芝麻香型白酒高溫大曲制曲過程中微生物群落結(jié)構(gòu)特征的磷脂脂肪酸（PLFA）分析

曹　宇，翟　磊，信春暉，許　玲，姚　粟，程　池(.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京0007；.山東扳倒井股份有限公司，山東淄博56300)

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芝麻香型白酒高溫大曲制曲過程中微生物群落結(jié)構(gòu)特征的磷脂脂肪酸（PLFA）分析

曹宇1，翟磊1，信春暉2，許玲2，姚粟1，程池1
(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京100027；2.山東扳倒井股份有限公司，山東淄博256300)

摘要：高溫大曲是芝麻香型白酒釀造特有的糖化發(fā)酵劑，為白酒釀造提供豐富的微生物種類、各種生物酶類以及多種香味前驅(qū)物質(zhì)，在傳統(tǒng)白酒釀造過程中發(fā)揮重要的作用。本研究采用磷脂脂肪酸分析方法(phospholipid fatty acid，PLFA)對芝麻香型白酒高溫大曲生產(chǎn)過程中微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化進行了研究。結(jié)果表明，真菌在整個制曲過程中占主導(dǎo)地位,細菌的含量和種類在第1次和第2次翻曲的過程中出現(xiàn)規(guī)律性變化，推測這兩次翻曲在制曲過程中起著關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞：芝麻香型白酒；高溫大曲；磷脂脂肪酸（PLFA）；微生物群落

芝麻香型白酒是我國傳統(tǒng)白酒的創(chuàng)新香型，也是魯酒的代表香型，以其濃、醬、清相結(jié)合的工藝特點和獨特的優(yōu)雅芝麻香味，符合白酒淡雅、爽凈的消費趨勢[1-2]。芝麻香型白酒的工藝特點包括高溫制曲、高氮配料、高溫堆積、高溫發(fā)酵、多微共酵、分層蒸餾、長期貯存和科學(xué)勾兌。大曲是我國固態(tài)白酒釀造特有的糖化發(fā)酵劑，含有大量微生物和酶類，在傳統(tǒng)白酒釀造過程中發(fā)揮重要的作用，故釀酒離不開曲，曲的品質(zhì)決定酒質(zhì)。高溫大曲是以小麥等為主要原料，經(jīng)多種微生物混合自然固態(tài)發(fā)酵而成，發(fā)酵最高溫度可達到65℃。高溫大曲為白酒釀造提供豐富的微生物種類、各種生物酶類以及多種香味前驅(qū)物質(zhì)，在傳統(tǒng)白酒釀造過程中發(fā)揮重要的作用[3-5]。高溫大曲中的微生物種類和數(shù)量直接決定著芝麻香型白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，研究高溫大曲中微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)及在發(fā)酵過程中微生物群落的變化情況等，對芝麻香型白酒的釀造機理和呈香機理都有重要作用，并對芝麻香型白酒釀造工藝的優(yōu)化具有重要意義[6-7]。

近年來對高溫大曲微生物群落多樣性研究的報道較多，主要集中在采用可培養(yǎng)方法和非培養(yǎng)方法研究其微生物群落多樣性。張明春等[8]采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和理化指標(biāo)分析方法，對白云邊高溫大曲和中溫大曲進行了比較研究，研究發(fā)現(xiàn)耐高溫的芽孢桿菌含量和種類較多；施安輝等[1]采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法對徐坊芝麻香型白酒大曲的微生物分布進行了分析，鑒定的微生物菌種包括細菌、酵母、霉菌和放線菌；Zheng等[9]采用傳統(tǒng)的分析方法對我國8種不同香型白酒的高溫、中溫和低溫大曲微生物多樣性進行分析，認為大曲中的微生物具有多樣性和功能性，是白酒釀造過程中的重要菌劑；葛媛媛等[10]利用高溫篩選和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，借助于核糖體DNA擴增片段限制性內(nèi)切酶(ARDRA)分型、分子鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育分析技術(shù)，研究了芝麻香型白酒高溫大曲嗜熱細菌群落結(jié)構(gòu)，篩選獲得的85株嗜熱細菌分別屬于Thermoactinomyces sp.，Bacillus sp.，Schlegelella sp.以及Streptomyces sp.，4個菌屬，其中第1優(yōu)勢菌為Thermoactinomyces vulgaris，豐度為69. 41 %；姚粟等[11]利用克隆文庫的方法研究了芝麻香型白酒高溫大曲的細菌群落多樣性，發(fā)現(xiàn)Thermoactinomyces、Kroppenstedtia、Saccharopolyspora、Lactobacillus和Weissella。

