納米硅藻頁巖對水稻土壤微生物功能多樣性的影響

于涵 王曉萍 吳姝菊

摘要：擬研究常規(guī)施肥下納米硅藻頁巖的施用對水稻土壤中微生物群落功能多樣性的影響，為合理施用納米硅藻頁巖改良農(nóng)田土壤微生態(tài)環(huán)境提供理論參考。以常規(guī)水田土壤為研究對象，分別施用0、150、300、600 kg/hm2等4種不同劑量的納米硅藻頁巖（分別記作CK、DS150、DS300、DS600），采用Biolog技術(shù)進行研究。結(jié)果表明，與對照處理相比，DS300處理可以提高土壤微生物活性、微生物群落物種多樣性、微生物對碳水化合物類碳源的利用率。對31種碳源作主成分降維分析表明，DS300處理的土壤微生物能夠提高對D-半乳糖醛酸、D-甘露醇、N-乙酰-D-葡萄糖胺等共13種碳源的利用率。此外研究表明，施用300 kg/hm2納米硅藻頁巖可以提高土壤微生物的代謝活性和微生物對碳源的利用能力，從而增強水稻土壤微生物的功能多樣性，促進微生物類群向更好的趨勢發(fā)展，對于維持農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康有重要意義。

關(guān)鍵詞：納米硅藻頁巖;微生物群落;功能多樣性;Biolog法;主成分分析;碳源利用

中圖分類號： S154.3? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0217-05

收稿日期：2018-09-21

基金項目：黑龍江省高教強省專項“互聯(lián)網(wǎng)+農(nóng)業(yè)”（編號：黑農(nóng)委聯(lián)發(fā)2016-64）。

作者簡介：于 涵（1994—），女，山東日照人，碩士研究生，主要從事分子遺傳學(xué)研究。E-mail：yuhan18045884692@126.com。

通信作者：吳姝菊，碩士，教授，主要從事植物栽培養(yǎng)護與植物生態(tài)修復(fù)方向的研究。E-mail：shuju1965@163.com。

納米硅藻頁巖是一種具有巨大表面積和豐富毛孔狀微孔隙且富含二氧化硅的天然納米礦物[1]，具有很強的吸附能力，起源于黑龍江省嫩江流域，其儲量豐富，開采方便，對于保持和提高土壤肥力及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展均有重要作用[2]。過去對納米硅藻頁巖的研究主要集中在工業(yè)領(lǐng)域，忽視了納米硅藻頁巖在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的開發(fā)和利用。近年來，有許多學(xué)者研究認為，納米硅藻頁巖在土壤改良和修復(fù)方面有許多優(yōu)良特性[3]，對微生物的吸附能力較強，可以改變微生物的活性和數(shù)量[4]。有研究表明，施用納米硅藻頁巖可以調(diào)節(jié)土壤的理化性質(zhì)，并降低有毒有害元素對植物的毒性[1，5]。還有研究表明，納米硅藻頁巖對土壤養(yǎng)分元素的緩釋和利用[6]、對土壤酸堿度的調(diào)節(jié)[7]、對微生物的物理保護作用以及對有毒有害物質(zhì)的吸附等都有利于提高土壤微生物的活性及數(shù)量[4]。此外，有研究表明，納米硅藻頁巖同類物質(zhì)的施用能夠提高土壤微生物群落的功能多樣性[8]，施用納米硅藻頁巖能夠促進細菌的生長，增加細菌數(shù)量[4]，提高酶活性[7]。近年來，隨著可再生能源的逐漸減少，納米硅藻頁巖在農(nóng)田土壤上的應(yīng)用正逐漸受到研究者們的關(guān)注。

土壤中微生物的數(shù)量龐大，代謝能力較強，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，微生物的功能多樣性對土壤變化非常敏感，不僅是衡量土壤質(zhì)量變化的靈敏指標(biāo)，同時也是評價生態(tài)系統(tǒng)是否可持續(xù)的重要生物學(xué)指標(biāo)[9]。因此，研究土壤微生物的功能多樣性具有重要意義。

