粒毛盤菌黑色素分子修飾及其抗氧化活性

李　蘭,　袁懷波,　李盛蘭,　葉　明

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥　230009)

?

粒毛盤菌黑色素分子修飾及其抗氧化活性

李蘭,袁懷波,李盛蘭,葉明

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥230009)

摘要:文章對一株粒毛盤菌均一性胞內(nèi)黑色素(LIM205)分別進(jìn)行羧甲基化、硫酸酯化修飾,制備黑色素衍生物CLIM205和SLIM205,通過紫外光譜和紅外光譜初步判斷修飾成功;在30 ℃下,LIM205不溶于水,經(jīng)羧甲基化和硫酸酯化修飾后,成為水溶性黑色素衍生物,CLIM205、SLIM205在水中的溶解度分別為3.75、2.06 g;分別測定LIM205、CLIM205、SLIM205對OH·、O2-·、DPPH·的清除率及Fe(2+)的螯合率,評價LIM205、CLIM205、SLIM205的體外抗氧化活性。相同質(zhì)量濃度時,CLIM205、SLIM205的抗氧化活性均比LIM205的強,且CLIM205的抗氧化活性比SLIM205的強。因此,CLIM205和SLIM205有望作為一種新型的抗氧化劑應(yīng)用于食品和藥品領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞:粒毛盤菌黑色素;水溶性;羧甲基化;硫酸酯化;抗氧化活性

0引言

黑色素是一類酚類或吲哚類生物分子[1],來源于一些動植物及微生物[2-4],具有抗氧化、抗輻射、肝損傷保護(hù)、免疫和螯合重金屬等生物活性[5-9]。黑色素一般不溶于水及常見有機溶劑[10],這一性質(zhì)限制了其在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用,因此提高黑色素的水溶性具有重要意義。目前,提高非水溶性生物活性物質(zhì)的化學(xué)方法主要有氨基酸修飾、硫酸酯化修飾和羧甲基化修飾[11-14]等。

粒毛盤菌屬為一類腐生性真菌,深層發(fā)酵后可產(chǎn)生大量具有抑菌和抗輻射等活性的黑色素[15-17],其均不溶于水及常見的有機溶劑。采用精氨酸對粒毛盤菌黑色素進(jìn)行修飾后,獲得了水溶性精氨酸黑色素,且修飾后其抗氧化活性增強[14]。目前,國內(nèi)外對粒毛盤菌黑色素進(jìn)行其他化學(xué)修飾的相關(guān)報道并不多。

前期本課題組已獲得粒毛盤菌YM205胞內(nèi)均一性黑色素(LIM205),并解析了其結(jié)構(gòu)。本文分別對LIM205進(jìn)行羧甲基化和硫酸酯化修飾,探索修飾后的水溶性,并評價其修飾前后的抗氧化活性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

粒毛盤菌YM205,合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室分離保藏。

1.1.2發(fā)酵培養(yǎng)基

酪氨酸 1.0 mmol/L、銅離子 1.1 mmol/L、蔗糖25.5 g/L、酵母膏5.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L,pH值為8.0,培養(yǎng)溫度為27 ℃,攪拌轉(zhuǎn)速為180 r/min,發(fā)酵時間為12 d。

1.2粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素的制備及純化

將粒毛盤菌YM205種子液接種于100 L機械攪拌發(fā)酵罐中發(fā)酵,參照文獻(xiàn)[17]的方法提取、純化粒毛盤菌YM205胞內(nèi)黑色素,冷凍干燥后收集該黑色素備用。采用葡聚糖凝膠G-15進(jìn)行分級分離,獲得主要組分LIM205。

