色譜純化和質(zhì)譜分析法研究牛骨源咸味肽

李迎楠++劉文營(yíng)++張順亮++成曉瑜

摘 要：以牛骨為研究對(duì)象，通過(guò)中空纖維超濾裝置、Sephadex G-25凝膠色譜柱對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量小于5 000的酶解產(chǎn)物進(jìn)行初步分離，選用制備型及分析型高效液相色譜分析儀對(duì)咸味肽進(jìn)行純化、收集及分析。結(jié)果表明：收集得到牛骨源咸味肽為單一組分；用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)咸味肽進(jìn)行分析，得到其為相對(duì)分子質(zhì)量均小于1 000的短肽，其呈現(xiàn)咸味的物質(zhì)質(zhì)荷比值可能為679.510 9。

關(guān)鍵詞：咸味肽；凝膠色譜；高效液相色譜；基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀

Separation， Purification and Analysis of Salty Peptides Derived from Bovine Bone by Chromatography and Mass Spectrometry

LI Yingnan， liu Wenying， ZHANG Shunliang， CHENG Xiaoyu*

（China Meat Processing and Engineering Center， China Meat Research Center， Beijing Academy of Food Sciences， Beijing 100068， China）

Abstract： The enzymatic hydrolysate of bovine bone with relative molecular weight < 5 000 was separated by hollow fiber ultrafiltration and Sephadex G-25 column chromatography. Two salty peptide fractions from the hydrolysate were purified by preparative high performance liquid chromatography （HPLC） and the pooled samples were analyzed by HPLC. The two fractions were found to consist of a single homogenous component. As analyzed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF/MS）， both peptide fractions had a relative molecular weight less than 1000， the salty taste compound of which was m/z 679.510 9.

Key words： salty peptides； gel permeation chromatography； high performance liquid chromatography （HPLC）； matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF/MS）

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.006

中圖分類號(hào)：TS251.94 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2016）03-0025-04

引文格式：

李迎楠， 劉文營(yíng)， 張順亮， 等. 色譜純化和質(zhì)譜分析法研究牛骨源咸味肽[J]. 肉類研究， 2016， 30（3）： 25-28. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

LI Yingnan， LIU Wenying， ZHANG Shunliang， et al. Separation， purification and analysis of salty peptides derived from bovine bone by chromatography and mass spectrometry[J]. Meat Research， 2016， 30（3）： 25-28. （in Chinese with English abstract）DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

食鹽是人類生存最重要的物質(zhì)之一，也是烹飪中最常用的調(diào)味料，但是過(guò)多地?cái)z入食鹽不僅與高血壓的發(fā)生有密切關(guān)系，也會(huì)對(duì)心、腦、腎等器官產(chǎn)生損害[1-2]。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，使得安全健康的食鹽替代物的開(kāi)發(fā)具有重要意義和前途[3]，咸味肽作為一種可呈現(xiàn)咸味的多肽，其來(lái)源于天然動(dòng)植物，開(kāi)發(fā)與應(yīng)用前景廣闊，具有重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)可呈現(xiàn)咸味的多肽開(kāi)展了不少工作，Nakamura等[4]通過(guò)合成方法制備出無(wú)Na+存在的咸味肽，其具有能夠在食品加工時(shí)替代食鹽的潛力，但成本昂貴；Zhu Xiaolin等[5]在對(duì)無(wú)鹽醬油研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)3 種具有咸味的二肽，且其中兩種具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的功能；張順亮等[6]通過(guò)對(duì)比不同凝膠層析色譜分離得到咸味肽，結(jié)果顯示，其制備的咸味肽的相對(duì)分子質(zhì)量可能為849.38 D，但咸味肽分離純化效果并不理想。目前超濾裝置及制備型高效液相色譜儀被廣泛應(yīng)用于多種物質(zhì)單體的制備，特別是制備型高效液相色譜儀具有分離效率高、產(chǎn)物純度高、分離速度快等特點(diǎn)，是制備純化天然產(chǎn)物的極好手段[7-8]。

本研究利用食品級(jí)生物酶試劑對(duì)粉碎后牛骨進(jìn)行酶解，通過(guò)逐級(jí)純化酶解液最終得到咸味肽，選用超濾膜過(guò)濾、Sephadex G-25凝膠色譜、制備型高效液相色譜儀對(duì)凍干后咸味組分進(jìn)行純化并收集，采用高效液相色譜儀對(duì)其進(jìn)行純度鑒定，并利用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MOLDI-TOF/MS）對(duì)其成分進(jìn)行分析，為咸味肽開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持，尤其是為咸味肽應(yīng)用于食品加工具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨 北京豐臺(tái)牛街清真市場(chǎng)；復(fù)合動(dòng)物蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶 諾維信（中國(guó)）投資有限公司；葡聚糖凝膠G-25 美國(guó)Pharmacia公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