磷脂脂肪酸（PLFA）是存在于活細胞中的重要膜成分，是表征樣品中活體生物量和生物群落多樣性的重要標(biāo)記。不同種屬之間微生物差異明顯,且對于環(huán)境因素較為敏感,通過監(jiān)測特征磷脂脂肪酸組成和數(shù)量的變化，揭示微生態(tài)環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)組成及變化規(guī)律，目前廣泛的應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)的研究中[12-18]。本研究通過磷脂脂肪酸方法分析芝麻香型白酒高溫大曲生產(chǎn)過程中微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，以期對芝麻香型白酒的釀造提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

1.1.1樣品采集

2014年8月到2014年10月共采集11批制備不同階段的山東扳倒井股份有限公司高溫大曲樣品，表1列出了高溫大曲樣品的基本特征。每批次采樣都取曲房四邊部分及中間部分的5個曲塊進行粉碎混合，混合后的樣品作為一個樣品，密封，冷藏備用。

表1　高溫大曲樣品特征

1.1.2主要儀器及試劑

氣相色譜(Agilent GC 6850 Series)，Agilent；冷凍真空離心濃縮儀，Labconco；硅膠萃取小柱(SampliQ Silica)，Agilent。

定量標(biāo)準(zhǔn)品：1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，Avanti公司。除正己烷為色譜純外，其他有機試劑均為分析純。

1.2PLFA測定方法

1.2.1PLFA的提取

稱取1 g大曲樣品于離心管中，加入5 mL 50 mM磷酸緩沖液（pH7.4）、6 mL氯仿和12 mL甲醇，并加入5 μL 2.5 mM 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine作為內(nèi)標(biāo)，振蕩2 h，室溫下3500 r/min離心10 min。取上清液于分液漏斗，將沉淀加入5 mL磷酸緩沖液，6 mL三氯甲烷，12 mL甲醇，振蕩30 min，室溫下3500 r/min離心10 min，將上清液與之前的上清液合并，加入分液漏斗后，加入12 mL氯仿，12 mL磷酸緩沖液，振蕩2 min，過夜靜置分層，取下層溶液于玻璃試管中，真空離心濃縮儀中旋干，加入5份200 μL氯仿溶解總脂肪酸后轉(zhuǎn)移到硅膠萃取小柱中，分別加入5 mL氯仿、5 mL丙酮（2次）和少量甲醇清洗小柱后，加入5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于玻璃試管中，旋干即得到磷脂脂肪酸。

1.2.2PLFA甲基化

磷脂脂肪酸溶于1 mL甲苯與甲醇的混合液（v/v，1∶1），加入1 mL 0.2 M氫氧化鉀，搖勻，37℃水浴15 min，加入0.3 mL 1 M醋酸溶液，再加入2 mL正己烷，2 mL超純水萃取得到上層清液于玻璃試管中，再用2 mL正己烷重復(fù)萃取1次，取上清液合并到剛才試管中，旋干得到甲基化的磷脂脂肪酸，于4℃下保存待測。

