丁酸氯維地平注射乳劑中依地酸二鈉的含量測(cè)定

趙亞繪，王彥竹，宋麗明，張赫然，王杏林，田　沛（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津　300070；.天津藥物研究院有限公司，釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300193）

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丁酸氯維地平注射乳劑中依地酸二鈉的含量測(cè)定

趙亞繪1，2，王彥竹2，宋麗明2，張赫然2，王杏林2，田沛1，2
（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津藥物研究院有限公司，釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193）

摘要目的：建立測(cè)定丁酸氯維地平注射乳劑中微量依地酸二鈉的高效液相色譜法。方法：采用Agilent ZORBAX Extend-C(18)柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），梯度洗脫流動(dòng)相A為0.66 %四丁基氫氧化銨溶液-乙腈（3∶1）（pH6．5），B相為甲醇-水（9∶1），流速為1.0 mL·min(-1)，進(jìn)樣量50 μL，檢測(cè)波長為254 nm。結(jié)果：依地酸二鈉峰不受輔料干擾，在8.04～80.37 μg·mL(-1)內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），加樣回收率為97.78%（n=9，RSD=0.62%），定量限0.402 μg，供試品中依地酸二鈉含量分別為46.7 μg·mL(-1)、47.0 μg·mL(-1)、49.6 μg·mL(-1)。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)，可用于丁酸氯維地平注射乳劑中依地酸二鈉的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞丁酸氯維地平；注射乳劑；依地酸二鈉；高效液相色譜法；含量

Determination of EDTA-2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion

ZHAO Ya-hui1,2,WANG Yan-zhu2,SONG Li-ming2,ZHANG He-ran2,WANG Xing-lin2,TIAN Pei1,2
（1．Graduate School，Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co.,Ltd.State Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Pharmacokinetics,Tianjin 300193,China）

Abstract Objective:To establish an HPLC method for determination of tracing EDTA -2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion.Methods:The determination was performed on Agilent ZORBAX Extend-C18 column(150 mm×4.6 mm,5 μm)with gradient elution,mobile phase A was 0.66% tetrabutylammonium hydroxide solution-acetonitrile(3:1)(pH was adjusted to 6.5)，and mobile phase B was methanol-water(9:1),the flow rate was 1.0 mL·min-1and the injection volume was 50 μL and the detection wavelength was 254 nm.Results:EDTA-2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion could be detected without excipients interfering.Calibration curve was linear range of 8.04-80.37 μg·mL-1(r=0.999 9),the average recovery rate was 97.78%(n=9,RSD=0.62%),and the limit of quantitation was 0.402 μg and the determination of EDTA-2Na in the three batches of tests were 46.7 μg·mL-1，47.0 μg·mL-1，49.6 μg·mL-1respectively.Conclusion:This method is accurate,reliable,exclusive,so it can be used for the determination of EDTA-2Na in clevidipine butyrate injectable emulsion.

Key words clevidipine butyrate;injectable emulsion;EDTA-2Na;HPLC;content

丁酸氯維地平（clevidipine butyrate）屬L型短效二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，可選擇性作用于動(dòng)脈血管以實(shí)現(xiàn)精確降壓[1-3]，臨床常用其注射乳劑以減少藥物的血管刺激性[4-5]，實(shí)際生產(chǎn)中常加入適量金屬離子螯合劑EDTA-2Na以提高乳劑穩(wěn)定性，但體內(nèi)Ca2+易與其形成配合物引起骨鈣流失或低血鈣[6]，因此，對(duì)注射劑中EDTA-2Na含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。目前，中國藥典僅收載了EDTA-2Na原料藥的含量測(cè)定方法[7]，尚未收錄注射液中EDTA-2Na的控制標(biāo)準(zhǔn)，通常認(rèn)為注射液中EDTA-2Na安全有效濃度為5～100 μg·mL-1[8]。本試驗(yàn)建立了準(zhǔn)確、方便、快速測(cè)定丁酸氯維地平注射乳劑中EDTA-2Na含量的高效液相色譜法，為該藥質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與試藥Agilent 1200高效液相色譜儀（配有四元泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、UV檢測(cè)器、ChemStation工作站，美國）；XS205電子分析天平（梅特勒-托利多公司，瑞士）；FE20 pH計(jì)（梅特勒-托利多公司，瑞士）。

