解淀粉芽孢桿菌草酸脫羧酶基因的克隆、原核表達與活力測定

白雪 張慧莉 黃沖

摘要：為進一步明確解淀粉芽孢桿菌C（10）的草酸脫羧酶基因的生物功能，克隆其關(guān)鍵基因?qū)υ摶蜻M行原核表達。通過PCR技術(shù)克隆了淀粉芽孢桿菌C（10）的草酸脫羧酶基因，構(gòu)建了原核生物表達載體pET28a-Baoxdc，對其進行表達與純化。結(jié)果表明，擴增所獲解淀粉芽孢桿菌C（10）的草酸脫羧酶全基因序列全長為1 161 bp，在大腸桿菌中進行表達，添加誘導(dǎo)劑IPTG、MnCl2至終濃度分別為0.6、6 mmol/L，誘導(dǎo)4 h時的酶活力和比活力最高，分別為3.793 2 U/mL和3.145 3 U/mg。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;草酸脫羧酶;克隆;原核表達;酶活測定

中圖分類號： Q786;S188? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）12-0066-04

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）為革蘭氏陽性短桿菌，是一種好氧、嗜溫并且產(chǎn)芽孢的桿狀細菌[1]。它生長繁殖較快，可以利用的營養(yǎng)物質(zhì)種類十分豐富，能夠抗菌、消毒，可產(chǎn)生多種抗菌素和酶類，具有一定程度的廣譜抗菌活性以及極強的抗逆性能，對人、畜無毒害作用[2]。

解淀粉芽孢桿菌的自身代謝產(chǎn)物中有一種重要的產(chǎn)物是γ-聚谷氨酸（poly-γ-glumatic，γ-PGA），它是自然界中的一些微生物（主要是芽孢桿菌屬）合成的具有水溶性、可生物降解的陰離子型多聚氨基酸[3]。γ-聚谷氨酸擁有良好的吸水性、成膜性、絮凝性、成纖維性、阻氧性、可塑性以及黏結(jié)性，在食品工業(yè)、化妝品行業(yè)、菌種保藏及污水處理等方面具有廣泛的用途[4]。自1942年Bovarnick等發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌可以在培養(yǎng)基中累積γ-PGA至今[5]，對于使用微生物發(fā)酵法合成γ-PGA的研究就一直比較活躍。

經(jīng)查閱相關(guān)文獻，在解淀粉芽孢桿菌γ-PGA的代謝通路中有一種活性較高的草酸脫羧酶，它能將草酸轉(zhuǎn)化為甲酸，從而降解為二氧化碳，而草酸是γ-PGA的刺激劑，能刺激細胞內(nèi)γ-聚谷氨酸的高產(chǎn)。草酸（oxalic acid，OA）是自然界中酸性最強的有機二元羧酸，能溶于水和乙醇，通常由植物、微生物通過水解草酰乙酸或氧化乙醛酸、抗壞血酸產(chǎn)生[6]。草酸脫羧酶（oxalate decarboxylase，OXDC）是一種包含Mn2+的均一聚合酶，屬Cupin蛋白超家族[7];它可在沒有輔因子的條件下催化草酸轉(zhuǎn)化為甲酸和CO2，是植物、微生物中草酸代謝降解的主要催化酶之一[8]。基于這一原理，本試驗將對草酸脫羧酶基因進行原核表達，并初步探究誘導(dǎo)表達條件。

目前，標(biāo)準(zhǔn)菌株解淀粉芽孢桿菌DSM7全基因組已被解析出來，根據(jù)生物信息學(xué)分析，其中oxdC序列為草酸脫羧酶基因[9]，但并未進行試驗進行驗證，同時也沒有文獻報道研究過解淀粉芽孢桿菌的草酸脫羧酶基因[10]。因此本試驗重點闡述了來源于解淀粉芽孢桿菌C（10）的草酸脫羧酶基因oxdC經(jīng)過克隆并構(gòu)建新的重組載體，成功地轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，并在原核表達系統(tǒng)中得到穩(wěn)定遺傳，根據(jù)單因素梯度試驗確定了重組草酸脫羧酶最佳的誘導(dǎo)表達條件，這為草酸脫羧酶的相關(guān)后續(xù)試驗奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 解淀粉芽孢桿菌C（10）（B. amyloliquefaciens）為筆者所在實驗室保藏;大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和BL21分別由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黃先忠教授和崔百明教授惠贈;原核表達載體pET28a（+）由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李鴻彬教授惠贈。