1.3LIM205衍生物的制備

1.3.1LIM205羧甲基化修飾

將300 mg LIM205溶于5 mL NaOH(2 mol/L)、12 mL異丙醇的混合溶液,冰浴中攪拌3 h,攪拌狀態(tài)下緩慢加入3 g氯乙酸、5 mL NaOH(2 mol/L)、12 mL異丙醇,室溫下反應(yīng)3 h,60 ℃繼續(xù)反應(yīng)2 h,溶液冷卻至室溫,加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至中性,于截留分子量為200 Da的透析袋透析48 h,冷凍干燥后獲得黑色素衍生物CLIM205。

1.3.2LIM205硫酸酯化修飾

將90 mL吡啶加入附有冷凝管、溫度計的250 mL三頸瓶中,用電磁加熱攪拌器攪拌,同時緩慢加入三氧化硫-吡啶2.0～3.0 g。加熱至90 ℃,再加入LIM205粉末0.5 g,恒溫攪拌1 h,冷卻至室溫。反應(yīng)液用3 mol/L的NaOH溶液調(diào)至中性,靜置24 h。自來水和蒸餾水分別透析2 d,過濾,冷凍干燥,得硫酸酯化黑色素SLIM205。

1.4LIM205及其衍生物紫外光譜檢測

參照文獻(xiàn)[14]的分析方法測定 LIM205、CLIM205、SLIM205的最大吸收波長(λmax),200 ～ 400 nm進(jìn)行全波段掃描。

1.5LIM205及其衍生物紅外光譜

采用FT-IR5700傅里葉變換紅外光譜分別對LIM205、CLIM205、SLIM205進(jìn)行紅外光譜分析[18],掃描區(qū)間為4 000 ～ 400 cm-1。

1.6LIM205及其衍生物水溶性測定

精確量取10 mL蒸餾水于干燥的燒杯中,加入一定量LIM205,恒溫(30 ℃)攪拌,1 h后仍有部分沉淀,靜置一段時間后,3 500 r/min離心10 min,取上層溶液,真空冷凍干燥后稱質(zhì)量、計算溶解度,實驗重復(fù)3次。相同方法分別測定CLIM205、SLIM205的溶解度。

1.7LIM205及其衍生物抗氧化活性

1.7.1對Fe2+的螯合作用

參考文獻(xiàn)[14]方法并略作修改。1 mL不同質(zhì)量濃度的氨基酸-黑色素溶液與0.05 mL FeCl2 (2 mmol/L)混勻后加入0.2 mL Ferrozine溶液(5 mmol/L),靜置20 min后于562 nm測吸光度A。蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照,LIM205、EDTA-2Na作為陽性對照。Fe(2+)螯合率的計算公式為： [14]的方法并略作修改。取1 mL不同質(zhì)量濃度(0、50、100、150、200、250、300 mg/L)的黑色素LIM205、CLIM205、SLIM205溶液加入5 mmol/L鄰二氮菲1.5 mL、pH值為7.4、0.05 mol/L的磷酸緩沖液2.0 mL、7.5 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL,每加一管立即混勻,再加入1 mL H2O2(0.1 %),最后以蒸餾水定容至10 mL。反應(yīng)液37 ℃保溫l h,在536 nm測A(損傷)。未損傷管不加H2O2及黑色素溶液或Vc溶液,測A(未損傷)?！H清除率計算公式為:

Fe2+螯合率=[(A空白-A樣品)/A空白]×100%。

1.7.2對·OH的清除作用

1.7.3對O2-·的清除作用

1 mL不同質(zhì)量濃度(0、50、100、150、200、250、300 mg/L)的LIM205、CLIM205、SLIM205溶液與3 mL pH值為8.2的Tirs-HCl緩沖液混勻,室溫下靜置25 min,加入0.3 mL鄰苯三酚溶液(7 mmol/L),搖勻反應(yīng)4 min,再加入1 mL HCl (10 mmol/L)終止反應(yīng),稀釋,在318 nm下測定混合液的吸光度A1,測定蒸餾水代替反應(yīng)試劑的吸光度 (A1′) 及蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照的吸光度(A0),LIM205作為對照,O2-·清除率的計算公式為：