1.2.3PLFA的氣相色譜分析

磷脂脂肪酸樣品用1 mL的正己烷溶解，進行氣相色譜分析。氣相色譜儀配備分流/不分流進樣口，氫火焰離子化檢測器(FID)及Agilent氣相色譜化學(xué)工作站。色譜柱為Ultra-2柱，長25 min，內(nèi)徑0.2 mm，液膜厚度0.33 μm；爐溫為二階程序升溫：起始溫度170℃，5℃/min升至260℃，隨后40℃/min升至310℃，維持1.5 min；進樣口溫度250℃，載氣為氫氣，流速0.5 mL/min，分流進樣模式，分流比100∶1，進樣2 μL；檢測器溫度300℃，氫氣流速30 mL/min，空氣流速216 mL/min，補充氣(氮氣)流速30 mL/min。

1.3數(shù)據(jù)處理

磷脂脂肪酸（PLFA）的鑒定和分析采用美國MIDI公司(MIDI, Newark, Delaware, USA)開發(fā)的基于細菌細胞脂肪酸成分鑒定的Sherlock MIS 4.5系統(tǒng)(Sherlock Microbial Identification System)。

2　結(jié)果與分析

2.1高溫大曲發(fā)酵過程中PLFA變化

圖1　高溫大曲制作過程中樣品PLFAs總量變化圖

通過檢測高溫大曲制備過程中不同階段曲樣PLFA含量（圖1），發(fā)現(xiàn)高溫大曲樣品的PLFA含量在0.35～3.23 mol/g，其中第20天和第25天曲樣PLFA含量達到最大值，為3.2 mol/g，而此時恰好是第2次翻曲和第3次翻曲，第23天曲樣PLFA含量最低為0.3 mol/g，位于2次翻曲之間，可見翻曲對曲樣PLFA含量的影響很大。

磷脂脂肪酸分析主要檢測碳鏈長度C9～C24的PLFA，我們將這些PLFA分為直鏈脂肪酸（Straight）、支鏈飽和脂肪酸（Branched）、單不飽和脂肪酸（PUFA）、多不飽和脂肪酸（MUFA）、環(huán)化脂肪酸（Cyclo）、羥基脂肪酸(Hydroxy)、10-甲基脂肪酸(10-methyl)以及二甲縮醛化脂肪酸(DMA)多種類型。測定結(jié)果表明，在高溫大曲制作過程中脂肪酸18∶2 w6,9c，支鏈飽和脂肪酸和直鏈脂肪酸的含量占主導(dǎo)地位（70 %～90 %），并且表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。脂肪酸18∶2 w6,9c和直鏈脂肪酸都呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，而支鏈飽和脂肪酸呈先增加后減少的趨勢，其中制曲的第9天（第1次翻曲）和第20天（第2次翻曲）是變化的轉(zhuǎn)折點，也是高溫大曲制備過程中的潛在關(guān)鍵點。

圖2　高溫大曲制作過程中樣品PLFAs組成變化圖

2.2高溫大曲發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)特征的變化情況

微生物群落結(jié)構(gòu)，即微生物不同類群的相對豐度，可通過各微生物類群的脂肪酸相對含量表征[19-20]，多不飽和脂肪酸可以作為真核微生物的標(biāo)志，而18∶2 w6,9和18:1ω9作為真菌的標(biāo)志，單不飽和脂肪酸則可以表征好氧革蘭氏陰性菌，支鏈脂肪酸用于表征革蘭氏陽性菌，10-甲基脂肪酸表征放線菌，二甲縮醛化脂肪酸表征厭氧細菌。

表2　用于生物分類的PLFAs標(biāo)記

高溫大曲制作過程中生物多樣性分析結(jié)果表明，真菌在整個過程中占主導(dǎo)地位（14.19 %～67.03 %），其含量呈現(xiàn)波浪形變化，先降低后升高，最低點出現(xiàn)在第9天和第20天曲樣，革蘭氏陽性菌（10.37 %～34.34 %），革蘭氏陰性菌（7.87 %～35.9 %）以及真核生物（3.27 %～18.82 %）的含量也呈現(xiàn)波浪形變化，先升高后降低，最高點出現(xiàn)在第9天和第20天的曲樣。此外，整個制曲過程中厭氧菌、放線菌以及絲狀真菌的含量都很低，這可能與這些菌無法在高溫下生長有關(guān)。生物多樣性組成分析發(fā)現(xiàn)，第1次翻曲和第2次翻曲對生物尤其是微生物群落結(jié)果有很大的影響，推測是高溫大曲制備過程中的潛在關(guān)鍵點。