1.1.2 試劑 酵母提取物購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;胰化蛋白胨購自BBI;瓊脂糖購自BIOWEST;Tris購自ICN;SDS購自Biotech;乙二胺四乙酸二鈉購自Biosharp;限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司;2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;Kanamycine、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、硼酸均購自北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌C（10）oxdC基因的克隆 根據(jù)NCBI網(wǎng)站基因數(shù)據(jù)庫中解淀粉芽孢桿菌DSM7的草酸脫羧酶oxdC的基因序列，設(shè)計1對特異引物：oxdC-F，5′-CGGGATCCATGTCAAAAGAAAACAACTGCAATATCCCGC-3′（下劃線為BamH Ⅰ酶切位點）;oxdC-R，5′-CCGCTCGAGTCAGCATTTCTTTTTGACGACTGGATG-3′）（下劃線為Xho Ⅰ酶切位點，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）。以解淀粉芽孢桿菌基因組DNA為模板進行PCR的擴增，反應(yīng)體系為2×Taq PCR Mastermix[其中包含0.1 U/μL Taq聚合酶、500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl（pH值8.3）、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2以及其他穩(wěn)定劑和增強劑]25 μL，模板1 μL（每個反應(yīng)小于1 μg），正反向引物（10 μmol/L）各2 μL，加ddH2O補足50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠（濃度為1%）電泳分離、鑒定，根據(jù)marker片段比對擴增產(chǎn)物，確定擴增產(chǎn)物片段大小無誤之后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對目的片段進行割膠回收[11]。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-BaoxdC的構(gòu)建 回收后的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ進行雙酶切，同時用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ對表達載體pET28a（+）進行雙酶切，37 ℃酶切3 h后使用瓊脂糖凝膠電泳分離并對酶切產(chǎn)物進行檢測，正確條帶經(jīng)割膠回收檢測純化之后，對oxdC酶切產(chǎn)物與pET28a（+）酶切產(chǎn)物按摩爾比1 ∶ 4進行過夜連接，使用T4 DNA連接酶進行連接，16 ℃過夜，以此來構(gòu)建pET28a-BaoxdC重組質(zhì)粒。檢測并純化連接產(chǎn)物。

將酶切鑒定和序列測定后的重組質(zhì)粒pET28a-BaoxdC使用常規(guī)化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2）法進行化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化后的pET28a-BaoxdC重組子細胞涂布LB固體培養(yǎng)基平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h。

于平板上隨機挑取10個邊緣整齊、大小適中的轉(zhuǎn)化子單克隆菌落，在裝有15 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中于37 ℃、200 r/min 振蕩過夜培養(yǎng)，隨后取菌液作為模板，以oxdC-F/oxdC-R作為引物進行菌液PCR，菌液PCR反應(yīng)體系為2×Taq PCR Mastermix[其中包含0.1 U/μL Taq、500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl（pH值8.3）、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2以及其他穩(wěn)定劑和增強劑]25 μL，模板接觸即可（每個反應(yīng)小于1 μg），正反向引物（10 μmol/L）各 2 μL，加ddH2O補足至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個循環(huán);72 ℃ 充分延伸5 min。菌液PCR結(jié)果由瓊脂糖凝膠電泳分離并鑒定，最后選取2個陽性克隆子，菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 oxdC基因的原核表達及粗酶液的提取 將陽性克隆子的測序結(jié)果與NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中的解淀粉芽孢桿菌DSM7草酸脫羧酶基因oxdC使用NCBI網(wǎng)站BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST）進行序列比對分析，選取100%配對的pET28a-BaoxdC重組子，對應(yīng)相應(yīng)的克隆，將LB液體培養(yǎng)基于37 ℃、200 r/min過夜振蕩培養(yǎng)，隨后抽提重組質(zhì)粒[12]。使用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pET28a-BaoxdC轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，于37 ℃、IPTG誘導(dǎo)下進行表達并純化，方法如下：將含有pET28a-BaoxdC的BL21（DE3）菌株于 37 ℃ 下在LB液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)，以菌液量與培養(yǎng)基體積比為1 ∶ 100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.6，此時加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，同時加入MnCl2至終濃度為6 mmol/L，于37 ℃、200 r/min條件下誘導(dǎo)表達10 h。隨后5 000 g離心15 min收集菌體，棄去上清，菌體沉淀按照與培養(yǎng)液體積比為1 ∶ 10的比例，懸浮于含有0.5 mol/L NaC1的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH值7.6）中，于冰浴條件下使用超聲波破碎儀進行細胞破碎，破碎條件：破碎1 s，暫停2 s，破碎總時間為8 min，功率為50%。破碎之后進行 4 ℃、10 000 g 離心30 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至1個干凈的EP管中，上清和沉淀分別取樣，并用12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并用考馬斯亮藍染色檢測蛋白的表達情況[13]。