O2-·清除率=[1-(A1-A1′)/A0]×100%。

1.7.4對DPPH·的清除作用

參照文獻(xiàn)[19]方法略修改。1 mL DPPH·無水乙醇溶液(0.1 mmol/L)分別與3 mL不同質(zhì)量濃度(0、50、100、150、200、250、300 mg/L)的LIM205、CLIM205、SLIM205溶液混勻,置于黑暗環(huán)境下30 min,稀釋后在517 nm下測定混合液的吸光度(A1),測定無水乙醇溶液作為空白對照的吸光度(A0),LIM、二丁基羥基甲苯(BHT)作為對照,則DPPH·清除率的計算公式為：

DPPH·清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 18統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果用x±s表示,組間比較用t檢驗,P< 0.05表示組間存在顯著性差異,P< 0.01表示組間差異極顯著。

2結(jié)果

2.1LIM205制備及其水溶解性

粒毛盤菌YM205胞內(nèi)黑色素的得率為6.32 g/100 g。經(jīng)葡聚糖G-15凝膠柱洗脫后,獲得3個洗脫組分,收集主要組分LIM205,如圖1所示,占均一性組分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的66.5%。

圖1　LIM205的Sephades G-15柱層析圖譜

2.2LIM205及其衍生物紫外全波段掃描光譜

LIM205及其衍生物紫外全波段掃描光譜如圖2所示。從圖2可看出,LIM205在196 nm處具有最大吸收峰，與LEM404-a 的最大吸收波長(210 nm)相近[16];黑色素溶液光密度對數(shù)值與波長的線性曲線斜率為-0.001 5～-0.003 0,符合典型黑色素特征[20],在280、260 nm都未見吸收峰,表明其不含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)[21]。與LIM205相比,CLIM205的紫外最大吸收峰由于羧甲基的引入產(chǎn)生明顯的偏移,SLIM205的紫外最大吸收峰變化較小,但在256 nm附近出現(xiàn)了一個新的寬吸收峰,這可能是引入硫酸基團(tuán)導(dǎo)致的[22]。

圖2　LIM205及其衍生物紫外全波段掃描光譜圖

2.3LIM205及其衍生物的溶解度

在30 ℃下,LIM205幾乎不溶于水,溶于堿性溶液,CLIM205、SLIM205在蒸餾水中溶解度分別為3.75、2.06 g。該實驗結(jié)果表明LIM205經(jīng)羧甲基化修飾后,其水溶性顯著增加(P< 0.01)。

2.4LIM205及其衍生物的紅外光譜分析

LIM205及其衍生物的紅外光譜分析如圖3所示。

圖3　LIM205及其衍生物紅外光譜圖

LIM205紅外光譜具有典型的黑色素特征吸收峰[23]3 280、1 630 cm-1。3 280 cm-1附近出現(xiàn)強且寬的共振吸收峰，是由O—H或吲哚的N—H伸縮振動產(chǎn)生;在1 630 cm-1處由—COOH的伸縮振動引起;1 540 cm-1處具有環(huán)噻嗪振動吸收峰,為棕黑色素的特征吸收峰;1 240 cm-1是酚的O—H彎曲振動[24];700～600 cm-1處的吸收峰由C—S伸縮振動引起[5]。與LIM205的紅外光譜相比,1 630 cm-1處羧基吸收峰明顯增強,在1 370 cm-1處具有與羧基相連的亞甲基的特征吸收峰,表明LIM205羧甲基化修飾成功。SLIM205紅外光譜在1 080 cm-1、820 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰,可能分別為—O—SO3H中S=O的伸縮振動峰、C—O—S伸縮振動吸收峰,表明硫酸酯化修飾成功。

