牛奶中頭孢類藥物殘留的HPLC多聯(lián)檢測方法

（山東世通檢測評價技術(shù)服務(wù)有限公司，山東青島266000；青島世通檢測技術(shù)研究院，山東青島266000）

牛奶中頭孢類藥物殘留的HPLC多聯(lián)檢測方法

許娜，孫海新，張慧，黃金發(fā)，孫丕春

（山東世通檢測評價技術(shù)服務(wù)有限公司，山東青島266000；青島世通檢測技術(shù)研究院，山東青島266000）

采用高效液相色譜法（HPLC），建立了可同時檢測牛奶中頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩藥物殘留量的多聯(lián)檢測方法。樣品經(jīng)超聲波振蕩，先后加入乙腈除蛋白，正己烷去除脂肪，經(jīng)0.45μm和0.22μm有機(jī)超濾膜過濾，使用Agilent-C18反相色譜柱，以甲醇和0.1%甲酸溶液為流動相（V∶V=4∶6），流速為1m L/min，柱溫35℃，檢測波長為254 nm。該方法對頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩4種頭孢類藥物的檢出限均為1.0μg/kg，在質(zhì)量濃度為1.0～50.0μg/L范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999，回收率為90%～105%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。本方法具有分析時間短、檢測限低、精密度高、多聯(lián)檢測的優(yōu)點(diǎn)，對于準(zhǔn)確監(jiān)控牛奶中頭孢類藥物殘留量具有重要意義。

高效液相色譜；頭孢；牛奶；藥物殘留；多聯(lián)檢測

0 引 言

頭孢類抗生素（Cephalosporins）藥物是臨床上用于治療細(xì)菌感染所導(dǎo)致疾病的常用藥物，屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素[1]，具有耐青霉素酶、療效高、毒性低、過敏反應(yīng)少、抗菌譜廣等特點(diǎn)[2-4]，可有效抑制細(xì)菌的生長和繁殖。頭孢類抗生素在畜牧動物養(yǎng)殖中廣泛用于奶牛乳房炎的預(yù)防與治療[5]，動物尿道、胃腸道及呼吸道等的細(xì)菌病的治療和防治[6,7]。但由于其使用方法不當(dāng)或不遵守休藥期規(guī)定等多方面原因[8,9]，引發(fā)超劑量用藥的惡性循環(huán)，給人類帶來過敏、腸道菌群失調(diào)、耐藥性上升等嚴(yán)重危害[10]。因此，建立一種準(zhǔn)確、快速的定量檢測方法對于實(shí)現(xiàn)該類藥物的有效監(jiān)控具有重要意義。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀，Agilent-C 18（4.6 mm×250mm，5μm）ZORBAX Eclipse Plus反相色譜柱，Cence/湘儀L500臺式自動平衡離心機(jī)，XW-80A漩渦混合器，CP225D電子天平，UGC-12C旋轉(zhuǎn)式水浴氮吹儀。

1.2 試劑

頭孢哌酮（編號130420，純度＞94.7%）、頭孢噻肟（編號130483，純度＞93.7%）、頭孢曲松（編號130480，純度＞91.8%）、頭孢噻吩（編號130407，純度＞96.3%），以上標(biāo)準(zhǔn)品；甲醇、甲酸、乙腈、正己烷（均為色譜純）；水為超純水；牛奶(全脂滅菌純牛乳)。

2 方 法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液：分別準(zhǔn)確稱取頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩標(biāo)準(zhǔn)品各10 m g，用甲醇-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶解并分別定容到4個100 m L棕色容量瓶中，配制成制成質(zhì)量濃度為100 m g/L單標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液。再分別吸取適量單標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液轉(zhuǎn)移至1個100 m L棕色容量瓶中精確定容，配制成質(zhì)量濃度為1 m g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液，備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液制備：用甲醇-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)適當(dāng)稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為1.0，5.0，10.0，20.0，50.0μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，備用。