1.2.4 粗酶液蛋白濃度及酶活力的測定 蛋白濃度采用考馬斯亮藍法（Bradford法）蛋白濃度測定試劑盒測定。草酸脫羧酶活力檢測參考Sasikumar等的方法[14]。于1.5 mL的反應(yīng)體系之中，添加76 mmol/L草酸鈉0.2 mL，50 mmol/L 檸檬酸緩沖液（pH值4.0）1.2 mL，在37 ℃溫度下水浴2 min，加入草酸脫羧酶液0.1 mL開始反應(yīng)，10 min后迅速加入等體積的0.2 mol/L磷酸氫二鉀使體系的pH值快速上升至中性，從而終止反應(yīng);反應(yīng)液使用0.22 μm微孔濾膜進行過濾，以草酸鈉作為底物，以此測定草酸脫羧酶的活力，利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測反應(yīng)生成的甲酸。色譜柱為Aminexresin-based 87H柱，柱溫60 ℃，流動相為0.005 mol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min;使用紫外檢測器210 nm進行檢測，進樣量為20 μL。

首先制作甲酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度，根據(jù)甲酸濃度與HPLC 210 nm處吸收峰面積的線性關(guān)系，以此來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后利用Bradford法測定蛋白濃度。根據(jù)稀釋的系列濃度梯度，繪制出蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA的濃度與575 nm處吸光度的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算出樣品的甲酸濃度與蛋白濃度之間的線性比例關(guān)系。在測定粗酶液蛋白濃度時，稀釋1倍之后再測定其吸光度，即實際蛋白濃度應(yīng)加倍。定義酶活單位：1 min催化轉(zhuǎn)化草酸產(chǎn)生 1 μmol 甲酸的酶量，以此來計算草酸脫羧酶酶活。由于破碎細胞時，細胞重懸后溶液體積過小，不利于破碎的進行，于是稀釋1倍后進行破碎，所以離心后的菌體沉淀實際是按照液體培養(yǎng)基的20%進行重懸，故酶活應(yīng)為10%重懸菌體沉淀的一半。酶的比活力即為單位質(zhì)量（mg）酶所具有的酶活力單位數(shù)，酶活力與酶濃度之比即為草酸脫羧酶比活力，與酶液濃度無關(guān)，因此數(shù)據(jù)比較具有代表性。

1.2.5 誘導(dǎo)條件對重組草酸脫羧酶表達的影響 在液體培養(yǎng)基中，以體積比為1%的接種量進行接種，待D600 nm為0.6左右時，添加IPTG至終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，同時添加MnCl2至終濃度為0.6 mmol/L，誘導(dǎo)表達4 h，測定并計算酶活、比活力，得出最佳IPTG誘導(dǎo)濃度;在最佳IPTG誘導(dǎo)濃度條件下，分別設(shè)置時間梯度2、4、6、8 h，得出最佳IPTG誘導(dǎo)時間，以此來確定不同IPTG濃度與誘導(dǎo)時間對草酸脫羧酶表達量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌C（10） oxdC基因的克隆

以解淀粉芽孢桿菌C（10）為模板，使用特異性引物oxdC-F/oxdC-R擴增得到1 161 bp左右的oxdC基因目的片段（圖1），該片段經(jīng)測序并在NCBI網(wǎng)站使用BLAST功能與解淀粉芽孢桿菌DSM7的草酸脫羧酶基因（oxdC）進行比對，相似度為100%。

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-BaoxdC的酶切鑒定

使用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ對重組質(zhì)粒pET28a-BaoxdC進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)用瓊脂糖凝膠進行檢測，結(jié)果如圖2所示。重組質(zhì)粒pET28a-BaoxdC經(jīng)酶切后出現(xiàn)一大一小2個片段，大片段與pET28a空載體大小基本吻合，小片段在1 200 bp左右，與目的產(chǎn)物1 161 bp相符合。結(jié)果酶切產(chǎn)物在1 200 bp處之下出現(xiàn)1條條帶，符合目的產(chǎn)物 1 161 bp 的預(yù)期結(jié)果，而空載體pET28a（+）則無此條帶，表明酶切結(jié)果正確（圖2）。

2.3 pET28a-BaoxdC重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α

pET28a-BaoxdC重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 37 ℃恒溫培養(yǎng)14 h后，得到的單克隆菌落如圖3所示。