研究土壤微生物群落多樣性的方法很多，Biolog微孔平板法能夠簡單、快速地定量分析微生物群落對碳源利用的動力學(xué)特征[10-11]，因此倍受研究者們喜愛。目前，已有研究表明，納米硅藻頁巖對水稻土壤有顯著的改良效果[5]，目前施用納米硅藻頁巖對農(nóng)田土壤微生物影響的研究尚未見相關(guān)報道，缺乏納米硅藻頁巖直接施用后對土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物代謝情況的系統(tǒng)研究。因此，本研究采用Biolog微孔板技術(shù)，以常規(guī)水稻生產(chǎn)田為研究對象，研究不同施用量的納米硅藻頁巖處理對土壤微生物群落碳源利用及代謝能力的影響，以期闡明施用納米硅藻頁巖后水稻土壤微生物多樣性的變化規(guī)律，為納米硅藻頁巖在改良農(nóng)田土壤微生態(tài)環(huán)境方面的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

研究地區(qū)位于黑龍江省哈爾濱市道外區(qū)農(nóng)技示范中心（地理位置為126°56′E，45°56′N），海拔119 m，屬于中溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，年均氣溫為3.50～4.50 ℃，全年無霜期為135～145 d，年均降水量為400～600 mm，降水多集中于6—9月[12]。

1.1 試驗材料

納米硅藻頁巖粉比表面積為277.30 cm2/g，孔徑為5～20 nm，吸水率為74.40%，pH值為7.50，化學(xué)成分：81.01% SiO2，7.84% Al2O3，1.68% Fe2O3，0.60% CaO，0.59% MgO，8.28%其他成分[1]。試驗所用納米硅藻頁巖粉由黑龍江廣拓農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用的方法是大區(qū)對比法，不設(shè)重復(fù)，共設(shè)置4個處理：常規(guī)施肥（CK），常規(guī)施肥+150 kg/hm2納米硅藻頁巖粉（DS150），常規(guī)施肥+300 kg/hm2納米硅藻頁巖粉（DS300），常規(guī)施肥+600 kg/hm2納米硅藻頁巖粉（DS600）。每個處理區(qū)面積約為420 m2，各區(qū)間隔1.5 m。常規(guī)施肥采用水稻專用復(fù)合肥（N、P2O5、K2O比例為12 ∶ 18 ∶ 15），施基肥、追肥時使用。納米硅藻頁巖粉的施用方法是在施基肥時與復(fù)合肥混合后施入土壤，追肥時不施加納米硅藻頁巖粉。2017年5月初進行農(nóng)田土壤翻耕，5月10日于田間土壤中施用基肥，基肥用量為938 kg/hm2，5月13日插水稻秧苗，每穴插入2～3株，株距為13 cm，行距為30 cm，分蘗期追施1次復(fù)合肥，其施用量為562 kg/hm2。各處理區(qū)均采用傳統(tǒng)水分管理模式（前期淹水、中期烤田、后期干濕交替）。其他田間管理同當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)栽培規(guī)范，試驗期間嚴格控制田間草、蟲、病害。

1.3 樣品的采集與測定方法

2017年9月5日采集各處理區(qū)耕作層0～20 cm的土壤，采集前先去除附著在水稻土壤表面的凋落物及雜石等，將采集到的土樣裝入自封袋中密封，并置于帶冰的保溫箱中帶回實驗室，放入4 ℃冰箱并取出一部分新鮮土壤，立即用于Biolog試驗。

