高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定白酒中6種甜味劑

梅　婕，司冠儒，張溫清，唐　瑩，周　萍(1.安徽宣酒集團股份有限公司科研中心，安徽宣城242000；2.江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城242000)

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定白酒中6種甜味劑

梅婕1，2，司冠儒1，2，張溫清1，2，唐瑩1，2，周萍1，2
(1.安徽宣酒集團股份有限公司科研中心，安徽宣城242000；2.江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城242000)

摘要：建立了白酒中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜6種甜味劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析方法。白酒樣品經(jīng)微孔濾膜過濾后，以乙腈和含0.1 %甲酸的水溶液為流動相，在ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱上進行分離，以電噴霧多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行質(zhì)譜分析。研究結(jié)果表明，6種甜味劑在檢測范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系(R2＞0.997)；方法的檢出限LOD (S/N=3)分別為0.36 μg/L、1.30 μg/L、0.54 μg/L、4.08 μg/L、0.15 μg/L和0.003 μg/L，定量限LOQ (S/N=10)分別為1.21 μg/L、4.34 μg/L、1.80 μg/L、13.61 μg/L、0.49 μg/L和0.01 μg/L；樣品的回收率分別為95.2 %～97.5 %、95.4 %～98.7 %、97.0 %～97.8 %、98.3 %～100.7 %、96.1 %～99.9 %和93.4 %～98.6 %；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.83～3.34、1.80～3.42、1.17～3.14、0.70～3.10、0.29～1.10 和0.25～3.30。該分析方法前處理簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好、分析速度快，可用于白酒中甜味劑的檢測。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；白酒；甜味劑

甜味劑是食品行業(yè)中常用的添加劑。近幾年來的相關(guān)研究表明，甜蜜素、糖精鈉等甜味劑具有損害肝臟及致癌等副作用。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10781.1—2006中明確規(guī)定，發(fā)酵型白酒中不得加入非自身發(fā)酵產(chǎn)生的呈香呈味物質(zhì)。然而，在釀酒行業(yè)中，為了掩蓋酒體苦澀，提高醇厚感和綿甜感，仍有一些不法企業(yè)在白酒的生產(chǎn)和勾調(diào)過程中違規(guī)添加甜味劑。因此，開發(fā)一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的甜味劑檢測方法對于規(guī)范白酒企業(yè)行為以及保障消費者的安全十分重要。

傳統(tǒng)的甜味劑的檢測方法，如液相色譜法[1-2]、氣相色譜法[3-4]、紫外分光光度法[5]等靈敏度較低，且容易出現(xiàn)假陽性[6]。隨著儀器及檢測分析手段的進步，液相色譜-質(zhì)譜法[7-9]已用于甜味劑的檢測。但針對白酒中甜味劑的檢測，仍然存在著檢測分析速度慢、檢測效率低等問題，特別是對于紐甜這種甜度為蔗糖的7000～13000倍的新型甜味劑的檢測，需要使用超高效液相-高分辨率質(zhì)譜[10-12]，檢測成本較高。本研究利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，建立了白酒中6種甜味劑的測定方法。該方法樣品預(yù)處理簡單、分析速度快、檢測成本低，適用于白酒中甜味劑的常規(guī)檢測。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

樣品：1#、2#和3#白酒樣品分別為三星宣酒(40 %vol)、宣酒(40 %vol)和中國宣酒(53 %vol)。

試劑：安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.2 %)、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0 %)、甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0 %)、三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0 %)、阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0 %)、紐甜標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0 %)皆購自Dr. Ehrenstorfer(德國)標(biāo)準(zhǔn)品公司；甲酸(色譜純)、乙腈(色譜純)購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；實驗用水由實驗室專用純水機制備；白酒樣品為本公司產(chǎn)品。

儀器設(shè)備：安捷倫高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(1260-G6460)，安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱；超純水儀A2S-10-CE；電子天平；超聲波清洗儀。

1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 g(精確到0.0001 g)，分別將其置于100 mL容量瓶中，加超純水定容，分別制成濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別移取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，制成濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成濃度為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L 和1.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在選定的色譜和質(zhì)譜條件下測定，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3色譜條件

甜味劑測定的色譜條件見表1。

表1　6種甜味劑測定的色譜條件

1.4質(zhì)譜條件

電噴霧ESI源，干燥氣溫度：350℃，干燥氣流速：11 L/min，毛細(xì)管電壓：4000 V(+)/3500 V(-)，霧化器壓力：50 psi。

1.5樣品處理

取酒樣直接用0.22 μm的有機濾膜過濾，進行質(zhì)譜分析。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜分離條件的優(yōu)化

相關(guān)研究表明[8-12]，甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜在以甲醇和水為流動相進行洗脫時分離效果較好。本實驗以甲醇和水為流動相時，糖精鈉和甜蜜素雖然可以分離，但峰型較差；提高甲醇濃度又會影響二者的分離，故選用極性稍弱的乙腈進行洗脫。綜合考慮靈敏度和分離度兩項指標(biāo)，最終確定甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜的流動相為乙腈∶水(含0.1 %甲酸)=18∶82；阿斯巴甜標(biāo)和紐甜的流動相為乙腈∶水(含0.1 %甲酸)=40∶60；流速均為0.4 mL/min。