圖3　高溫大曲制作過程中樣品生物組成變化圖

對大曲的PLFA分析結(jié)果進行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵時期的大曲可分為4類（見圖4）。圖4表明，發(fā)酵9 d、20 d的大曲聚為一組，發(fā)酵12 d大曲單獨聚為一組，0 d、2 d、5 d、15 d、23 d、25 d、45 d的大曲聚為一組，而發(fā)酵36 d的大曲單獨聚為一組。PLFA分析結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育分析與聚類分析結(jié)果一致（見圖5）。不同發(fā)酵時間的大曲據(jù)其PLFA種類的相似性或差異性的大小在樹冠處形成不同水平上的連接或分枝。聚合水平＞10時,不同發(fā)酵時間的大曲可分為4組,發(fā)現(xiàn)這4組的分類與主成分分析結(jié)果一致的。從聚類分析和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果來看，發(fā)酵9 d和20 d的聚在一起，而其大曲PLFA的成分與其他的發(fā)酵曲樣的PLFA成分相距較遠，也可以從側(cè)面反映出9 d和20 d的翻曲是高溫大曲制備過程中的關(guān)鍵點。

圖4　不同發(fā)酵時間的高溫大曲的PLFA聚類分析圖

圖5　不同發(fā)酵時間的高溫大曲的PLFA系統(tǒng)發(fā)育分析圖

芝麻香型高溫大曲整個制備過程中，PLFA含量呈波浪形變化，發(fā)酵第20天和第25天PLFA含量達到峰值，表明這兩個時間點的大曲中生物量最為豐富，而PLFA含量最低點恰好出現(xiàn)在發(fā)酵第23天，即2次翻曲中間，可見翻曲對高溫大曲生物量的重要影響，因此翻曲是高溫大曲制備過程中最為關(guān)鍵的工序。此外，高溫大曲制備過程中18∶2 w6,9c、單不飽和脂肪酸、直鏈和支鏈飽和脂肪酸是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢磷脂脂肪酸（70 %～90 %），并且表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。脂肪酸18:2 w6,9c和直鏈脂肪酸都呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，而支鏈飽和脂肪酸呈先增加后減少的趨勢，其中制曲的第9天（第1次翻曲）和第20天（第2次翻曲）是變化的轉(zhuǎn)折點，再次表明翻曲是高溫大曲制備過程中的關(guān)鍵點。

3　討論

通過前面PLFA的方法分析了整個大曲制曲過程中微生物群落的變化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵第9天、第20天、第25天和第36天是4次翻曲過程中微生物群落數(shù)量或者是種類都會有明顯的不同，這是由于在翻曲時，會使大曲的內(nèi)部生長環(huán)境發(fā)生變化，最容易使大曲中的微生物群落發(fā)生改變，從而使檢測出來的磷脂脂肪酸的數(shù)量和種類也發(fā)生變化，從檢測結(jié)果看也正說明了這一點，而其他時間點的微生物菌落相對比較穩(wěn)定。由于翻曲的變化會造成微生物供氧量增加，這樣會使真核生物、真菌和好氧菌大量生長，發(fā)酵20 d及25 d時，從檢測數(shù)據(jù)來看雖然真菌的相對豐度是下降的，但是絕對數(shù)量卻是上升的，而真核生物及好氧菌相對豐度是上升的，絕對數(shù)量更是上升的。