用Biolog-Eco微孔板（Biolog Eco PlateTM）進行測定。Biolog板內(nèi)有31種碳源孔，分別是β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、D-木糖、D-半乳糖醛酸、i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-葡糖胺酸、D-纖維二糖、1-磷酸葡萄糖、D，L-α-磷酸甘油、α-D-乳糖、L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、丙酮酸甲酯、γ-羥丁酸、衣康酸、α-丁酮酸、D-蘋果酸、吐溫40、吐溫80、肝糖、α-環(huán)式糊精、2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、苯乙基胺、腐胺。稱取5 g鮮土于45 mL 0.85% NaCl溶液中，于200 r/min搖床中振蕩40 min，靜置20 min后取上清液，之后再加入NaCl溶液，反復(fù)振蕩、靜置、取上清液至土壤樣品被稀釋為10-3。吸取150 μL稀釋液于Biolog-Eco微孔板中，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10 d，每隔24 h用Elx800TM酶標(biāo)儀分別測定590、750 nm波長處的吸光度[13-14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

土壤微生物群落代謝活性用單孔的平均顏色變化率（average well color development，簡稱AWCD）來表示，需要用培養(yǎng)10 d的全部數(shù)據(jù)，單孔吸光度為波長為590 nm的吸光度減去波長為750 nm的吸光度（590 nm代表顏色+濁度的波長，750 nm 代表濁度的波長），若所得數(shù)值小于0.06，則不作統(tǒng)計計算[15]。選擇培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)[16]進行單因素方差分析（ANOVA）、多重比較[最小顯著性差異法（LSD），α=005]、主成分分析、功能多樣性指數(shù)的計算[17]、6類碳源底物吸光度的計算[17]。使用Excel 2010、SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米硅藻頁巖對水稻土壤微生物活性的影響

Biolog-Eco微孔板內(nèi)31孔碳源的AWCD值是衡量土壤微生物群落利用單一碳源能力的重要指標(biāo)，能夠反映土壤微生物的代謝活性，AWCD值越高，表明土壤微生物對碳源的利用程度越高，微生物的代謝活性越強[18]。由圖1可看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，土壤微生物對碳源的利用程度越高，吸光度在培養(yǎng)至48 h時的變化速率最大，隨后吸光度逐漸增加，到培養(yǎng) 240 h 時基本穩(wěn)定。從培養(yǎng)48 h開始，DS300處理的土壤AWCD值均高于其他3個處理，DS600處理均明顯低于其他3個處理，表明施用納米硅藻頁巖能夠影響土壤微生物對碳源的利用。在培養(yǎng)240 h時，4個處理的AWCD值排序為DS300>CK>DS150>DS600，經(jīng)方差檢驗，DS300處理的AWCD值為1.035，顯著高于CK處理的AWCD值（0.977，P<005），DS600處理的AWCD值為0.771，顯著低于CK處理（P<005），而DS150處理與CK相比差異不顯著。以上試驗結(jié)果表明，施用劑量為300 kg/hm2的納米硅藻頁巖能夠提高土壤微生物的代謝活性。

2.2 納米硅藻頁巖對水稻土壤微生物群落多樣性指數(shù)的影響

對Biolog-Eco板培養(yǎng)至96 h的吸光度進行4種多樣性指數(shù)分析，可以反映土壤微生物群落在不同納米硅藻頁巖施用量處理下的微生物群落代謝的差異[16]。Shannon指數(shù)常用于表征土壤微生物群落的多樣性，Simpson指數(shù)常用于表征微生物群落的優(yōu)勢度，McIntosh指數(shù)可以反映微生物群落的均勻度，Richness指數(shù)則可用于反映微生物群落的豐富度情況[19-20]。由表1可以看出，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Richness指數(shù)在各處理間的排序均為DS300>CK>DS150>DS600，表明DS300處理可以提高土壤微生物群落的多樣性。方差檢驗結(jié)果表明，施用高劑量的納米硅藻頁巖處理的McIntosh指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著低于其他處理（P<0.05），在其他指數(shù)上差異均不顯著，表明高施用量的納米硅藻頁巖會顯著降低土壤微生物群落的均勻度和多樣性。