強(qiáng)力破骨機(jī) 廊坊惠友機(jī)械有限公司；YXQGO2型電熱式蒸汽消毒器 山東新華醫(yī)療器械；JJ-1精密定時(shí)電動(dòng)攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；AL104電子天平 梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；CL-25型蠕動(dòng)泵中空纖維超濾膜組件 北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司；SL-Ⅲ型數(shù)控層析冷柜 北京博翔興旺科技有限公司；LGJ-30D冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；Waters LC 2695-2998分析型液相色譜儀、Waters LC 2545-2998制備型液相色譜儀 沃特世科技（上海）有限公司；4700 MOLDI-TOF/MS質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 咸味肽粗提物制備

參考文獻(xiàn)[6]方法并稍作修改。取新鮮牛骨，去肉、粉碎、除脂，取骨渣進(jìn)行酶解，酶解溫度為60 ℃，骨渣與水質(zhì)量比為1∶1，添加復(fù)合動(dòng)物蛋白酶15 mg/g（骨渣），酶解2 h；然后添加風(fēng)味蛋白酶10 mg/g（骨渣），酶解4 h，酶解期間持續(xù)攪拌；將酶解液真空抽濾后，用截留相對(duì)分子質(zhì)量為5 000的超濾膜過(guò)濾，收集濾液真空冷凍干燥，即為咸味肽粗提物，將咸味肽粗提物透析除鹽后備用。

1.3.2 咸味肽凝膠柱色譜分離純化

稱取Sephadex G-25 30 g，加入300 mL超純水，室溫下過(guò)夜使其充分溶脹，除去多余的水及細(xì)小顆粒，反復(fù)洗滌2～3 次，真空抽濾除去氣泡[9-10]，灌柱后用洗脫液平衡柱子，自動(dòng)部分收集器收集時(shí)間為5 min。將分離得到的組分經(jīng)多次收集后凍干，進(jìn)行咸味感官評(píng)定。

Sephadex G-25凝膠色譜柱分離條件為：玻璃柱（60 cm×16 cm），進(jìn)樣量質(zhì)量濃度50 mg/mL，進(jìn)樣量1 mL，流速為0.8 mL/min。洗脫液為超純水，

λ為220 nm。

1.3.3 咸味肽制備型液相色譜分離及收集

將凍干后咸味肽制成溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后備用。制備型液相色譜分離條件為：色譜柱為C18柱（10型250 mm），采用超純水-甲醇（95∶5～90∶10（V/V））為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫20 min，樣品質(zhì)量濃度50 mg/mL，進(jìn)樣量體積為1 mL，流速為5 mL/min，λ為220 nm，柱溫25 ℃。

1.3.4 咸味肽分析型液相色譜純度鑒定

將制備型液相色譜收集得到的咸味肽凍干后制得溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后備用。分析型液相色譜鑒定條件為：色譜柱為C18柱（4.6型250 mm），樣品質(zhì)量濃度1 mg/mL，進(jìn)樣量體積為10 μL，流速為1 mL/min，其余條件同1.3.3節(jié)。

1.3.5 咸味肽MALDI-TOF/MS分析

數(shù)據(jù)的采集：取0.5 μL樣品點(diǎn)靶室溫下自然風(fēng)干后，將0.5 μL、5 mg/mL基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸（溶于50%乙腈溶液）點(diǎn)在樣品上自然風(fēng)干。實(shí)驗(yàn)前需在設(shè)定的質(zhì)量范圍內(nèi)用混合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)量校正，以保證獲得數(shù)據(jù)誤差小于5[11]。

質(zhì)譜儀器參數(shù)：YAG激光器（355 nm）離子源，采用正離子反射模式檢測(cè)，加速電壓20.00 kV，掃描范圍：600～3 000 m/z，質(zhì)譜信號(hào)為2 000 次激光點(diǎn)累加所得[12-13]。

1.3.6 感官評(píng)定

咸味肽組分咸味判定：將收集得到的不同峰組分分別凍干，制成1 mg/mL溶液，作出感官評(píng)定，判斷不同峰組分是否有咸味[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 咸味肽凝膠柱Sephadex G-25分離及咸味判定結(jié)果

凝膠柱Sephadex G-25的分離范圍是1 000～5 000 D，且具有較好的脫鹽作用[15]，將超濾后凍干樣品進(jìn)行凝膠層析色譜分離，由圖1可知，超純水為洗脫液可得到5 個(gè)色譜峰，峰之間距離適中，分離效果較好。其中組分Ⅳ的響應(yīng)值最大，峰Ⅳ較窄且峰型較尖、高，但峰Ⅱ較寬，比較圓滑，峰型不太理想[16]，收集得到峰Ⅱ溶液顏色較深，考慮為樣品中的雜質(zhì)色素。凝膠層析色譜是根據(jù)被分離物質(zhì)分子質(zhì)量大小不同而進(jìn)行分離，若相對(duì)分子質(zhì)量較為接近，則單峰中可能含有多種物質(zhì)，因此，需對(duì)得到的組分進(jìn)行進(jìn)一步分離。