2.5LIM205及其衍生物體外抗氧化性

2.5.1LIM205衍生物對Fe2+螯合率的影響

對金屬離子的螯合作用是抗氧化劑的一個重要性質(zhì)[25]。Ferrozine定量與Fe2+結(jié)合形成紅色絡(luò)合物,當(dāng)黑色素存在時,黑色素與Ferrozine競爭Fe2+與絡(luò)合,導(dǎo)致絡(luò)合物的紅色變淺,因此可通過顏色的變化來測定黑色素對Fe2+的螯合作用。LIM205、CLIM205、SLIM205質(zhì)量濃度對Fe2+的螯合率如圖4所示,由圖4可看出,LIM205、CLIM205、SLIM205對Fe2+的螯合率均隨其質(zhì)量濃度的增大而增強,當(dāng)質(zhì)量濃度為300 mg/L時,對Fe2+的螯合率分別達(dá)到了25.60%、54.50%、42.15%,低于EDTA-2Na對Fe2+的螯合率(61.11%),LIM205、CLIM205、SLIM205均具有螯合Fe2+的能力,可能是由于該黑色素分子中高電荷密度的羧基或羥基與帶電的Fe2+作用,因此,LIM205、CLIM205可作為螯合Fe2+的螯合劑。

圖4　LIM202及其衍生物質(zhì)量濃度對Fe2+的螯合率的影響

2.5.2LIM205衍生物對·OH清除率的影響

LIM205及其衍生物對·OH的清除率的影響如圖5所示,LIM205、CLIM205、SLIM205對·OH的清除作用均隨其質(zhì)量濃度的增大而增強,且當(dāng)質(zhì)量濃度為300 mg/L時均達(dá)到最大,分別為57.27%、73.39%、61.73%。相同質(zhì)量濃度條件下,CLIM205對·OH的清除作用比LIM205和SLIM205強,且最大清除率高于LachnumYM-223黑色素對·OH的清除力(50.60%)[26],略低于Vc(78.90%),表明羧甲基修飾后的黑色素對·OH的清除能力增強。

圖5　LIM205及其衍生物對·OH清除率的影響

2.5.3LIM205衍生物對O2-·清除率的影響

鄰苯三酚在堿性條件下能夠迅速自氧化,生成吸收波長在318 nm附近的系列有色中間產(chǎn)物,同時釋放出O2-·,因此可通過比色法來檢驗物質(zhì)清除O2-·的能力，結(jié)果如圖6所示。

圖6　LIM205及其衍生物對O2-·清除率的影響

由圖6可知,LIM205、CLIM205、SLIM205對O2-·的清除能力,均隨其質(zhì)量濃度的增大而增大。當(dāng)質(zhì)量濃度為300 mg/L時,LIM205、CLIM205、SLIM205對O2-·的最大清除率分別達(dá)到46.76%、77.20%、53.62%,均高于Lachnumsingerianum對O2-·的清除力(43.48%)[18]。CLIM205對O2-·的最大清除能力略高于Vc (75.73%),且相同質(zhì)量濃度條件下,CLIM205和SLIM205對O2-·的清除率均大于LIM205的,且CLIM205對O2-·的清除活性大于SLIM205的,差異極顯著(P< 0.01)。

2.5.4LIM205衍生物對DPPH·清除率的影響

LIM205及其衍生物對DPPH·清除率的影響如圖7所示。

由圖7可以看出,LIM205、CLIM205、SLIM205對DPPH·的清除能力隨其質(zhì)量濃度的增加而增大。當(dāng)質(zhì)量濃度為300 mg/L時,三者對DPPH·的清除率為49.72%、67.40%、54.19%。修飾后的黑色素清除DPPH·能力明顯增強,其中CLIM205對DPPH·清除率的活性最高,但略低于BHT。