2.3 納米硅藻頁巖對水稻土壤微生物利用6類碳源的影響

對Biolog-Eco微孔板內(nèi)的31種碳源進行分類， 可分成6類，分別計算4種處理下這6類碳源的平均吸光度（6類碳源的吸光度測定波長均為590、750 nm），可以反映土壤微生物對不同碳源利用效率的差異[21]。如表2所示，DS300處理對碳水化合物、氨基酸、羧酸和多聚物的利用程度最高，經(jīng)方差檢驗，DS300、DS150處理對碳水化合物類碳源的利用效果顯著高于對照處理，表明施用合適劑量的納米硅藻頁巖能夠提高土壤微生物對碳水化合物類碳源的利用能力，可以促進喜食碳水化合物類碳源微生物的生長。

2.4 納米硅藻頁巖各處理土壤微生物在31孔碳源上的主成分分析

Biolog-Eco微孔板能夠提供土壤微生物對板內(nèi)31種碳源的利用信息，每種碳源相當(dāng)于1個變量，由于微生物對有些碳源的利用方式是相似的，所以這些數(shù)據(jù)會存在大量重復(fù)信息。為了有效利用數(shù)據(jù)，對31種碳源采用降維的方式，可以找到代替較多原有變量的較少新變量[22]，從而明確不同納米硅藻頁巖施用量處理下土壤微生物類群的差異。主成分分析方法要求各主成分的累積方差貢獻率大于85%才能夠有效地反映真實情況。因此，為了能使主成分累積貢獻率達到85%以上，本研究采用4個主成分進行分析。

由表3可知，PC1～PC4累積方差貢獻率達99.00%，方差貢獻率大于85%，因此這4個主成分能夠反映31種碳源的全部信息。將與PC1～PC4上相關(guān)性較大的碳源，即相關(guān)性的絕對值大于0.50的碳源列在表4中。可以看出，PC1主要代表13種碳源，PC2主要代表11種碳源，PC3主要代表6種碳源，PC4主要代表5種碳源，說明這4個主成分能夠包含31種碳源的全部信息。

由表5可知，各處理在PC1、PC2上的得分均較高，DS150、DS300和CK處理均在PC1的正方向，而DS600處理在PC1的負方向，說明PC1所代表的碳源能夠很好地將DS150、DS300、CK處理與DS600處理分辨開，DS150、DS300、CK處理與DS600處理的微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

主成分分析結(jié)果表明，施用高劑量的納米硅藻頁巖后，微生物對碳源的利用有了很大改變。DS150、CK處理均在PC1的正方向和PC2、PC3、PC4的負方向上，說明DS150處理與CK處理的微生物群落結(jié)構(gòu)最相似，表明施用低量的納米硅藻頁巖后，微生物對碳源的利用沒有發(fā)生明顯改變。DS300處理在PC1的正方向上得分最高，說明DS300處理對PC1所代表的碳源利用程度最高，表明施用適量的納米硅藻頁巖可以提高微生物對PC1代表的碳源的利用率。

3 結(jié)論與討論

Biolog-Eco微孔板能夠快捷、敏感地反映土壤微生物的變化特征，對其進行數(shù)據(jù)分析時，選擇AWCD值、多樣性指數(shù)、6類碳源的利用率及主成分分析方法能夠有效提取信息[17]。對AWCD值的分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)至24 h時，各處理

的AWCD值均幾乎為0，且差異不顯著，這是由于土壤中存在一些如自生固氮菌、硝化和亞硝化等生長較慢或完全沒有增殖的微生物[9]。從培養(yǎng)48 h開始，AWCD值快速增長，DS300處理明顯高于其他處理，到培養(yǎng)240 h時AWCD值穩(wěn)定。分析表明，施用不同量納米硅藻頁巖的土壤微生物活性排序表現(xiàn)為DS300>CK>DS150>DS600，其中DS300、DS600處理與對照處理相比差異顯著，表明施用中劑量的納米硅藻頁巖會提高土壤微生物的活性，施用高劑量的納米硅藻頁巖會對土壤微生物代謝活性有明顯的抑制作用。這與蔡燕飛等施用同類物質(zhì)的研究結(jié)果[23]相似。產(chǎn)生這樣的結(jié)果可能的原因是施用中量納米硅藻頁巖時，因納米硅藻頁巖表面有豐富的毛孔狀結(jié)構(gòu)，可以增加土壤的保肥能力和土壤含氧量[4]，從而促進微生物的生長，進而提高土壤微生物的代謝活性。

