

（3）進(jìn)樣前毛細(xì)管的處理。新毛細(xì)管首次可直接進(jìn)樣；下次進(jìn)樣前，依次分別用濃度為0.1 m o l/L的NaOH、動(dòng)態(tài)涂層試劑、緩沖溶液清洗3m in后方可進(jìn)樣。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。將不同濃度的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液依次上樣，得到不同濃度下的峰面積，外標(biāo)法定量，建立濃度與峰面積之間對(duì)應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）原料純度的測(cè)定。分別準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為5.0 g/L乳鐵蛋白溶液。在最佳電泳條件下，分別對(duì)樣品中進(jìn)行測(cè)定：每個(gè)樣品待測(cè)液重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算出峰面積平均值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得乳鐵蛋白質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 動(dòng)態(tài)涂層試劑的選擇

緩沖溶液中加入涂層物質(zhì)形成動(dòng)態(tài)涂層時(shí)，可用作選擇的涂層物質(zhì)包括：兩性離子、單胺、低聚胺、表面活性劑、中性的或帶電荷的聚合物[12]。一般地講，這些化合物與毛細(xì)管壁之間有強(qiáng)烈的相互作用，因此可以動(dòng)態(tài)的涂敷在毛細(xì)管表面。添加物的性質(zhì)決定了其與毛細(xì)管壁之間的相互作用可以是庫(kù)侖引力、氫鍵或者范德華力[13]。毛細(xì)管內(nèi)壁經(jīng)氫氧化鈉解離后，呈現(xiàn)帶負(fù)電的硅羥基。本文在三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液中加入十六烷基溴化銨，二者直接存在氫鍵，在烷基鏈和硅氧烷基團(tuán)之間存在疏水性相互作用，因此形成穩(wěn)定的涂層。同時(shí)加入戊二胺、聚乙二醇能夠?qū)枇u基產(chǎn)生靜電吸引從而影響電滲流，改善分離。減少蛋白質(zhì)在內(nèi)壁的吸附。此外，緩沖溶液中加入羥丙基甲基纖維素也是防止在分離過程中硅羥基內(nèi)壁的解離[14]，其乳鐵蛋白電泳圖譜如圖1所示。

圖1 不同成分動(dòng)態(tài)涂層試劑乳鐵蛋白電泳圖譜

2.2 緩沖液、pH值的選擇

乳鐵蛋白的分子量為80 ku，等電點(diǎn)為（p I），為堿性蛋白。因此，可以使分離緩沖液的pH值高于其等電點(diǎn)，使其帶負(fù)電，與毛細(xì)管內(nèi)壁表面一致，從而減少蛋白吸附。由于乳鐵蛋白為糖基化蛋白，易與硼酸根形成帶負(fù)電的絡(luò)離子，從而進(jìn)一步增加與毛細(xì)管內(nèi)壁的庫(kù)倫排斥力，因此分離緩沖體系選用硼酸鹽體系可減少吸附[15]。另外，高濃度硼酸鹽還可提高分離效率，然而，硼酸鹽的濃度過高會(huì)產(chǎn)生較多的焦耳熱，引起色譜峰展寬，通過試驗(yàn)硼酸的最佳濃度為0.5 mol/L。因?yàn)榕鹚岬淖贤馕詹ㄩL(zhǎng)為180 nm，而乳鐵蛋白的吸收波長(zhǎng)為200 nm，pKa值是9.24，其緩沖范圍在8.24～10.24之間，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增加，分析物的分離時(shí)間延長(zhǎng)，分離度增加，但是pH值增加會(huì)帶來過高的離子強(qiáng)度，從而使電滲流增加，焦耳熱增多，最后導(dǎo)致峰展寬、靈敏度下降。因此，最終確定最佳pH值為9.0，如圖2所示。

圖2 不同pH值條件下乳鐵蛋白電泳圖譜

2.3 檢測(cè)電壓、溫度的選擇

毛細(xì)管柱長(zhǎng)度確定時(shí)，隨著分離電壓的增大，電滲流和電泳遷移速度的絕對(duì)值都增大，分離時(shí)間縮短，分離效率和分離度增加，但也會(huì)產(chǎn)生過量的焦耳熱，如果這些熱量不能及時(shí)散失，則縱向溫度梯度增大，從而導(dǎo)致分離效率和分離度下降[16]。因此電泳速度通常在不產(chǎn)生過多焦耳熱的前提下，使用盡可能高的分離電壓，實(shí)現(xiàn)最大分離度和最短分析時(shí)間。本試驗(yàn)證明，在電壓增加過程中，蛋白峰型、分離效果均未受到影響，且分離時(shí)間縮短，因此選擇30 kV為最佳運(yùn)行電壓，如圖3所示。