2.4 轉(zhuǎn)化子菌液PCR鑒定

取轉(zhuǎn)化子單克隆菌落進行液體培養(yǎng)基試管振蕩培養(yǎng)，隨后取菌液作模板，以oxdC-F/oxdC-R為引物進行菌液PCR，結(jié)果如圖4所示，有1個陽性克隆。

2.5 pET28a-BaoxdC重組子測序結(jié)果

將陽性克隆子所對應(yīng)的菌液送北生物商貿(mào)有限公司進行測序，測序的結(jié)果與模板序列進行比對，結(jié)果顯示該基因所表達的重組蛋白具有草酸脫羧酶活性。

2.6 誘導(dǎo)條件對重組草酸脫羧酶表達的影響

根據(jù)甲酸濃度與HPLC 210 nm處吸收峰面積的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA的不同濃度梯度與575 nm處吸光度的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6）。酶的比活力即為單位質(zhì)量（mg）酶所具有的酶活力單位數(shù)，酶活力與酶濃度之比即為草酸脫羧酶比活力（表1）。

2.6.1 IPTG濃度對誘導(dǎo)表達的影響 由圖7可知，當(dāng)IPTG的誘導(dǎo)濃度為0.6 mmol/L時，酶活力和比活力最高，分別為3.793 2 U/mL、3.145 3 U/mg，說明此時的IPTG濃度為最適誘導(dǎo)濃度。當(dāng)IPTG誘導(dǎo)濃度達到1 mmol/L時，可能是因為IPTG對大腸桿菌產(chǎn)生了明顯的毒性，并且抑制了重組草酸脫羧酶的表達，因此酶活力及比活力大大降低。

2.6.2 誘導(dǎo)時間對誘導(dǎo)表達的影響 由圖8可知，當(dāng)IPTG誘導(dǎo)時間為4 h時，酶活力和比活力最高，分別為 3.793 2 U/mL、3.145 3 U/mg，說明4 h為最適誘導(dǎo)時間。

3 討論

本試驗通過對解淀粉芽孢桿菌草酸脫羧酶基因進行原核表達，并探究重組草酸脫羧酶的表達與IPTG誘導(dǎo)表達條件之間的關(guān)系。

來源于解淀粉芽孢桿菌C（10）的草酸脫羧酶基因oxdC經(jīng)過PCR擴增并與載體pET28a構(gòu)建了1個新的pET28a-BaoxdC重組子，并成功地轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌落PCR鑒定結(jié)果并測序檢驗后，證明該基因在原核表達系統(tǒng)得到穩(wěn)定遺傳。原核表達測序結(jié)果與解淀粉芽孢桿菌C（10）的草酸脫羧酶基因oxdC的序列進行比對之后發(fā)現(xiàn)，該基因所表達的重組蛋白仍具有草酸脫羧酶活力，因此可判斷表達成功。

利用高效液相色譜法對反應(yīng)生成的甲酸進行檢測，以此尋找重組草酸脫羧酶的表達與IPTG誘導(dǎo)表達條件之間的關(guān)系。添加誘導(dǎo)劑IPTG和MnCl2對目標(biāo)蛋白草酸脫羧酶的誘導(dǎo)合成顯著。根據(jù)單因素梯度試驗確定重組草酸脫羧酶最佳的誘導(dǎo)表達條件為：誘導(dǎo)時間4 h，添加IPTG至終濃度 0.6 mmol/L，MnCl2至終濃度6 mmol/L，此時酶活力和比活力最高，分別為3.793 2 U/mL、3.145 3 U/mg。試驗結(jié)果表明，誘導(dǎo)時間與IPTG濃度是影響草酸脫羧酶表達的重要因素。

標(biāo)準(zhǔn)菌株解淀粉芽孢桿菌DSM 7全基因組已被解析出來，根據(jù)生物信息學(xué)分析，推測其中oxdC序列為草酸脫羧酶基因，但并未進行試驗驗證，同時也沒有文獻報道研究過解淀粉芽孢桿菌的草酸脫羧酶基因，本試驗以NCBI上推測的解淀粉芽孢桿菌DSM 7草酸脫羧酶基因oxdC序列為目的基因，進行克隆表達、酶活測定，以鑒定其是否具有草酸脫羧酶活力，并測定粗酶活力，原核表達活力較高，可以進一步優(yōu)化表達，純化蛋白，并測量其酶學(xué)特性，挖掘其更多的應(yīng)用價值。

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