土壤化學(xué)性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)與姜瘟發(fā)生相關(guān)性分析

陳艷麗 姚愛(ài)梅 徐義

摘要：受土壤酸化及集約化連作種植的影響，姜瘟成為制約生姜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因子，但在重慶市榮昌區(qū)發(fā)現(xiàn)一些連續(xù)種植10年以上的姜田姜瘟發(fā)生較輕或不發(fā)生。為了解土壤因子對(duì)姜瘟的影響，采集該地區(qū)易發(fā)與不易發(fā)姜瘟22個(gè)田塊的土壤樣品，測(cè)2組土樣的理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)[磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，簡(jiǎn)稱PLFA）法]，以探究其與姜瘟發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果表明，姜瘟的發(fā)生與土壤生物及非生物因子有密切關(guān)系，其中土壤含水量、酸堿度、微生物群落是影響姜瘟發(fā)生的主要因素，且有效磷、緩效鉀、有效硼、全氮可促進(jìn)土壤中有益菌群及抑制有害菌群數(shù)量。

關(guān)鍵詞：土壤化學(xué)性質(zhì);微生物群落;生姜;土壤因子;微生物群落結(jié)構(gòu);改良土壤;防控姜瘟

中圖分類號(hào)： S153;S154.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0152-05

生姜（Zingiber officinale Rosc.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，隨著種姜產(chǎn)業(yè)規(guī)模擴(kuò)大和集約化連作種植模式的推廣，姜產(chǎn)區(qū)病害尤其是姜瘟病日益加重，發(fā)病較輕田塊損失20%～30%，重者損失達(dá)50%以上，甚至絕產(chǎn)[1-3]。盡管生產(chǎn)中常采用化學(xué)、農(nóng)業(yè)等防治方法[2]，但總體防效較差，并易出現(xiàn)農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、病原菌抗藥耐藥等問(wèn)題。

姜瘟是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的毀滅性土傳病害[4]，該病原菌可在土壤中長(zhǎng)期存活并成為次年病害的主要侵染源，其侵染途徑主要通過(guò)地下莖基部及根部的自然孔口和傷口，因此該病原菌的生長(zhǎng)受土壤生物及非生物因素的影響。Huet等報(bào)道稱，一些土壤可抑制青枯病害的發(fā)生，并發(fā)現(xiàn)該類土壤均可抑制病原菌在土壤中的數(shù)量[5-7]，在重慶市榮昌地區(qū)也存在連續(xù)種植生姜田塊不易發(fā)病現(xiàn)象。有報(bào)道稱這與土壤抑制病原菌[8]和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性[9-10]有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，單一礦物鈣（Ca）、硼（B）、鎂（Mg）等對(duì)青枯菌的生長(zhǎng)及致病性有顯著的抑制作用[8，11]，且土壤根際微生物群落和病原菌相對(duì)平衡[12]及微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，對(duì)病原菌大量積累有顯著的抑制作用[13-14]。然而土壤因素與姜瘟發(fā)生之間關(guān)系的研究相對(duì)甚少，從而阻礙了從土壤角度對(duì)姜瘟的防控。因此，本研究選擇姜瘟連年發(fā)生嚴(yán)重和不易發(fā)姜瘟的多個(gè)田塊，取樣分析各田塊土壤理化性質(zhì)，并利用磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，簡(jiǎn)稱PLFA）法[15]分析微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系，旨在為改良土壤防控姜瘟提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況、采集與分析

試驗(yàn)土樣采自重慶市榮昌區(qū)盤龍鎮(zhèn)（105°33′E，29°33′N），該地區(qū)海拔約600 m，屬于中亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，夏季平均氣溫在35 ℃左右，雨量也較為充足。該地區(qū)主要經(jīng)濟(jì)作物為生姜，經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)隨著植姜面積的不斷擴(kuò)大，姜瘟也日益加重，且每年7—9月氣溫及降水量較高時(shí)是姜瘟發(fā)生高峰期，但有些地塊連續(xù)種植生姜10年以上發(fā)病仍較輕;即使同一品種的生姜，在不同田塊間發(fā)病較為明顯，因此推測(cè)姜瘟的發(fā)生與土壤狀況有一定的關(guān)系。2015年7月15日在種植戶介紹下分別采集11份不易發(fā)病的土壤和連年發(fā)病較重的2類土壤，不易發(fā)病姜田土壤命名為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10、B11;易發(fā)病姜田土壤命名為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11。供試土壤為酸性紫色土，每個(gè)田塊采集5～15 cm土層土壤用多點(diǎn)混合法[16]形成1個(gè)土壤樣品，共22個(gè)土壤樣品。采集的土壤樣品經(jīng)去除根系等雜物后，一部分過(guò)2 mm篩、混合均勻用于土壤微生物PLFA分析，另一部分土壤樣品風(fēng)干、過(guò)篩、混合均勻，用于土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定。