2.2 樣品前處理

稱取5 g液態(tài)牛奶樣品置于離心管中（精確至0.01 g），加入15～20 m L乙腈，超聲波振蕩（超聲5 s，間隔5 s，60個循環(huán)），5 000 r/m in離心10 m in，取上清液，吸取上清液至試管中，氮?dú)獯蹈桑尤氲润w積甲醇-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液復(fù)溶，加入2～2.5 m L正己烷除脂，振蕩，5 000 r/m in離心10 m in，棄去正己烷，先后經(jīng)0.45μm和0.22μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent(C 18，4.6 mm×250 mm，5μm) ZORBAX Eclipse Plus反相色譜柱。

流動相：A-甲醇，B-0.1%甲酸溶液，A∶B（體積比）=4∶6。

流速為1 m L/m in；檢測波長為254 nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為20μL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將質(zhì)量濃度分別為1.0，5.0，10.0，20.0，50.0μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，采用高效液相色譜儀進(jìn)行分析，每一水平設(shè)5個重復(fù)。以4種頭孢類藥物的峰面積平均值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 結(jié)果計(jì)算

頭孢類藥物殘留量：

式中：X為試樣中頭孢類抗生素的殘留量，m g/ kg；C為試樣溶液中頭孢類抗生素的質(zhì)量濃度，μg/ m L；V為最終樣液定容體積，m L；f為稀釋倍數(shù)；m為試樣量，g。（計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。測定結(jié)果用兩次平行測定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。）

3 結(jié)果與分析

3.1 方法線性方程和檢出限

采用HPLC測定牛奶中頭孢類抗生素的殘留量，流動相使用甲醇和0.1%甲酸溶液，配比為4∶6。結(jié)果顯示，樣品全部分析時間為12 m in，其中頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松在5 m in之內(nèi)全部出峰，并且4種藥物可以完全分開（4種藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖詳見圖1）該方法在質(zhì)量濃度為1.0～50.0μg/L范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系（如圖2～圖5所示），相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999。其頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢噻吩線性方程、相關(guān)系數(shù)如表1所示。

采用空白樣品加目標(biāo)化合物的測定方式，以信噪比S/N≥3所對應(yīng)的濃度確定檢測限，以S/N≥10所對應(yīng)的濃度確定定量限[11]，按照方法2.1進(jìn)行處理，頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢噻吩4種頭孢類藥物的最低檢出限（S/N=3）均為1.0μg/kg，定限量（S/ N=10）均為2.0μg/kg。

表1 各化合物檢測結(jié)果

圖1 頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢噻吩標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜

圖2 頭孢哌酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 頭孢噻肟的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 頭孢曲松的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 頭孢噻吩的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 準(zhǔn)確度的測定

準(zhǔn)確度是指測定值與真實(shí)值間的符合程度[12]，本研究采用樣品添加回收實(shí)驗(yàn)，以及高效液相色譜儀分析的結(jié)果來反映方法的準(zhǔn)確度。本方法的回收率的測定是運(yùn)用在空白的牛奶樣品中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行樣品的預(yù)處理，采用HPLC方法進(jìn)行檢測，計(jì)算回收率。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0μg/kg水平上添加4種頭孢類藥物，按本方法測定并計(jì)算回收率，每個添加水平重復(fù)測定3次，計(jì)算批內(nèi)和批間變異情況，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，4種頭孢類藥物的回收率均在90%～105%之間，批內(nèi)和批間RSD均小于15%。

表2 牛奶中頭孢類藥物加標(biāo)回收率和精密度的測定結(jié)果(n=3)

4 討 論

在整個檢測體系的儀器選擇方面，本研究采用了高效液相色譜的方式，這是充分考慮到了高效液相色譜方法的穩(wěn)定性、經(jīng)濟(jì)性和高效性[13]，相對于更加昂貴和專業(yè)的液質(zhì)聯(lián)用方法，更易于為廣大中小型乳制品生產(chǎn)企業(yè)的管理者和技術(shù)人員所接收。

