復方呋塞米螺內酯膠囊質量控制方法的研究

上官可可，李美珍，楊金榮，房志仲（.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥劑科，天津　300；.天津醫(yī)科大學藥學院藥劑學教研室，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津　300070）

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復方呋塞米螺內酯膠囊質量控制方法的研究

上官可可1，李美珍2，楊金榮2，房志仲2
（1.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥劑科，天津300211；2.天津醫(yī)科大學藥學院藥劑學教研室，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070）

摘要目的：建立復方呋塞米螺內酯膠囊（FuSpirC）的質量控制方法。方法：用高效液相色譜法測定復方制劑中呋塞米和螺內酯的含量。結果：色譜柱：Kromasil C(18)柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇∶0.02 mol/L磷酸二氫鉀（67∶33）（0.85%磷酸調節(jié)pH 至4.3），流速0.8 mL/min，檢測波長為239 nm，呋塞米、螺內酯分別在5～35 μg/mL、20～80 μg/mL濃度范圍線性關系良好，呋塞米平均回收率分別為98.29%（RSD=0.08%，n=3）、99.20%（RSD=0.48%，n=3）、99.18%（RSD = 0.36%，n=3），螺內酯平均回收率分別為101.76%（RSD=0.13%，n=3）、101.35%（RSD=0.52%，n=3）、101.67%（RSD = 0.27%，n=3），平均回收率的RSD均小于2%，符合方法學要求，呋塞米、螺內酯平均含量分別為94.79%、99.76%，均符合要求。結論：所建立方法可用于復方呋塞米螺內酯膠囊的質量控制。

關鍵詞呋塞米；螺內酯；高效液相色譜法；質量控制

Study of the quality control of the compound furosemide and spironolactone capsules

SHANGGUAN Ke-ke1,LI Mei-zhen2,YANG Jin-rong2,FANG Zhi-zhong2
（1.Department of Pharmacy,The Second Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China；2.Department of Pharmacy,College of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics(Theranostics)，Tianjin 300070,China）

Abstract Objective:To develop a method for controlling the quality of compound FuSpirC.Methods:High performance liquid chromatography was used to determine the contents of furosemide and spironolactone in compound FuSpirC.Results:Column was represented by Kromasil-C18(200 mm×4.6 mm，5 μm),mobile phase was methanol:0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate(67:33)(used 0.85% phosphoric acid adjust pH 4.3),flow rate 0.8 mL/min,detected wavelength was 239 nm,the concentrations of furosemide and spironolactone were 5～35 μg/mL and 20～80 μg/mL,respectively,and were in good linear relationship.The average recovery rate of furosemide were 98.29%(RSD = 0.08%，n=3)，99.20%(RSD = 0.48%，n=3)，99.18%(RSD = 0.36%，n=3),while spironolactone were 101.76%(RSD = 0.13%，n=3)，101.35%（RSD = 0.52%，n=3），101.67%(RSD = 0.27%，n=3),the average recovery of RSD was less than 2%,conformed to the requirement of the methodology.The content of furosemide and spironolactone were 94.79% and 99.76%，conformed to the requirements.Conclusion:The methods can be used for quality control of compound FuSpirC.

Key words furosemide；spironolactone；HPLC；quality control

呋塞米為強效利尿劑，其作用機制主要是抑制腎小管髓袢升支粗段髓質部Na+、C1-的主動再吸收，因而尿中Na+、K+與水的排出增加而產(chǎn)生利尿作用[1]。此外，還有擴張腎小動脈的作用。長期或大劑量應用，可引起低鉀血癥、低鈉血癥和代謝性酸中毒。嚴重時因血容量降低，導致休克甚至死亡[2]。螺內酯為人工合成的類固醇類藥物，其結構與醛固酮類似，兩者在腎遠曲小管和集合管的皮質段起競爭作用，干擾醛固酮保鈉排鉀的作用，對伴有醛固酮增高的頑固水腫有治療作用，且可防止鉀的耗竭，在臨床上有重要用途[3]，對心力衰竭也有一定的療效[4]。單獨應用效力較弱，一般需與噻嗪類或呋塞米等合用，方可取得顯著利尿作用，并可抵消相互引起的低鉀血癥[5-6]。有研究顯示呋塞米螺內酯聯(lián)用可安全有效的治療輕中度原發(fā)性高血壓，有良好的耐受性，并且副作用小，不引起血糖、血脂代謝和血清中鉀、尿酸濃度的變化[7]。根據(jù)文獻，筆者研制該復方制劑膠囊，并建立相應質控方法。

1　材料和方法

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器高效液相色譜儀（美國Spectraphysics、Spectra Focus紫外檢測器、輸液泵、Anstar色譜工作站）；ZDY-Ⅱ-1 IKVA高精密度單相交流穩(wěn)壓電源（國營啟東電訊廠）；pHS-25（數(shù)顯）pH計（Q/YXLG122，上海精密科學儀器有限公司）；KQ-100B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ALC -210.4電子分析天平（ACCULAB Sartorius group，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；U3310紫外可見分光光度計（Spectrophotometer Hitachi;High-Techrolgies Corporation）。