土壤微生物是土壤中最為活躍的組成部分，微生物代謝活性增強，表明施用中量納米硅藻頁巖對土壤改良有一定的作用。而施用高劑量的納米硅藻頁巖，會造成土壤中重金屬含量的積累（納米硅藻頁巖中含有少量的鐵、錳等重金屬元素[1]），由于重金屬對土壤微生物具有一定的毒害作用[24]，因而造成土壤微生物代謝活性的顯著降低。因此可見，納米硅藻頁巖的合理施用才可以促進土壤微生物的生長，提高水稻土壤微生物的活性，從而提升土壤的肥力水平。

對土壤微生物碳源利用多樣性的指數(shù)分析結(jié)果顯示，微生物碳源利用的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Richness指數(shù)在各處理中均表現(xiàn)為DS300處理最高，說明施用中量的納米硅藻頁巖有提高土壤微生物多樣性的潛力。DS300處理的多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)和豐富度指數(shù)最高，DS300處理能夠顯著促進喜食碳水化合物類碳源的微生物群落生長。主成分分析結(jié)果顯示，CK、DS150、DS300處理土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)相近，而DS600處理與其他處理土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)明顯不同，說明DS600處理顯著改變了土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，可能是導(dǎo)致土壤微生物群落活性的顯著降低及碳源代謝能力減弱的原因。因此可見，合理確定納米硅藻頁巖的施用劑量，建立標(biāo)準的使用方法，有利于納米硅藻頁巖農(nóng)業(yè)規(guī)?；膽?yīng)用，充分發(fā)揮納米硅藻頁巖自身的優(yōu)勢，合理利用該項資源及有效規(guī)避使用風(fēng)險。

Biolog技術(shù)雖然簡便、省時、高效，但僅從土壤微生物的代謝信息獲得微生物群落結(jié)構(gòu)的信息，因此還存在一定的局限性，且使用該技術(shù)培養(yǎng)的微生物總數(shù)有限，土壤中那些難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物群落代謝活性和土壤微生物對碳源的利用在該技術(shù)中響應(yīng)程度不高[25]。因此在后續(xù)研究中，在研究微生物群落多樣性時使用Biolog技術(shù)，也應(yīng)該配合其他技術(shù)作輔助分析，如變性梯度凝膠電泳技術(shù)[26]、宏基因組技術(shù)[27]、Illumina高通量測序技術(shù)[28]等，從分子水平上研究納米硅藻頁巖對農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響，為提高土壤質(zhì)量和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性提供科學(xué)依據(jù)。

本研究應(yīng)用Biolog-Eco技術(shù)，研究不同施用量的納米硅藻頁巖對土壤微生物的代謝活性、碳源代謝多樣性的影響。結(jié)果表明，合理施用納米硅藻頁巖對維持水稻土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有積極影響。不同施用量納米硅藻頁巖處理的AWCD值、多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)和豐富度指數(shù)均表現(xiàn)為中施用量提高，低施用量無影響，高施用量顯著降低。在對6類碳源的利用中，DS300、DS150處理土壤微生物對碳水化合物類碳源的利用顯著高于對照、DS600處理。主成分分析結(jié)果表明，DS300處理對PC1代表的碳源的利用程度最高。當(dāng)納米硅藻頁巖的施用量為300 kg/hm2時，能夠提高水稻土壤微生物的代謝活性和碳源代謝多樣性，對于改善農(nóng)田土壤肥力有重要意義，納米硅藻頁巖礦物資源在農(nóng)業(yè)上具有十分廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用潛力。關(guān)于納米硅藻頁巖的直接施用是否能提高水稻產(chǎn)量和水稻品質(zhì)，有待于進一步試驗研究。

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