2.2質(zhì)譜檢測條件的優(yōu)化

本實驗采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)測定白酒中的6種甜味劑。首先采用Scan模式，確認(rèn)化合物離子的質(zhì)量數(shù)；然后采用SIM模式，優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓，保證母離子的傳輸效率；接著在Product Ion(子離子)模式下掃描，選擇定量離子，優(yōu)化碰撞能，得到最佳的子離子用于定量；最后在MRM模式下，使用已經(jīng)優(yōu)化好的毛細(xì)管出口電壓和碰撞能進行甜味劑測定。優(yōu)化后的MRM條件見表2。

表2　MRM模式下6種甜味劑的檢測條件

2.3線性關(guān)系及標(biāo)準(zhǔn)曲線

在優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜條件下測定上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別以6種甜味劑定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)線性范圍見表3。以MRM色譜峰的信噪比S/N=3確定方法檢出限(LOD)，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜的檢出限分別為0.36 μg/L、1.30 μg/L、0.54 μg/L、4.08 μg/L、0.15 μg/L和0.003 μg/L；以色譜峰的信噪比S/N=10確定定量限(LOQ)，定量限分別為1.21 μg/L、4.34 μg/L、1.80 μg/L、13.61 μg/L、0.49 μg/L 和0.01 μg/L。

2.4精密度及回收率驗證

表3　6種甜味劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍及相關(guān)系數(shù)

準(zhǔn)確量取300 μL、500 μL和700 μL濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用酒樣定容至10 mL，配制成終濃度為0.3 mg/L、0.5 mg/L和0.7 mg/L的加標(biāo)溶液。按照1.5所述方法處理樣品，然后進行質(zhì)譜分析，結(jié)果見表4。加標(biāo)樣品中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜的回收率分別為95.2 %～97.5 %、95.4 %～98.7 %、97.0 %～97.8 %、98.3 %～100.7 %、96.1 %～99.9 %和93.4 %～98.6 %；RSD分別為0.83～3.34、1.80～3.42、1.17～3.14、0.70～3.10、0.29～1.10和0.25～3.30。由此表明，該方法具有較高的精密度和回收率，可用于常規(guī)檢測。

表4　6種甜味劑的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及回收率

2.5樣品測定

在建立的HPLC-MS/MS條件下，對本公司的1#、2# 和3#酒樣進行測定，結(jié)果見表5。酒樣中6種甜味劑均未檢出，所測結(jié)果符合國家標(biāo)準(zhǔn)對蒸餾酒中甜味劑含量的要求。

表5　酒樣中6種甜味劑的檢測結(jié)果

3　結(jié)論

本研究通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，建立了白酒中的安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜的分析方法。該方法簡單、快速，精密度和精確性良好，樣品前處理簡單，可用于白酒廠甜味劑的日常檢測。

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遵義市酒業(yè)協(xié)會正式成立

本刊訊：2015年12月5日，經(jīng)遵義市民政局批復(fù)，遵義市酒業(yè)協(xié)會正式成立。（小雨）

Determination of Six Kinds of Sweeteners in Liquor by HPLC-MS

MEI Jie1,2, SI Guanru1,2, ZHANG Wenqing1,2, TANG Ying1,2and ZHOU Ping1,2
(1. Xuanjiu Group Co.Ltd., Xuancheng,Anhui 242000; 2. Jiangnan Institute of Small Pit Brewing Technology, Xuancheng,Anhui 242000, China)

Abstract:A rapid and accurate analytic method based on HPLC-MS/MS had been developed for the determination of six kinds of sweeteners in liquor, including acesulfame potassium, saccharin sodium, sodium cyclamate, sucralose, aspartame and neotame. Liquor samples underwent microporous membrane filtration, then separated on a ZORBAX Eclipse Plus C18 column with acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution as the mobile phase, and then electrospray ionization was applied and operated in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The results showed that, the correlation curves of six sweeteners showed good linearity (R2＞0.997), the limits of detection (LOD, S/N=3) were 0.36 μg/L, 1.30 μg/L, 0.54 μg/L, 4.08 μg/L, 0.15 μg/L and 0.003 μg/L, respectively; the limits of quantitation (LOQ, S/N=10) were 1.21 μg/L, 4.34 μg/L, 1.80 μg/L, 13.61 μg/L, 0.49 μg/L and 0.01 μg/L, respectively; and the recoveries were 95.2 %～97.5 %, 95.4 %～98.7 %, 97.0 %～97.8 %, 98.3 %～100.7 %, 96.1 %～99.9 % and 93.4 %～98.6 %, respectively; the relative standard deviations (RSD) were 0.83～3.34, 1.80～3.42, 1.17～3.14, 0.70～3.10, 0.29～1.10 and 0.25～3.30, respectively. The method was sensitive and reproducible with a simple pretreatment and rapid analysis speed, which could be applied to detect sweeteners in liquor.

Key words:HPLC-MS/MS; Baijiu; sweetener

通訊作者：周萍，女，工程師，高級檢驗師，省白酒評委，安徽宣酒集團食品安全總監(jiān)。

作者簡介：梅婕，女，碩士研究生，主要從事釀酒微生物和白酒風(fēng)味物質(zhì)研究，發(fā)表論文多篇；司冠儒，男，碩士研究生，主要從事釀酒微生物和白酒風(fēng)味物質(zhì)研究，發(fā)表論文多篇，申請專利多項。

收稿日期：2015-12-09

DOI：10.13746/j.njkj.2015460

中圖分類號：TS262.3；TS261.7

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）03-0122-03

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-01-28；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160128.1454.005.html。