高效液相色譜法測定嬰幼兒食品和乳品中葉黃素

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（東北農業(yè)大學國家乳制品質量監(jiān)督檢驗中心，哈爾濱150028）

高效液相色譜法測定嬰幼兒食品和乳品中葉黃素

張麗宏,宋戈,亢美娟

（東北農業(yè)大學國家乳制品質量監(jiān)督檢驗中心，哈爾濱150028）

建立了高效液相色譜法測定嬰幼兒食品和乳品中葉黃素的方法。樣品通過70℃皂化10m in，釋放出葉黃素，正己烷萃取，濃縮后甲醇溶解定容，以甲醇為流動相，經C18色譜柱分離，用紫外檢測器于445 nm波長處檢測?；厥章试?6.0%～102.0%，精密度(RSD)為1.95%～3.78%，檢出限分別為0.02μg/g。該方法操作簡單，精密度好，準確性高，經濟環(huán)保。

葉黃素；嬰幼兒食品；乳品；高效液相色譜

0 引 言

葉黃素屬于胡蘿卜醇一類的色素，具有重要的生理活性，有抗氧化、抗衰老等功能，另外對視網膜中的黃斑有重要保護作用。由于葉黃素人體不能自身合成，只能從食物中攝取，國內外出現了添加葉黃素的強化食品。近幾年，國內外對葉黃素檢測研究的文獻有很多[1-6]，但都不適用嬰幼兒食品和乳品中葉黃素的測定。奶粉中葉黃素檢測的國家標準[7]和有關文獻報道的方法[8-9]中樣品前處理中采用直接提取，而在實際樣品中添加的葉黃素原料經微囊化處理，不易直接提取，而且所用萃取劑容易把其他胡蘿卜醇類物質提取出來給測定帶來干擾。

本研究通過優(yōu)化的皂化條件把樣品中的葉黃素完全游離釋放，用合理的萃取劑進行提取，建立嬰幼兒食品和乳品中葉黃素的檢測方法，準確簡單。

1 實 驗

1.1 儀器設備

Waters1525高效液相色譜儀配Waters2487紫外檢測器；氮吹儀；Q L-901型振蕩器。

1.2 色譜條件

葉黃素標準溶液：稱取葉黃素標準物質10.0mg,用無水乙醇定容至10m L容量瓶中,搖勻，配成1.000 g·L-1標準貯備溶液，儲藏于-40℃，使用時按需要制成相應的標準工作液；甲醇為色譜純；正己烷；無水乙醇；氫氧化鉀；抗壞血酸；實驗用水均為蒸餾水；以上試劑除標注的外均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6mm，5 m），柱溫為30℃；檢測器為紫外檢測器；測定波長為445 nm；流動相為甲醇；流速為1.0m L/m in。

1.3.2 樣品處理

調味奶、酸奶和乳飲料：直接吸取1 m L,雪糕、冰激淋：融化后吸取1 m L，移入10 m L帶螺旋蓋的試管稱量；果泥、果醬和嬰幼兒配方乳粉：稱取0.1 g,移入10 m L帶螺旋蓋的試管，加入30℃左右水1 m L振蕩溶解；面包和嬰幼兒配方米粉：稱取2 g移入三角瓶中，加入0.2 g淀粉酶和30℃左右水20 m L,充氮密封后37℃酶解30 m in，吸取1 m L移入10 m L帶螺旋蓋的試管。然后向樣品中加入約0.1 g抗壞血酸和1m L無水乙醇，混勻，再加入0.5 m L 50%氫氧化鉀水溶液,在70℃水浴中皂化10 m in，涼水冷卻后加入正己烷3 m L，用振蕩器振蕩萃取1 m in，萃取3次，合并萃取液，在40℃下用氮吹儀吹干，加入1 m L甲醇定容，振蕩完全溶解殘留物，在-18℃冷凍30 m in，0.45μm濾膜過濾,供分析測定。