丁酸氯維地平注射乳劑（批號(hào)：141110，141111，141112，規(guī)格50 mL:25 mg，自制），空白丁酸氯維地平注射乳劑（不加EDTA-2Na，規(guī)格50 mL:25 mg，自制）；EDTA-2Na對(duì)照品（純度99.9 %，中國藥品生物制品檢定所），乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性色譜柱Agilent ZORBAX Extend-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A相為0.66%氫氧化四丁基銨溶液-乙腈（3∶1）（pH6．5），B相為甲醇-水（9∶1），梯度洗脫條件見表1，流速為1.0 mL·min-1，柱溫35℃，檢測(cè)波長254 nm，進(jìn)樣體積50 μL，理論板數(shù)按EDTA-2Na峰計(jì)算不低于3 000。

表1　梯度洗脫條件Tab 1 The condition of gradient elution

1.2.2對(duì)照品溶液配制取EDTA-2Na對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成約50 μg·mL-1的溶液。精密量取該溶液1 mL，置50 mL離心管中，加空白丁酸氯維地平注射液（不含EDTA-2Na）9 mL，混合均勻。精密加入混合液[異丙醇-正庚烷（8∶2）]10 mL振搖1 min，再加入25mL正庚烷振搖1min，于5000 r·min-1離心10 min，精密量取下層水相5 mL，置10 mL量瓶中，加入1.0 mL 0.08% Cu（NO3）2溶液，加水至刻度，制得50 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

1.2.3供試品溶液配制精密量取丁酸氯維地平注射液10 mL，置50 mL離心管中，按“1.2.2對(duì)照品溶液配制”項(xiàng)下自“精密加入混合液”起同法操作。

1.2.4方法專屬性精密量取空白丁酸氯維地平注射液（不含EDTA-2Na）10 mL，置50 mL離心管中，按“1.2.2對(duì)照品溶液配制”項(xiàng)下自“精密加入混合液”起同法操作，制得空白溶液。分別取空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。

1.2.5線性關(guān)系考察精密稱定EDTA-2Na對(duì)照品50 mg，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得1 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液2、3、5、7、8 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。再精密量取配制好的800 μg·mL-1EDTA-2Na溶液1mL置于10mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得到200、300、500、700、800、80μg·mL-1的EDTA-2Na溶液。精密量取上述溶液1 mL，按“1.2.2對(duì)照品溶液制備”項(xiàng)下同法操作，以EDTA-2Na濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6耐用性試驗(yàn)分別改變流動(dòng)相流速（1.1、0.9 mL·min-1）、柱溫（32℃、38℃）、緩沖液pH（pH 6.4和7.0）、檢測(cè)波長（250 nm、260 nm），其他條件不變，評(píng)估測(cè)定條件發(fā)生微小變動(dòng)時(shí)測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度。

1.2.7定量限以信噪比10∶1對(duì)應(yīng)濃度為定量限，取EDTA-2Na的對(duì)照溶液逐級(jí)稀釋，各精密量取1mL，同“1.2.2對(duì)照品溶液配制”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖。

1.2.8精密度試驗(yàn)按“1.2.2對(duì)照品溶液配制”項(xiàng)下制備對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD。

1.2.9重復(fù)性試驗(yàn)取丁酸氯維地平注射乳劑（141110批），按“1.2.3供試品溶液配制”項(xiàng)下制備6份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣，計(jì)算RSD。

1.2.10穩(wěn)定性試驗(yàn)取對(duì)照品溶液，分別于0、5、12和24 h測(cè)定EDTA-2Na峰面積。取供試品溶液，分別于0、4和16 h測(cè)定EDTA-2Na峰面積。

1.2.11回收率精密稱取EDTA-2Na對(duì)照品適量，配制4.0、5.0、6.0 mg·mL-1的EDTA-2Na水溶液，分別精密量取100 μL上述溶液置于50 mL離心管中（即加入樣品量的80%、100%和120%），量取丁酸氯維地平注射液10 mL，置50 mL離心管中，按“1.2.2對(duì)照品溶液配制”項(xiàng)下自“精密加入混合液”同法操作，制得回收液。每個(gè)濃度樣品平行測(cè)3份，計(jì)算EDTA-2Na含量及回收率。

1.2.12供試品中EDTA-2Na含量測(cè)定取不同批號(hào)丁酸氯維地平注射液(141110、141111、141112)按“1.2.2供試品溶液配制”項(xiàng)下方法配制，平行3次測(cè)定EDTA-2Na含量。

2　結(jié)果

2.1方法專屬性空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定結(jié)果見圖1，結(jié)果表明EDTA-2Na峰不受其他組分干擾，該法專屬性良好。