將分離得到的5 種組分進(jìn)行多次收集，冷凍干燥制成干品。分別對(duì)5 種組分進(jìn)行感官評(píng)定，由表1可知，經(jīng)過(guò)凝膠柱Sephadex G-25分離的組分中，組分Ⅳ有咸味，其他組分均無(wú)咸味。

2.2 咸味肽高效液相色譜純化結(jié)果及純度分析

制備型高效液相色譜圖譜與咸味肽的純度有直接關(guān)系，同時(shí)可通過(guò)不斷改變洗脫梯度、樣品濃度等使得峰型得到改善[17]。將凝膠柱Sephadex G-25分離得到組分Ⅳ配制成溶液，過(guò)濾后進(jìn)行制備型高效液相色譜分析。由圖2可知，該組分分離出多種物質(zhì)，經(jīng)多次進(jìn)樣收集洗脫液，凍干后經(jīng)感官評(píng)定，可知呈現(xiàn)咸味的多肽集中于第2～3峰，其余峰組分凍干后無(wú)咸味，故在后續(xù)的收集中，著重收集前4個(gè)峰。多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中間兩個(gè)峰具有一定的關(guān)聯(lián)，現(xiàn)有工藝條件未實(shí)現(xiàn)完全分離，且響應(yīng)值較高，說(shuō)明咸味肽在該組分中為主要物質(zhì)。

將制備型高效液相收集得到的第2～3峰組分分別凍干后配制成溶液a和b，過(guò)濾后利用分析型高效液相色譜分別對(duì)其進(jìn)行純度分析[18]。由圖3可知，二者均為單一峰，組分的保留時(shí)間分別為2.538 3 min和2.533 3 min，結(jié)合制備型高效液相色譜結(jié)果，可以推斷出二者可能是一種物質(zhì)的同分異構(gòu)體。經(jīng)歸一化定量，其純度均在98%以上，此時(shí)流動(dòng)相甲醇的體積分?jǐn)?shù)約為5.5%，實(shí)驗(yàn)得到的咸味肽具有較強(qiáng)的極性。

2.3 咸味肽MALDI-TOF/MS質(zhì)譜分析結(jié)果

MALDI-TOF/MS在分析多肽混合物時(shí)，能耐受適量的緩沖劑、鹽等物質(zhì)。不同多肽在MALDI源離子化過(guò)程中離子化效率不同，相互之間存在競(jìng)爭(zhēng)，因此可能存在一些多肽因離子化抑制而未被檢測(cè)到，同時(shí)MALDI-TOF/MS質(zhì)譜中檢測(cè)到的峰也可能是一些肽段峰的加鉀峰[19-20]。采用MALDI-TOF/MS對(duì)制備型HPLC收集到的第2組分進(jìn)行質(zhì)譜分析，其一級(jí)質(zhì)譜結(jié)果見(jiàn)圖4。分離純化得到的咸味肽組分均為相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的短肽，在質(zhì)荷比（m/z）600～3 000之間，咸味肽中信號(hào)較強(qiáng)的母離子為612.849 4、622.047 0、679.510 9、701.497 4、792.601 8，結(jié)合咸味肽為該物質(zhì)中的主要物質(zhì)，初步判定咸味肽的質(zhì)荷比值可能為679.510 9，但不排除所檢測(cè)物質(zhì)中含有其他可呈現(xiàn)咸味多肽的可能性。

3 結(jié) 論

凝膠柱Sephadex G-25可分離得到5 個(gè)色譜峰，其中組分Ⅳ的響應(yīng)值最大，峰型較好，且經(jīng)感官評(píng)定，組分Ⅳ有咸味，其他組分均無(wú)咸味；對(duì)組分Ⅳ進(jìn)行制備型高效液相色譜分析，得到多種物質(zhì)，其中呈現(xiàn)咸味的多肽集中于第2～3峰，且兩個(gè)峰具有一定的關(guān)聯(lián)；分別對(duì)其進(jìn)行純度分析，發(fā)現(xiàn)二者均為單一峰，保留時(shí)間分別為2.538 3 min和2.533 3 min，可以推斷二者是一種物質(zhì)的同分異構(gòu)體，且該物質(zhì)具有較強(qiáng)的極性。

采用MALDI-TOF/MS質(zhì)譜分析，得到的咸味肽組分均為相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的短肽，結(jié)合咸味肽為該物質(zhì)中的主要物質(zhì)，初步判定咸味肽的質(zhì)荷比值可能為679.510 9。實(shí)驗(yàn)豐富了天然產(chǎn)物咸味肽的品類，為牛骨源咸味肽的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] KIRSTEN B， GLENN M C， PAMELA G C， et al. Projected effect of dietary salt reductions on future cardiovascular disease[J]. The New England Journal of Medicine， 2010， 362（7）： 590-599.