2 結果與分析

2.1 皂化條件的選擇

檢測結果的準確性與前處理的好壞直接相關，而在本試驗中前處理的好壞關鍵在于皂化條件選擇的是否合理。好的皂化條件應該滿足既能把被測物完全從樣品中釋放出來，又能保證被測物被破壞的風險最低，損失最小。選擇同一個均勻的樣品，進行平行實驗。皂化時都加入0.5 m L質量分數為50%氫氧化鉀溶液和皂化10 m in，在不同溫度下皂化，得到皂化溫度與測定結果的關系圖如圖1(a)，可以確定70℃是最佳皂化溫度。在同一皂化溫度70℃下，都加入0.5 m L質量分數為50%氫氧化鉀溶液后，皂化不同的時間，得到皂化時間與測定結果的關系圖如圖1（b）,可以確定在70℃皂化溫度下，皂化10 m in最佳。在同一皂化溫度70℃下，皂化相同的時間10 m in，加入不同量的堿，得到加入堿的量與測定結果的關系圖如圖1（c）,可以確定在70℃皂化溫度下，皂化10 m in時，加入堿的量為0.5 m L 50%氫氧化鉀溶液時最佳。在皂化溫度低、皂化時間短或加入堿的量少時皂化不完全，被測物不能全部從樣品中游離出來，而皂化溫度過高、皂化時間過長或加入堿的量過多被測物就會被氧化，損失了。另外通過實驗對比皂化樣品和不造皂化樣品兩種前處理，對添加游離葉黃素醇的樣品，檢測結果沒有區(qū)別，但對添加經微囊化處理的葉黃素醇酯類的樣品，經過皂化前處理的檢測結果更接近添加的理論值。故最終選擇加入0.5 m L 50%氫氧化鉀溶液，70℃皂化溫度，皂化10m in的皂化條件。

圖1 皂化溫度、皂化時間和堿的添加量對測定結果的影響

2.2 萃取劑的選擇

被測物完全從樣品中釋放出來后，選擇一種恰當的溶劑把被測物全部提取出來才能保證檢測結果準確可靠。選取3種提取溶劑正己烷、石油醚、乙醚，對同一個均勻樣品進行萃取。用正己烷作為萃取劑時，分層效果好，濃縮吹干定容后，殘留物能容易全部溶解，檢測結果也最高；其他的提取溶劑在萃取時不易分層，把其他脂溶性維生素也提取出來了，濃縮吹干定容后，有殘留物不溶解。而能溶解葉黃素的氯仿和乙醇，沸點高不適合作提取溶劑，故確定正己烷為萃取劑。

2.3 色譜條件的選擇

要保證檢測結果的準確性，好的分離條件也必不可少。與反相C18柱相比，C30柱有更好的分離能力，對分離類胡蘿卜素具有明顯的優(yōu)勢，但價格是C18柱的3到4倍，而且在分離被測物時要用到甲基叔丁基醚，氣味大，對環(huán)境和人都有毒害。樣品經過皂化，正己烷萃取后，得到的分析液雜質少，除葉黃素外其他類胡蘿卜素沒有被提取出來，干擾小，標準樣品、樣品和空白樣品色譜圖如圖2～圖4所示。用反相C18柱，甲醇作流動相，進行分離完全能達到分析要求。

2.4 標準曲線和檢出限

分別配制質量濃度為0.001，0.005，0.05，0.1，1.0，10.0，20.0，50.0m g/L的葉黃素標準溶液，在最佳色譜條件下，進行了標準曲線的測定，得到葉黃素回歸方程及線性相關系數、線性范圍，并以3倍信噪比時的進樣濃度計算出了檢出限如表1所示。

圖2 標準溶液的色譜

圖3 樣品的色譜

圖4 空白樣品的色譜

表1 標準曲線、相關系數以及線性范圍和檢出限

2.5 回收率和精密度

以同一個空白樣品為實驗材料，加入一定量的葉黃素標準溶液,進行加標實驗，平行測定8次，得出精密度并以平均測定值計算回收率，結果如表2所示。

表2 葉黃素回收率和精密度（n=8）

由此可見，測定結果的較為穩(wěn)定，方法的重復性較好。

2.6 樣品測定

按試驗方法對樣品進行測定，結果如表3所示。

表3 樣品測定結果

3 結 論

本文重點研究了皂化條件及萃取劑對分析測定的影響，建立了高效液相色譜法測定嬰兒配方食品和乳品中葉黃素的方法。該方法測定結果重現性好，準確度高，簡單易操作，經濟環(huán)保，適合用于葉黃素的日常檢測。

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Determination of lutein in foods for infants and dairy products by high-performance liquid chromatographic

ZHANG Li-hong,SONG Ge,KANG Mei-juan
(National Dairy Testing Center,Northeast Agriculture University,Harbin 150028,China)

A simple and rapid method for determination of lutein in foods for infants and dairy products by high-performance liquid chromatography(HPLC)was developed.Following a mild saponi cation procedure(70℃for 10min)demonstrated to be benign to lutein,lipophilic components were partitioned by a single extraction into hexane and concentrated in mobile phase.Separation of lutein was achieved using a C18 column and isocratic elution with methanol and detected at445 nm with a ultraviolet detector.The recovery were 96.0%～102.0%,the relative standard deviations(RSD)were 1.95%～3.78%,the minimum detectable values were 0.02μg/g.This method can be used for the routine analysis of lutein.

lutein;foods for infants;dairy products;HPLC

TS252.7

：A

：1001-2230（2016）02-0047-03

2015-09-15

張麗宏（1975-），女，工程師，從事乳制品檢測與研究。