電泳溫度的選擇，主要是指毛細(xì)管外表溫度的選擇與控制。溫度變化不僅影響分離的重現(xiàn)性，而且影響分離效果。溫度過高，會(huì)使毛細(xì)管內(nèi)的溶液過熱而沸騰，甚至于擊穿，故溫度越低越好。由于溫度每改變l℃，將改變黏度2%～3%，因此影響電滲。溫度不恒定，波動(dòng)大，會(huì)導(dǎo)致重現(xiàn)性不好，顧有必要在毛細(xì)管柱系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行恒溫。實(shí)際測(cè)定中，適度的升高溫度，使緩沖液的濃度減小，淌度增加，會(huì)減少遷移時(shí)間[17]。由于本文采用的是動(dòng)態(tài)涂層法，溫度過高會(huì)對(duì)涂層的影響較大，影響分離效率，此外試驗(yàn)儀器有一定的降溫功能，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)25℃分離效果最好。

圖3 不同電壓條件下乳鐵蛋白電泳圖譜

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、精密度及檢出限

將質(zhì)量濃度分別為0.625，1.25，2.5，5，10 g/L的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次分別進(jìn)樣，得到不同質(zhì)量濃度乳鐵蛋白電泳圖（圖4）；然后對(duì)峰面積進(jìn)行積分，分別為212482，409297，901800，1995024，4029240；利用儀器自帶分析軟件計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為y=2×10-6x+0.2082，R2=0.9996，線性范圍為0.625～10 g/L（圖5）。分別將質(zhì)量濃度為0.625，1.25，2.5，5，10 g/L的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次進(jìn)樣5次，所得的5個(gè)濃度遷移時(shí)間RSD分別為0.8%，1.1%，0.6%，1.2%和1.5%；峰面積RSD分別為1.2%，1.4%，0.9%，0.8%，1.1%。最低檢出限（S/N=3）為0.03125 g/L。

2.5 原料純度測(cè)定結(jié)果

將4種已配置好的質(zhì)量濃度均為5.0 g/L乳鐵蛋白溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算得峰面積分別為哥蘭比亞2172226，統(tǒng)園2236522，TATURA2255310，Westland1791031；峰面積RSD分別為1.0%，0.8%，1.2%，0.9%；電泳圖分別為圖6～圖9所示。

圖4 不同質(zhì)量濃度下乳鐵蛋白電泳結(jié)果

圖5 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)

圖6 乳鐵蛋白A電泳結(jié)果

圖7 乳鐵蛋白B電泳結(jié)果

3 原料純度的測(cè)定

圖8 乳鐵蛋白C電泳結(jié)果

圖9 乳鐵蛋白D電泳結(jié)果

表1為4種乳鐵蛋白原料純度測(cè)定結(jié)果。由表1可以看出，毛細(xì)管電泳法測(cè)定的純度值略低于廠家給定的純度值（HPLC測(cè)定）。主要原因是毛細(xì)管法分離效率高，HPLC在分離過程中未能將一些雜質(zhì)峰徹底分離，而毛細(xì)管電泳圖中能夠清晰看到（如圖6～圖9中的小峰）。此外，由圖9可以看出，主峰前面小峰分離較徹底，說明部分乳鐵蛋白中鐵飽和度發(fā)生變化，對(duì)乳鐵蛋白分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致分離較徹底。由此也可以說明本方法在測(cè)定蛋白質(zhì)時(shí)，具有高分辨率、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是一種有效的蛋白檢測(cè)手段。

表1 4種乳鐵蛋白原料純度測(cè)定結(jié)果

4 結(jié) 論

本研究通過動(dòng)態(tài)涂層法對(duì)非涂層毛細(xì)管進(jìn)行了處理，通過對(duì)波長(zhǎng)、緩沖液及pH值、添加劑等條件的優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上采用外標(biāo)法對(duì)4種乳鐵蛋白原料的純度進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，運(yùn)用此方法實(shí)現(xiàn)了乳鐵蛋白原料的快速檢測(cè)，同時(shí)解決了蛋白在非涂層管內(nèi)壁吸附的問題，提高了檢測(cè)靈敏度，與其他方法相比具有分析時(shí)間短、分離效率高、節(jié)省成本等優(yōu)點(diǎn)，適用于乳鐵蛋白原料的入廠檢測(cè)。

[1]EVAY P F，VILJOEN M.Lactoferrin：a general review[J].Haematologica，1995，80(3)：252-267.