1.1.2試劑與藥品呋塞米標準品（中國藥品生物制品檢定所，100544-200501）；螺內酯標準品（中國藥品生物制品檢定所，100193-201102）；FuSpirC制劑（自制，3批）；甲醇（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；其它試劑均為市售分析純；重蒸水（自制）。

1.2方法[8]

1.2.1檢測波長以甲醇分別溶解呋塞米、螺內酯原料藥到適當濃度，按分光光度法在200～400 nm波長范圍內進行紫外光譜掃描，并掃描呋塞米螺內酯適當濃度的混合樣品，以確定檢測波長。

1.2.2色譜條件色譜柱為TIANHE誖Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀=67∶33（用0.85%磷酸調節(jié)pH至4.3）；檢測波長：239 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。

1.2.3專屬性試驗分別以流動相作溶劑，配制復方FuSpirc膠囊制劑溶液，呋塞米原料藥溶液、螺內酯原料藥溶液及空白輔料溶液。將所配溶液按照確定色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

1.2.4復方FuSpirC含量測定方法

1.2.4.1溶液的制備：（1）對照品溶液的制備：呋塞米標準儲備液的配制：精密稱取呋塞米標準品20 mg置于100 mL棕色量瓶中，用適量甲醇超聲溶解，用甲醇稀釋定容，搖勻作為貯備液。螺內酯標準儲備液的配制：精密稱取螺內酯標準品50 mg置于50 mL量瓶中，用適量甲醇超聲溶解，用甲醇稀釋定容，搖勻作為貯備液。（2）樣品溶液的制備：取自制FuSpirC膠囊10粒，取出內容物，研細，精密稱取適量（相當于呋塞米20 mg、螺內酯50 mg），置于100 mL棕色容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，冷卻，定容，取適量離心，精密吸取上清液1.0 mL置于10 mL棕色量瓶中，用流動相稀釋定容，備用。（3）空白對照液的制備：稱取處方中輔料，置量瓶中，以下操作同“1.2.4.1（2）”項下。

1.2.4.2標準曲線的制備：呋塞米標準曲線的繪制：分別精密量取“1.2.4.1項下”呋塞米儲備液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和1.75 mL置于10 mL棕色量瓶中，用流動相稀釋定容，搖勻，于色譜條件下進行測定。螺內酯標準曲線的繪制：分別精密量取“1.2.4.1項下”螺內酯儲備液0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70和0.80 mL置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋定容，搖勻，按照“1.2.2”項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，做線性回歸。

1.2.4.3精密度試驗：取“1.2.4.1”溶液，按照“1.2.2”項下色譜條件平行進樣6次，分別計算呋塞米、螺內酯RSD值。

1.2.4.4穩(wěn)定性試驗：精密稱取樣品，按照“1.2.4.1 （2）”項下方法操作，分別于0、3、6、9、12和24 h，按照“1.2.2”項下色譜條件進樣，計算RSD值。

1.2.4.5重復性試驗：分別量取供試品溶液6份，按照“1.2.4.1（2）”項下操作，按照“1.2.2”項下色譜條件，各取20 μL進樣，測定峰面積。

1.2.4.6回收率試驗：呋塞米回收率試驗：取空白輔料70 mg，置于50 mL棕色量瓶中，分別按照80%、100%和120%的量，加入呋塞米標準品4、5和6 mg，加適量甲醇超聲10 min，放冷至室溫，甲醇稀釋定容，搖勻，取適量離心，精密吸取上清液1.0 mL置于10 mL棕色量瓶中，用流動相稀釋定容，搖勻，進樣測定。螺內酯回收率試驗：取空白輔料62.5 mg，置于50 mL量瓶中，分別按照80%、100%、120%的量，加入螺內酯標準品10、12.5、15 mg，加適量甲醇超聲使溶解，甲醇稀釋定容，搖勻，取適量離心，精密吸取上清液1.0 mL置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋定容，搖勻，按照“1.2.2”項下色譜條件進樣測定。

1.2.4.7含量測定：取10粒膠囊，傾出內容物，研細稱取適量（相當于呋塞米5 mg、螺內酯12.5 mg）3份，分別置于50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲10min，放冷至室溫，加甲醇稀釋定容，搖勻，取適量離心，精密吸取上清液1.0 mL置于10 mL棕色量瓶中，用流動相稀釋定容，搖勻，按照“1.2.2”項下色譜條件進樣測定。

2　結果

2.1檢測波長的選擇呋塞米甲醇溶液、螺內酯甲醇溶液、呋塞米螺內酯（FL）混合樣甲醇溶液分別做紫外全波長掃描，記錄吸光度圖譜，見圖1。呋塞米、螺內酯在239 nm左右處均有最大吸收波長，故選擇239 nm作為HPLC檢測波長。