圖7　LIM205及其衍生物對DPPH·清除率的影響

3結(jié)束語

本研究對LIM205進(jìn)行了羧甲基化修飾和硫酸酯化修飾,獲得了水溶性黑色素,溶解度分別為3.75、2.06 g;LIM205、CLIM205、SLIM205對OH·、O2-·、DPPH·的清除率及Fe2+的螯合率均隨其質(zhì)量濃度增加而增強,相同質(zhì)量濃度時三者抗氧化能力關(guān)系為CLIM205> SLIM205> LIM205;質(zhì)量濃度為300 mg/L時,與LIM205相比,SLIM對OH·、O2-·、DPPH·的清除率及Fe2+的螯合率分別提高了3.46%、6.87%、4.47%、16.5%,而CLIM205分別提高了16.13%、30.44%、17.32%、28.90%。實驗結(jié)果表明,黑色素經(jīng)羧甲基化修飾和硫酸酯化修飾后,水溶性和生物活性均提高,這可能是由于黑色素引入了新的基團(tuán),從而影響了LIM205的水溶解度和抗氧化活性。

本研究獲得的水溶性的CLIM205和SLIM205均可作為一種新型抗氧化劑用于食品和醫(yī)藥行業(yè),但CLIM205和SLIM205的水溶解度仍然偏低,可通過優(yōu)化羧甲基化修飾和硫酸酯化修飾的工藝條件或探索其他的改性方法來進(jìn)一步提高黑色素的水溶性。

[1]Sajjan S S,Anjaneya O,Guruprasad B K,et al.Properties and functions of melanin pigment fromKlebsiellasp.GSK[J].Microbiology and Biotechnology Letters,2013,41(1):60-69.

[2]Teixeira M F S,Martins M S,Da Silva J C,et al.Amazonian biodiversity:pigments fromAspergillusandPenicillium：characterizations,antibacterial activities and their toxicities[J].Curr Trends Biotechnol Pharm,2012,6(3):300-311.

[3]Yao Zengyu,Qi Jianhua,Wang Lihua.Isolation,fractionation and characterization of Melanin-like pigments from chestnut (Castaneamollissima) shells[J].Journal of Food Science,2012,77(6):C671-C676.

[4]郭賡藝,蔣科,李蘭,等.粒毛盤菌 YM404 黑色素發(fā)酵、純化及其染色效果[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2014,37(1):100-104.

[5]Guo Xin,Chen Shiguo,Hu Yaqin,et al.Preparation of water-soluble melanin from squid ink using ultrasound-assisted degradation and its anti-oxidant activity[J].Journal of Food Science and Technology,2013,51(12):3680-3690.

[6]Olennikov D N,Tankhaeva L M,Agafonova S V.Antioxidant components ofLaetiporussulphureus(Bull.:Fr.) Murr.fruit bodies[J].Applied Biochemistry and Microbiology,2011,47(4):419-425.

[7]Kunwar A,Adhikary B,Jayakumar S,et al.Melanin,a promising radioprotector:mechanisms of actions in a mice model[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2012,264(2):202-211.

[8]Sava V M,Hung Y C,Blagodarsky V A,et al.The liver-protecting activity of melanin-like pigment derived from black tea[J].Food Research International,2003,36(5):505-511.

[9]Urán M E,Nosanchuk J D,Restrepo A,et al.Detection of antibodies against Paracoccidioides brasiliensis melanin in in vitro and in vivo studies during infection[J].Clinical and Vaccine Immunology,2011,18(10):1680-1688.

[10]Riley P A.A proposed selective mechanism based on metal chelation in industrial melanic moths[J].Biological Journal of the Linnean Society,2013,109(2):298-301.

[11]黃欣.一種改性紅曲紅色素的制備方法,中國：CN1132793[P].1996-10-09.

[12]王雁,楊祥良，鄧成華，等.羧甲基化虎奶多糖的制備及抗氧化性研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2000,27(4):411-414.

[13]吳瓊.羧甲基化堿溶性銀耳多糖的研究[J].長春大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2009,19(10):66-68.

[14]Ye Ming,Wang Yan,Guo Gengyi,et al.Physicochemical characteristics and antioxidant activity of arginine-modified melanin fromLachnumYM-346[J].Food Chemistry,2012,135(4):2490-2497.