此次研究主要采用了PLFA方法，顯而易見PLFA方法在分析環(huán)境微生物中有許多優(yōu)勢,但也存在著不足之處，這就導(dǎo)致本次用PLFA方法來分析高溫大曲中的微生物也存在一些不足[21]：(1)由于并不知道大曲中所有微生物的特征脂肪酸,因此在許多情況下,大曲中存在的某種特殊脂肪酸無法與大曲中特定種類的微生物相對應(yīng),因而,磷脂脂肪酸分析方法不能對微生物在種或菌株水平上加以區(qū)分；(2)該分析方法在很大程度上依賴于標(biāo)記脂肪酸來確定大曲微生物群落結(jié)構(gòu),因而標(biāo)記上的變動將導(dǎo)致群落估算上的偏差；(3)細菌和真菌能夠產(chǎn)生大量不同類型的磷脂脂肪酸,因而生長條件的改變或環(huán)境脅迫都能導(dǎo)致脂肪酸類型的改變。

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白云邊在荊州連獲兩項殊榮

本刊訊：2016年2月15日，湖北省荊州市工業(yè)經(jīng)濟、招商引資暨安全生產(chǎn)工作會議召開。湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司摘得“2015年度全市工業(yè)經(jīng)濟稅收貢獻十強”“2015年度全市安全生產(chǎn)工作先進單位”兩項殊榮，受到荊州市政府通報表彰。

2015年，面對宏觀經(jīng)濟持續(xù)下行、白酒市場深度調(diào)整的壓力，白云邊始終堅持穩(wěn)中求進、做真做實不動搖，按照年初確定的“強基礎(chǔ)、補短板、提質(zhì)效、增后勁”工作方針，以市場為導(dǎo)向，加強綜合協(xié)調(diào)，搶抓旺季增量，克難攻堅，逆勢而進，勝利完成全年經(jīng)營目標(biāo)。全年上交稅金8.06億元，比上年增長13.68 %，增長額近1個億，連續(xù)八年雄居荊州市工業(yè)企業(yè)納稅第一。2015年，白云邊以貫徹執(zhí)行新《安全生產(chǎn)法》為主線，以安全隱患排查與治理為重點，以防范和遏制重特大事故發(fā)生為目標(biāo)，堅持“安全第一，預(yù)防為主，綜合治理”的方針，層層落實安全生產(chǎn)責(zé)任制，健全安全生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化管理體系，有效保障了公司生產(chǎn)安全平穩(wěn)運行。通過塑造安全生產(chǎn)文化，提高員工安全意識，職工安全理念開始從“要我安全”到“我要安全”轉(zhuǎn)變，推進企業(yè)安全生產(chǎn)達到了一個新水平。（王小波）

Phospholipid Fatty Acid Analysis (PLFA) of the Dynamic Change of Microbial Communities in the Production Process of High-temperature Daqu for Zhimaxiang Baijiu

CAO Yu1, ZHAI Lei1，XIN Chunhui2，XU Ling2，YAO Su1and CHENG Chi1
（1.China Center of Industrial Culture Collection,National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100027; 2.Shandong Bandaojing Co.Ltd., Zibo, Shandong 256300, China)

Abstract:High-temperature Daqu is the typical saccharifying agent of Zhimaxiang Baijiu. It plays an important role in traditional Baijiu production by providing rich microbial species, varieties of biological enzymes, and multiple flavoring precursor substances. In this study, PLFA was applied to investigate the dynamic change of microbial biomass and community structure in the production process of Zhimaxiang hightemperature Daqu. The results sowed that, fungi were dominant in the whole Daqu-making process, and the biomass and species of bacteria presented regular change rules in the 1st and the 2nd Daqu-turning process. It can be inferred that the 1st and the 2nd Daqu-turning played key roles in Daqu-making.

Key words:Zhimaxiang Baijiu; high-temperature Daqu; PLFA; microbial community

通訊作者：程池（1962-），教授級高級工程師，博士生導(dǎo)師。

作者簡介：曹宇（1982-），男，湖北黃岡人，助理工程師，碩士。

收稿日期：2015-10-12

DOI：10.13746/j.njkj.2015398

中圖分類號：TS262.3；TS261.1；TQ925.7

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）03-0033-04

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-02-15；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160215.1438.001.html。