[2] 張燕， 張新軍， 張俊琦， 等. 老年高血壓病糖代謝異常及合并心血管病危險(xiǎn)分析[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2010， 41（2）： 307-311. DOI：10.3969/j.issn.1672-173X.2010.02.029.

[3] 張雅瑋， 郭秀云， 彭增起. 食鹽替代物研究進(jìn)展[J]. 肉類研究， 2011， 25（2）： 36-38.

[4] NAKAMURA K， KURAMITU R， KATAOKA S， et al. Convenient synthesis of L-ornithyltaurine HCl and the effect on saltined in a food material[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1996， 44（9）： 2481-2485.

[5] ZHU Xiaolin， WATANABE K， SHIRAISHI K， et al. Identification of ACE-inhibitory peptides in salt-free soy sauce that are transportable across caco-2 cell monolayers[J]. Peptides， 2008， 29（3）： 338-344. DOI：10.1002/net.20055.

[6] 張順亮， 成曉瑜， 喬曉玲， 等. 牛骨酶解產(chǎn)物中咸味肽組分的分離純化及成分研究[J]. 食品科學(xué)， 2012， 33（6）： 29-32.

[7] 寧德生， 梁小燕， 方宏， 等. 半制備高壓液相色譜法制備羅漢果苷V標(biāo)準(zhǔn)品[J]. 食品科學(xué)， 2010， 31（12）： 137-140.

[8] 王賢蘭. 制備型高效液相在中藥多組分分離中的應(yīng)用[J]. 湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)， 2011， 30（6）： 669-672.

[9] 馮雅蓉， 馬儷珍， 李黎. Sephadex G-25對(duì)羊骨膠原降血壓肽的分離純化效果研究[J]. 肉類研究， 2011， 25（6）： 30-33.

[10] ELIZABETH E， LETICIA M， PAUL D F， et al. Purification and identification of antihypertensive peptides in Spanish dry-cured ham[J]. Journal of Proteomics， 2013， 78（6）： 499-507. DOI：10.1016/j.jport.2012.10.019.

[11] PATRYCJA P M， LUISA M M， CONCEPCI?N G. Development of a high-performance liquid chromatography-electrospray ionization quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry methodology for the determination of three highly antihypertensive peptides in maize crops[J]. Journal of Chromatography， 2013， 87（7）： 69-77. DOI：10.1016/j.chroma.2013.02.015.

[12] LIU F， SONG S， ZHANG X， et al. Effect of sterilization methods on ginger flavor beverage assessed by partial least squares regression of descriptive sensory analysis and gas chromatography-mass spectrometry[J]. European Food Research and Technology， 2013， 238（2）： 1-11. DOI：10.1007/s00217-013-2093-8.

[13] 嚴(yán)立， 徐繡宇， 張莉萍. 基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)臨床常見(jiàn)細(xì)菌和酵母菌的鑒定能力評(píng)價(jià)[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程與臨床， 2015， 19（2）： 105-108. DOI：10.13339/j.cnki.sglc.2015.02.002.

[14] 周家春. 食品感官分析[M]. 北京： 中國(guó)輕工業(yè)出版社， 2013.

[15] 曾珍， 李誠(chéng)， 付剛， 等. 豬骨免疫活性肽的分離純化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2014， 40（11）： 116-120. DOI：110.13995/j.cnki.11-1802/ts.201411020.

[16] 舒一梅， 李誠(chéng)， 付剛， 等. 凝膠層析法分離豬股骨降血壓肽及其體外穩(wěn)定性[J]. 食品科學(xué)， 2014， 35（24）： 100-104. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201424019.

[17] 梁曉芳， 王步軍. 應(yīng)用制備高效液相色譜同時(shí)制備6種大豆異黃酮單體的方法研究[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)， 2014， 33（1）： 63-67.

[18] 雷宇佳， 高明哲， 王莉， 等. 制備型高效液相色譜法分離純化川西獐牙菜提取物中的龍膽苦苷[J]. 色譜， 2010， 28（9）： 902-904. DOI：10.3724/sp.j.1123.2010.00902.

[19] 楊帆， 敬海明， 張拓， 等. MALDI-TOP/TOP和LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用分析大鼠腦脈絡(luò)叢的多肽組[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)， 2010， 26（7）： 659-671.

[20] 劉佳佳， 金芬， 佘永新， 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中5 種多肽類抗生素[J]. 分析化學(xué)研究報(bào)告， 2011， 39（5）： 652-657. DOI：10.3724/sp.j.1096.2011.00652.