[15]Lu Ying,Ye Ming,Song Sheng,et al.Isolation,purification,and anti-aging activity of melanin fromLachnumsingerianum[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2014,174(2):762-771.

[16]Ye Ming,Guo Gengyi,Lu Ying,et al.Purification,structure and anti-radiation activity of melanin fromLachnumYM404[J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,63:170-176.

[17]葉明,朱立,楊柳,等.PlectaniaYM421 胞內(nèi)黑色素提取及其生物功能[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2009,28(2):229-233.

[18]Ye Ming,Wang Yan,Qian Meishuang,et al.Preparation and properties of the melanin fromLachnumsingerianum[J].International Journal of Basic and Applied Sciences,2011,11(3):51-58.

[19]Turkoglu A,Duru M E,Mercan N,et al.Antioxidant and antimicrobial activities ofLaetiporussulphureus(Bull.) Murrill[J].Food Chemistry,2007,101(1):267-273.

[20]Suryanarayanan,T S,Ravishankar J P,Venkatesan G,et al.Characterization of the melanin pigment of a cosmopolitan fungal endophyte[J].Mycological Research,2004,108(8):974-978.

[21]Nofsinger J B,Weinert E E,Simon J D.Establishing structure-function relationships for eumelanin[J].Biopolymers,2002,67(4/5):302-305.

[22]Yang J,Du Y,Wen Y,et al.Sulfation of Chinese lacquer polysaccharides in different solvents[J].Carbohydrate Polymers,2003,52(4):397-403.

[23]Bilinska B.Progress of infrared investigations of melanin structures[J].Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,1996,52(9):1157-1162.

[24]Babitskaya V G,Shcherba V V,Filimonova T V,et al.Melanin pigments from the fungi Paecilomyces variotii andAspergilluscarbonarius[J].Applied Biochemistry and Microbiology,2000,36(2):128-133.

[25]Guo T,Wei L,Sun J,et al.Antioxidant activities of extract and fractions fromTuberindicumCooke & Massee[J].Food Chemistry,2011,127(4):1634-1640.

[26]葉明,許慶平,陳曉,等.LachnumYM-223 產(chǎn)黑色素發(fā)酵及其黑色素抗氧化活性研究[J].食品科學(xué),2009,30(17):185-189.

(責(zé)任編輯閆杏麗)

Molecular modifications of melanin fromLachnumand their antioxidative activities

LI Lan,YUAN Huai-bo,LI Sheng-lan,YE Ming

(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract:By using carboxymethylation and sulfation to modify the homogeneous component melanin(LIM205) from Lachnum sp, a water-soluble melanin carboxymethylate(CLIM205) and a melanin sulfate(SLIM205) were obtained and the modifications were successfully verified by UV and FT-IR spectra. LIM205 was insoluble in water under the temperature of 30 ℃, however, it became a water-soluble melanin after carboxymethylation and sulfation. The water solubility of CLIM205 and SLIM205 were 3.75 g and 2.06 g. The abilities of LIM205, CLIM205 and SLIM205 to scavenge OH·, O2-·, DPPH· and to chelate Fe(2+)were tested, and the antioxidative activities in vitro were also evaluated. At the same dosage, the antioxidative activities of CLIM205 and SLIM205 were both higher than those of LIM205, and the antioxidative activities of CLIM205 were higher than those of SLIM205, suggesting that CLIM205 and SLIM205 can be used as new antioxidant components in medicine and health products.

Key words:Lachnum melanin; water solubility; carboxymethylation; sulfation; antioxidative activity

中圖分類號:Q939.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1003-5060(2016)03-0404-06

doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.03.022

作者簡介：李蘭(1988-)，女，安徽亳州人，合肥工業(yè)大學(xué)碩士生；

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(31270060)；科技部中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資助項目(12C26213403307)

收稿日期：2015-01-06

葉明(1959-)，男，安徽懷寧人，博士，合肥工業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師.