樣品前處理是各類藥物殘留檢測都無法回避的環(huán)節(jié)，對于檢測體系的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、靈敏度以及基質(zhì)效應(yīng)消除等方面都具有重要的影響[14]。在如乳制品的樣品前處理上，Tahira等[12]采用甲醇-質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%甲酸提取和SPE萃取凈化，采用2次高速離心使蛋白沉淀等雜質(zhì)沉淀，但結(jié)果表明樣品測定結(jié)果仍不能消除基質(zhì)效應(yīng)影響。Abdalla等[4]用乙酸乙酯提取，甲醇萃取及梯度洗脫，結(jié)果仍有幾個很強(qiáng)的基質(zhì)干擾峰。本研究中為了解決基質(zhì)干擾的問題，綜合考慮樣品基質(zhì)里含有的豐富蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)的影響，以及藥物殘留在其中的生物結(jié)合特點(diǎn)[15]。在解決藥物殘留與生物基質(zhì)的結(jié)合性方面，采用了間歇性超聲波振蕩（超聲5 s，間隔5 s，60個循環(huán)）的方式，通過超聲波破壞藥物殘留與基質(zhì)的結(jié)合，這對于提高準(zhǔn)確度具有重要作用[16]；在解決蛋白質(zhì)和脂肪的基質(zhì)干擾作用方面，本研究通過加入乙腈去除蛋白，加入正己烷去除脂肪，并先后經(jīng)0.45μm和0.22μm有機(jī)超濾膜過濾的方式進(jìn)行解決，結(jié)果表明有效地避免了基質(zhì)效應(yīng)的干擾，有效分開個目標(biāo)待測物。相比于一般樣品前處理中采用的SPE柱萃取的方式，本研究所采用的連續(xù)過超濾膜的方式更易于操作，節(jié)省物力和時間，對于提高檢測效率具有積極意義。

5 展 望

本研究已建立相關(guān)的樣品前處理程序和檢測參數(shù)優(yōu)化，更需要進(jìn)一步形成標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程，以適應(yīng)乳制品的質(zhì)量控制需要，另一方面，考慮到乳制品產(chǎn)品類型的日益多樣化，本研究所建立檢測技術(shù)體系的產(chǎn)業(yè)化推廣還需要在奶粉類產(chǎn)品、酸奶制品等常見產(chǎn)品中進(jìn)行進(jìn)一步的熟化，這需要在今后的工作中作進(jìn)一步的完善。

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High performance liquid chromatography(HPLC)multigang determination method of cephalosporins in milk

XU Na,SUN Hai-xin,ZHANG Hui,HUANG Jin-fa,SUN Pi-chun
(Shandong Seatone Detection Evaluation Co.Ltd.，Qingdao 266000,China；Qingdao Seatone Detection Technology Institute,Qingdao 266000,China)

A HPLC method was established for the multi project joint determination of four cephalosporins(cefoperazone,cefotaxime,ceftriaxone,cefalotin)in milk.The milk sample was deproteinized by acetonitrile and degrease by hexane with ultrasonic technique,then filtered by organic-inorganic hybrid ultrafiltration membranes and detectd under the condition of Agilent-C18 reversed phase chromatographic column,with methanol solution and 0.1%phthalatesle solution(V∶V=4∶6)as mobile phase,flow rates1m L/m in,column temperature as 35℃, test wavelength as254 nm.The results showed that the four cephalosporins were good linear from 1～50μg/L,with minimum limits of detection were 1.0μg/kg respectively,and the correlation coefficients r2were greater than 0.999,the recoveries were at the levels90%～105%, intra-batch and inter-batch RSD were less than 15%and 20%respectively.The established multi project joint method can be applied for the determination of cephalosporins residue in milk within a short span of time,high minimum limits of detection,and high precision.

high performance liquid chromatography(HPLC);cephalosporin;milk;drug residue;multy determination

TS252.7

：A

：1001-2230（2016）02-0050-03

2015-09-07

國家火炬計(jì)劃項(xiàng)目（2015GH581533）；青島市技術(shù)創(chuàng)新平臺建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（14-7-2-36-gx）。

許娜（1986-），女，工程師，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測與質(zhì)量控制研究。

孫海新