1.2 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

土樣中鈣含量、鎂含量、pH值、有效磷（P）含量、全氮（TN）含量、有效硼含量、緩效鉀（K）含量、有機(jī)質(zhì)（SOM）含量、堿解氮（N）含量、土壤含水量（soil moisture，簡(jiǎn)稱SM）均參照楊劍虹等編著的《土壤農(nóng)化分析》中的方法[16]進(jìn)行測(cè)定。

1.3 土壤微生物PLFA分析

土壤過(guò)2 mm篩，去除石礫和植物殘?bào)w等雜物，稱取8 g土樣進(jìn)行提取、皂化、甲基化、萃取以及堿洗滌后獲得上機(jī)樣品，用Agilent 6850氣相色譜儀分析磷脂脂肪酸的成分，色譜條件為HP-5（25.0 m×200 μm×0.33 μm），進(jìn)樣量為 1 μm，分流比為10 ∶ 1，載氣為H2，尾吹氣為高純N2，助燃?xì)鉃榭諝?，流速?.8 mL/min。汽化室溫度為250 ℃，檢測(cè)器溫度為300 ℃，柱前壓為68.95 kPa，質(zhì)譜全掃描范圍為30～600質(zhì)荷比（m/z）;二階程序柱溫從170 ℃起始，5 ℃/min升至260 ℃，然后以40 ℃/min升至310 ℃，維持1.5 mim。各成分脂肪酸通過(guò)MIDI Sherlock微生物檢定系統(tǒng)進(jìn)行，數(shù)據(jù)處理中PLFA的絕對(duì)含量用C19 ∶ 0做內(nèi)標(biāo)進(jìn)行換算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin Pro 8.6、SPSS 19.0和Canoco 5.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤酸堿度及含水量與姜瘟發(fā)生的相關(guān)性

土壤酸堿度及水分對(duì)生姜的正常生長(zhǎng)和病原菌的生長(zhǎng)及侵染有一定的影響。由圖1可知，本研究土樣pH值范圍為3.8～4.7，不易發(fā)病土壤pH值小于4.0的土樣占83.3%。由圖2可知，土壤含水量范圍為15.42%～21.12%，易發(fā)病土壤含水量高于18.29%的土壤占83.3%，表明姜瘟在偏酸及偏干燥的土壤中不易發(fā)病。推測(cè)在較干的強(qiáng)酸性土壤中青

枯菌的生長(zhǎng)可能受到抑制。劉銘發(fā)現(xiàn)，姜瘟病原菌僅在中性或微酸性條件下進(jìn)行侵入和增殖，發(fā)病較重[17];而Ho等發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)酸性土壤對(duì)青枯菌的生長(zhǎng)不利[6]。大量研究也表明，生姜通常在多雨季節(jié)、黏重潮濕、低洼的田塊易發(fā)病，而在透氣保肥較好的沙壤土中發(fā)病較輕[5]。

2.2 生姜易發(fā)與不易發(fā)姜瘟根際土壤礦質(zhì)元素及微生物群落狀況差異分析

重慶市榮昌區(qū)盤龍鎮(zhèn)姜田土壤為酸性紫色土，其養(yǎng)分含量如表1所示，姜田土壤礦質(zhì)元素普遍含量較低，這與酸性土壤的強(qiáng)烈淋溶現(xiàn)象有關(guān)。在不易發(fā)姜瘟土壤中，K含量和P含量除外，Ca、Mg、B這些指標(biāo)均低于易發(fā)病土樣指標(biāo)，且2組土樣中Ca含量、Mg含量、P含量之間的差異達(dá)到顯著水平。緩效鉀作為土壤有效鉀的直接補(bǔ)充來(lái)源，兩者之間存在動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，且土壤中的含鉀量可相互反映，姜田緩效鉀含量低于58 mg/kg，說(shuō)明該土壤處于缺鉀狀態(tài)且供鉀能力不強(qiáng)，但生姜對(duì)鉀的需求較高，因此該地區(qū)生姜的正常生長(zhǎng)發(fā)育受到鉀含量的影響。