圖1　專屬性HPLC色譜圖Fig1 Specificity tests for HPLC chromatograms

2.2線性關(guān)系考察結(jié)果以EDTA-2Na濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=8.7099C+6.8851（r＝0．999 9）。結(jié)果表明，在8.04～80.37 μg·mL-1范圍內(nèi)，EDTA-2Na濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3耐用性試驗(yàn)結(jié)果見圖2。正常情況下EDTA-2Na保留時(shí)間約6.0 min，當(dāng)流速為1.1 mL·min-1，EDTA-2Na出峰稍提前，流速0.9 mL·min-1時(shí)出峰稍延后，但均屬合理范圍且峰型基本不變；流動(dòng)相pH為6.4和7.0時(shí)，EDTA-2Na與其它成分的分離效果較好，但低于6.4時(shí)EDTA-2Na峰與溶劑峰重合，保留時(shí)間顯著增加；柱溫及檢測(cè)波長稍變動(dòng)時(shí)，EDTA-2Na的保留時(shí)間及峰型均基本不變，且理論板數(shù)均大于5 000，因此，本法耐用性良好。

圖2　方法的耐用性試驗(yàn)Fig2 The durability test

2.4定量限結(jié)果當(dāng)對(duì)照品濃度為8.04 μg·mL-1時(shí)其信噪比約為10∶1，EDTA-2Na定量限為0.402μg。

2.5精密度試驗(yàn)結(jié)果對(duì)照品中EDTA-2Na平均含量為49.4 μg·mL-1，RSD為1.47 %，說明該法精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果141110批丁酸氯維地平注射乳劑中EDTA-2Na平均含量為46.8 μg·mL-1，RSD為0.07%，說明該法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果EDTA-2Na對(duì)照品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定，峰面積的RSD為0.7 %，EDTA-2Na供試品溶液在室溫條件下16 h內(nèi)穩(wěn)定，峰面積的RSD為0.5 %，符合要求。

2.8回收率結(jié)果見表2。平均回收率為97.78%（RSD=0.62%,n=9）。

表2　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 2 Results of recovery(n=9)

2.9供試品中EDTA-2Na含量測(cè)定結(jié)果3批丁酸氯維地平注射液（141110、141111、141112）中EDTA-2Na含量分別為46.7 μg·mL-1、47.0 μg·mL-1、49.6 μg·mL-1，均在含量限度范圍內(nèi)（5～100 μg·mL-1），符合輔料安全原則。

3　討論

3.1回收率對(duì)定量的影響對(duì)照品及供試品溶液配制過程中異丙醇-正庚烷起到破乳及萃取作用，離心加速油水分層，以便準(zhǔn)確量取溶有EDTA-2Na的水層，但實(shí)際操作中不可避免的有EDTA-2Na損失。直接以EDTA-2Na水溶液為對(duì)照的預(yù)試驗(yàn)存在回收率不足（低于90%）的問題，因此，在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，先向?qū)φ掌匪芤褐屑尤肟瞻锥∷崧染S地平微乳，然后破乳萃取，使對(duì)照溶液與供試品溶液制備過程保持一致，以便利用外標(biāo)法相對(duì)準(zhǔn)確計(jì)算供試品中EDTA-2Na的實(shí)際濃度，該法準(zhǔn)確度及回收率顯著提高（97.78%，n=9，RSD=0.62%）。

3.2流動(dòng)相pH選擇及梯度條件優(yōu)化EDTA合銅離子與等摩爾的氫氧化四丁基銨定量反應(yīng)，流動(dòng)相pH是該定量反應(yīng)關(guān)鍵，酸度較大時(shí)，H+競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合EDTA合銅離子，使離子對(duì)作用減弱，峰型變差；流動(dòng)相堿度較大時(shí)易減少色譜柱和液相系統(tǒng)使用壽命，因此，實(shí)驗(yàn)將流動(dòng)相A相調(diào)至近中性，同時(shí)采用梯度洗脫充分、及時(shí)洗脫水相中殘余的脂肪酸，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)等度洗脫柱效惡化，峰型拖尾等不足。

本試驗(yàn)采用優(yōu)化的梯度洗脫結(jié)合全面的方法學(xué)驗(yàn)證，建立了可靠、高效、專屬性強(qiáng)的測(cè)定丁酸氯維地平注射乳劑中微量EDTA-2Na的HPLC法，該法也為其他藥品中EDTA-2Na含量監(jiān)測(cè)提供了思路和依據(jù)。

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（2015-08-25收稿）

基金項(xiàng)目國家重大新藥創(chuàng)制課題基金資助(2014ZX09507005- 001)

作者簡(jiǎn)介趙亞繪(1990-)，女，碩士在讀，研究方向：藥物制劑；通信作者:王杏林，E- mail:wangxl@tjipr.com。

文章編號(hào)1006－8147（2016）01-0073-03

中圖分類號(hào)R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A