[2]STEIJNS JM，VAN HOOIJDONK A C.Occurrence，structure，biochemical properties and technological characteristicsof lactoferrin[J]. British Journal of Nutrition，2000，22（6）：168-175

[3]倪丹，王彩云，云戰(zhàn)友.乳鐵蛋白的功能特性研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工：學(xué)刊，2011(6)：87-90.

[4]張艷杰.乳鐵蛋白的功能特性及其在嬰兒配方奶粉中的應(yīng)用[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2005(2)：33-36.

[5]侯占群，牟德華.乳鐵蛋白及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品工程，2006(4)：8-11.

[6]張英華，董平.酶聯(lián)免疫法測(cè)定牛初乳中乳鐵蛋白含量[J].中國(guó)乳品工業(yè)，1999(6)：19-20.

[7]龔廣予，王曉蓉.一種檢測(cè)乳鐵蛋白的方法：放射免疫擴(kuò)散法[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2001，29(3)：27-29.

[8]INDYK H E，F(xiàn)ILONZIE L.Determination of lactoferrin in bovine milk，Colostrum and infant formulas by opticial biosensor analysis[J]. International Dairy Journal，2005，15：429-438.

[9]唐玲玲，夏明.高效液相色譜法在蛋白質(zhì)分離檢測(cè)中的應(yīng)用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊).2009(1)：89-92.

[10]夏明，應(yīng)鐵進(jìn).原子吸收分光光度法間接測(cè)定奶粉中的乳鐵蛋白含量[J].藥物分析雜志，2011，31(1)：173-175.

[11]許寧.高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定牛乳鐵蛋白的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2005(4)：296-297.

[12]CORRADLNI，CANNARSA G，F(xiàn)ABBRI E.Effeets of alkylamines on electroosmotic flow and Protein migration behaviour in capillary electrophoresis[J].J.Chromatogr，A 1995，709：127-134.

[13]GIORDANO BC，MUZA M，TROUT A.Dynamically coated capillaries allow for capillary electrophoretic resolution of transferring sialoformsvia direct analysis of human serum[J].J.Chromatogr.B，2000，742：79-89.

[14]陳義.毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用[M].2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[15]王茜，丁曉靜，王心宇，王廣增.毛細(xì)管電泳法快速測(cè)定保健食品中免疫球蛋白G[J].分析化學(xué)，2006(8)：1161-1164.

[16]李關(guān)賓.改善高效毛細(xì)管電泳分離效率的若干方法[J].分析儀器，1994(2)：51-54.

[17]朱健萍，胡昌勤，劉文英.毛細(xì)管電泳遷移時(shí)間重現(xiàn)性影響因素的探討[J].色譜，2006(4)：396-401.

Rapid detection of lactoferrin purity of raw materials by High-Performance Capillary Electrophoresis

LIU Yu，CHEN Wei，SHI Yu-dong，LI Zhi-wei，GAO Zeng-li，HOU Hui-m in，CHEN Yun
(Inner Mongolia Meng Niu Dairy Industry(Group)Co.,Ltd，R&D innovation system，Huhhot，Inner Mongolia 011500，China)

Established a rapid detect method for lactoferrin by Dynamic Coating Capillary Electrophoresis.And use this method detected different raw material purity of lactoferrin.The detection of four kinds of Lactoferrin raw material purity respectively for Glanbia：91.05%，TOONG YEUAN：93.62%，TATURA:94.38%，Westland:75.81%;relative standard deviation(RSD)respectively for 1.0%，0.8%，1.2%and 0.9%.And compared the purity of raw materials provided with the suppliers，discussed the reason of the differences between the two.Results show that the dynamic coating method can effectively restrain the capillary wall adsorption of lactoferrin，is very effective for the detection of Lactoferrin and purity verification，provide a measure for the detection of these proteins.

High-Performance Capillary Electrophoresis；dynamic coating；lactoferrin；purity

TS252.7

：A

：1001-2230（2016）02-0043-04

2015-09-11

劉宇（1985-），男，研發(fā)工程師，主要從事乳制品研究與開發(fā)。

陳云