2.3 姜瘟易發(fā)與不易發(fā)土壤化學(xué)性質(zhì)及優(yōu)勢(shì)菌群的主成分分析

每種標(biāo)記性脂肪酸代表不同類群的微生物，通過(guò)聚類及主成分分析可知，熒光假單孢桿菌（i16 ∶ 0）、腐生真菌（18 ∶ 1w9c）、伯克霍爾德菌（18 ∶ 0、Cy19 ∶ 0ω8c）、雷爾氏菌屬（16 ∶ 1 2OH）、叢枝菌根真菌（16 ∶ 1w5c）、優(yōu)勢(shì)放線菌（10Me17 ∶ 0、10Me 18 ∶ 0）屬于該土壤中的主要菌群。

結(jié)合以上原則，通過(guò)2組土壤生物及非生物因子共提取出6個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為87.57%，第1、第2主成分分別為41.74%、19.22%，解釋了土壤因子影響姜瘟發(fā)生現(xiàn)象。由圖3可知，2組土樣中大部分土樣表現(xiàn)出較為明顯的差異，但小部分土壤不能清楚地區(qū)分，這與正常和患病生姜根際細(xì)菌群落種群相似度高達(dá)70%有關(guān)[18]。

土傳病害的發(fā)生與土壤微生態(tài)環(huán)境惡化、微生物群落結(jié)構(gòu)失衡有緊密的聯(lián)系[11]。不易發(fā)病土壤中真菌PLFAs/細(xì)菌PLFAs比值較低，且低于0.07的土樣占75.0%（圖4）;放線菌PLFAs/真菌PLFAs較高，大于0.95的土樣占87.5%，易發(fā)姜瘟土壤中放線菌數(shù)量明顯減少（圖5）。Wang等研究也表明，隨著番茄青枯病發(fā)病加重，土壤中真菌數(shù)量/細(xì)菌數(shù)量比例增加，土壤微生物由細(xì)菌型積累向真菌型轉(zhuǎn)化，土壤營(yíng)養(yǎng)類型從富營(yíng)養(yǎng)型向貧瘠方向轉(zhuǎn)變[19]。

2.4 姜瘟易發(fā)與不易發(fā)土樣化學(xué)性質(zhì)及優(yōu)勢(shì)菌群的主成分分析

由表2、表3可知，不易發(fā)病土壤理化性質(zhì)、優(yōu)勢(shì)菌指標(biāo)分別有4、2個(gè)主要成分，即{K、SM}，{pH值、Ca}，{SOM}，{B}和{a17 ∶ 0、cy17 ∶ 0、i16 ∶ 0、i17 ∶ 0、a15 ∶ 0}，{10Me17 ∶ 0、10Me18 ∶ 0、16 ∶ 1 2OH}類， 解釋了土壤化學(xué)性質(zhì)及土壤優(yōu)勢(shì)菌對(duì)姜瘟發(fā)生的影響，其方差累積貢獻(xiàn)率分別占原變量總方差的90.73%、75.46%，分別保留了原變量的特征、差異和相關(guān)性。

由表4可知，易發(fā)姜瘟土壤非生物、生物指標(biāo)分別有3、2個(gè)主要成分，即{Mg、TN、Ca、SM}，{P}，{N}和{ i16 ∶ 0、i17 ∶ 0、18 ∶ 0、a17 ∶ 0、cy19 ∶ 0w8c、16 ∶ 1 2OH、i15 ∶ 0、a15 ∶ 0、18 ∶ 1w9c}，{10Me18 ∶ 0}類，其方差的累積貢獻(xiàn)率分別占原變量總方差的78.22%、80.40%。

結(jié)合表1，將表2、表3中的因子分析結(jié)果進(jìn)行比較，表明2組土樣之間主成分有明顯差異。且在2組土樣中SM的第1主成分的值較高， 分別為0.851和0.849，因此說(shuō)明姜瘟是否發(fā)生與土壤含水量有很大關(guān)系。在不易發(fā)病土壤中，K、pH值、B的值均加，說(shuō)明在不易發(fā)病土壤中，它們的作用增加。研究表明硼酸鈉可以抑制青枯菌的生長(zhǎng)，減少土壤中青枯菌的殘存量， 且鉀肥可提高生姜的抗性[20]， 因此推測(cè)姜瘟不易由表3、表4、表5可知，在不易發(fā)病土壤中優(yōu)勢(shì)放線菌的作用增大;在易發(fā)病土壤中有害菌群Cy19 ∶ 0ω8c和16 ∶ 1 2OH及18 ∶ 1w9c中的值增加，這些菌在易發(fā)病土壤中的作用增加，說(shuō)明該土樣中有害菌和土壤中的植株殘?jiān)^多，病株殘?jiān)蔀榇文瓴≡闹饕獊?lái)源。