2.2專屬性試驗結果呋塞米的保留時間為4 min，螺內酯保留時間為13 min，空白對照液色譜圖中與對照品相同保留時間處無干擾，表明輔料不干擾樣品測定。見圖2～5。

2.3線性關系考察結果呋塞米在5～35 μg/mL范圍內與峰面積成良好線性關系。其標準曲線方程為：y=41 286x+20 838，r=0.999 9(n=7)；螺內酯在20～80 μg/mL范圍內與峰面積成良好線性關系。其標準曲線方程為：y=69 185x-29 778，r=0.999 7（n=7）。

圖1　溶液200～400 nm波長紫外掃描結果Fig 1 UV spectrum of solutions(200～400 nm)

圖2　呋塞米原料藥HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of furosemide

圖3　螺內酯原料藥HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of spironolactone

圖4　復方FuSpirC膠囊HPLC色譜圖Fig 4 HPLC chromatograms of compound FuSpirC

圖5　空白輔料HPLC色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms of blank excipients

2.4精密度試驗結果呋塞米、螺內酯RSD分別為0.46%、0.34%，均RSD<2%，表明該測定方法精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗結果呋塞米、螺內酯RSD分別為1.03%、0.89%，均RSD<2%。實驗結果表明，供試品溶液在24 h內穩(wěn)定，能滿足試驗要求。

2.6重復性試驗結果供試品中呋塞米含量RSD 為0.56%；螺內酯含量RSD為0.48%，本試驗重復性較好。

2.7回收率試驗結果呋塞米平均回收率分別為98.29%（RSD=0.08%，n=3），99.20%（RSD=0.48%，n=3），99.18%（RSD=0.36%，n=3）；螺內酯平均回收率分別為101.76%（RSD =0.13%，n =3），101.35% （RSD=0.52%，n=3），101.67%（RSD=0.27%，n=3），平均回收率的相對標準偏差均小于2%，符合方法學要求。見表1、2。

表1　呋塞米回收率測定結果Tab 1 Recovery test on furosemide

表2　螺內酯回收率結果Tab 2 Recovery test on spironolactone

2.8含量測定結果呋塞米平均含量為94.79%，在90%～110%范圍，符合《中國藥典》2010版（二部）中對呋塞米的質量要求，其RSD為0.78%，小于2%，符合質量標準規(guī)定；螺內酯平均含量為99.76%，在97%～103%范圍，符合《中國藥典》2010版（二部）中對螺內酯的質量要求，其RSD為0.66%，小于2%，符合質量標準規(guī)定。見表3～4。

表3　呋塞米含量測定結果Tab 3 The content of furosemide in FuSpirC

表4　螺內酯含量測定結果Tab 4 The content of spironolactone in FuSpir

3　討論

《中國藥典》2010年版（二部）中對呋塞米的含量測定為滴定法，螺內酯的含量測定選用的色譜條件為乙腈-水（50∶50）[9-10]，當選用乙腈-水（50∶50）為流動相時，呋塞米與螺內酯分離度差。有文獻報道采用甲醇-水（70∶30）[11]、0.02 mol/L磷酸氫二銨-乙腈（45∶55）[12]為流動相測定螺內酯，但用此2種流動相時螺內酯與呋塞米分離度均不佳，調節(jié)比例后仍然未見改善。另有相關文獻報道呋塞米含量測定以甲醇-水-磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀13.6 g加水80 mL使溶解，用磷酸調節(jié)pH值至3.0，用水稀釋至1 000 mL）（500∶493∶7）為流動相，但此流動相在試驗過程中呋塞米、螺內酯出峰時間較晚。調節(jié)流動相比例、流速，當甲醇-水-磷酸鹽緩沖液比例為670∶300∶30，流速為0.8 mL/min時，呋塞米、螺內酯出峰時間適中且峰形良好，但發(fā)現(xiàn)流動相在放置過程中有磷酸鹽析出。為使流動相配制簡便，調整流動相為甲醇∶0.02 mol/L磷酸二氫鉀，調節(jié)其比例至67∶33，流速為0.8 mL/min時，螺內酯峰形不佳，用0.85%磷酸調節(jié)流動相pH至4.3時，峰形良好，塔板數(shù)和分離度均符合要求，故最終確定流動相為甲醇∶0.02 mol/L磷酸二氫鉀（0.85%磷酸調節(jié)pH至4.3），流速為0.8 mL/min。

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（2015-07-29收稿）

綜述

作者簡介上官可可（1989-），男，碩士在讀，研究方向：臨床藥理學；通信作者：房志仲，E- mail:fangzhizhong@tmu.edu.cn。

文章編號1006－8147（2016）01-0080-04

中圖分類號R927.2

文獻標志碼A