2.5 土壤各菌群及優(yōu)勢(shì)菌與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性分析

土壤微生物直接參與土壤養(yǎng)分的釋放和固定過(guò)程，對(duì)土壤肥力的演變、有害生物的防治[12，21]、生態(tài)環(huán)境惡化的緩沖能力及土壤的修復(fù)起重要作用[13]。由表6可知，土壤理化性質(zhì)會(huì)影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，K含量與各類菌群的PLFAs均呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系;TN含量與除放線菌外的其他菌PLFAs均呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系;這可能與K含量、TN含量能影響微生物生長(zhǎng)及數(shù)量有關(guān)[29]。因此推測(cè)K含量、TN含量影響病害的原因與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有關(guān)。

由圖6冗余分析（gradient length<3）可知，易發(fā)病土壤主要分布在一、二象限，不易發(fā)病土壤主要分布在三、四象限，pH值主要分布在易發(fā)病區(qū)域，P含量主要分布在不易發(fā)病區(qū)域，因此pH值和P含量對(duì)姜瘟的發(fā)生影響較大，隨著pH值的 增大、P濃度的減少姜瘟易發(fā)生。P含量與 16 ∶ 1w5c、10Me18 ∶ 0;K含量與i16 ∶ 0、16 ∶ 1w5c、18 ∶ 1w9c;TN與 i16 ∶ 0、10Me17 ∶ 0的夾角較小，說(shuō)明熒光假單胞菌、叢枝菌根真菌、腐生真菌和優(yōu)勢(shì)放線菌的豐度隨著TN、P、K含量的增加而遞增;pH值、B含量與 16 ∶ 1 2OH、Cy19 ∶ 0ω8c夾角大于90°，說(shuō)明雷爾氏菌屬和伯克霍爾德菌的量隨著pH值、B含量的增加而遞減。

大量研究表明，土著有益菌對(duì)土壤病原菌的定殖、生長(zhǎng)、繁殖有抑制作用，如熒光假單胞菌對(duì)姜瘟[22]和番茄青枯病有抑制作用[9]，且?guī)追N拮抗菌共同作用時(shí)防治效果更好[12]。叢枝菌根真菌能降低土壤中青枯菌的數(shù)量[23]，增加根際其他微生物數(shù)量，具有改良土壤的能力[24]，P含量可提高叢枝菌根真菌在植物根部的定殖能力[25]。

3 結(jié)論與討論

綜上可知，土壤放線菌及土壤有益菌含量較高，由于連作及酸性土壤強(qiáng)烈淋溶作用的影響，不易發(fā)生姜瘟土壤礦質(zhì)元素普遍偏低。且在易發(fā)病土壤中雖然土壤礦物質(zhì)元素含量大多較高，如對(duì)大多數(shù)病害具有抑制作用的鈣、鎂的含量顯著高于不易發(fā)姜瘟土壤，但是在該類土壤中土壤有害菌群如雷爾氏菌屬、伯克霍爾德菌等含量較高，因此可推測(cè)出在種植生姜的酸性紫色土壤中微生物群落對(duì)姜瘟土傳病害的影響作用稍大于土壤營(yíng)養(yǎng)元素。但土壤微生物的組成及活性也受到土壤理化性質(zhì)的影響[26-27]，由表6可知，K含量與土壤微生物均呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明K含量可提高土壤群落微生物的數(shù)量，且K含量對(duì)提高植物抗性有一定的促進(jìn)作用。由圖6可知，P、TN、K含量與拮抗菌群熒光假單胞桿菌、叢枝菌根真菌等之間的夾角小于90°，說(shuō)明P、TN、K含量對(duì)這些菌有一定的促進(jìn)作用，B含量對(duì)有害菌群雷爾氏菌屬和伯克霍爾德菌有一定的抑制作用。因此可適當(dāng)提高鉀、有機(jī)肥及硼肥的含量來(lái)改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，從而對(duì)提高生姜產(chǎn)量有更明顯的作用。

大量研究表明，微肥在修復(fù)土壤和防治土傳病害中起重要作用[12]，但在姜瘟土傳病害中結(jié)合土壤理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)土壤的方法方面，參考數(shù)據(jù)較少，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)生物炭和熏蒸措施改變土壤微生物群落防病的同時(shí)，提高了土壤中TN、P、K含量[14，28]，而在不易發(fā)病土壤中元素主成分分析可知，TN、P和K含量均有增加，因此TN、P、K含量對(duì)不易發(fā)病土壤的影響作用較大，由此說(shuō)明這些元素在防治青枯病害的同時(shí)改善了土壤的理化性質(zhì)，從而增強(qiáng)土壤的抗病能力。因此，在改土防病時(shí)從土壤的生物及非生物因素著手，效果可能更為明顯。

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