M3受體在低氧引起H9c2細胞損傷中的作用及其機制※

司立寧，甘桂芬，趙延禮，嚴海萍，黨國全，于冬悅，王 嶸*

(1.青海大學附屬醫(yī)院，西寧 810001；2.青海大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究中心，西寧 810001；3.中國藥科大學，南京 211198)

M3受體在低氧引起H9c2細胞損傷中的作用及其機制※

司立寧1，甘桂芬1，趙延禮2，嚴海萍1，黨國全2，于冬悅3，王 嶸2*

(1.青海大學附屬醫(yī)院，西寧 810001；2.青海大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究中心，西寧 810001；3.中國藥科大學，南京 211198)

目的 探討M3受體激動對低氧誘導H9c2細胞損傷的作用及機制。方法 采用三氣培養(yǎng)建立H9c2細胞低氧損傷模型。實驗組分為對照組(A)、低氧組(B)、CCh+低氧組(C)、4DAMP+CCh+低氧組(D)。采用CCK-8法測定細胞存活率，通過流式細胞術檢測H9c2細胞凋亡情況；Western blot法檢測凋亡蛋白Caspase-3、抗凋亡蛋白Bcl-2及HIF-1α和HO-1的表達。結果 M3受體激動劑CCh(10mmol/L)可減少低氧誘導的心肌細胞損傷，并可增加心肌Bcl-2、HIF-1α、HO-1的表達，減少Caspase-3表達。但預先應用4DAMP(10nmol/L)阻斷M3受體可逆轉膽堿作用。結論 激動M3受體對低氧誘導H9c2細胞的損傷有保護作用，其機制可能與HIF-1α、HO-1的表達增加有關。

M3受體 細胞損傷 低氧 低氧誘導因子-1 血紅素加氧酶-1

研究表明，M3受體激動劑膽堿通過激動心肌細胞M3受體產生負性肌力和負性頻率的作用[1]。然而，激動M3受體對低氧誘導心肌細胞損傷的影響尚不清楚。本實驗通過低氧誘導H9c2細胞損傷，研究激動M3受體對低氧引起心肌細胞損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器選擇

H9c2細胞株(中國科學院上海細胞庫)；卡巴膽堿、4DAMP(Sigma公司)，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；CCK-8(cellcounting kit-8)、AnnexinV-PI染色試劑盒(南京建成生物工程公司)；HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3、HO-1、GAPDH抗體(Santa Cruz公司) ；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Electron公司)；YCP-50S三氣培養(yǎng)箱(長沙華曦電子科技有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與實驗分組

細胞培養(yǎng)：將H9c2細胞按(1～3)×105個/mL等量接種于35 mm培養(yǎng)皿中，于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中置于細胞培養(yǎng)箱(5%CO2、飽和濕度、37℃)無菌培養(yǎng)，待細胞密度達70%～80%之間時進行實驗。實驗前采用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)12 h。

實驗分組：正常對照組(A，常氧正常培養(yǎng))；低氧組(B，細胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中，通入純度為99.9%的N2平衡培養(yǎng)箱中的O2，排氣口檢測O2濃度≤1%，培養(yǎng)24h)；CCh+低氧組[C，培養(yǎng)條件同B組，培養(yǎng)時加入CCh(10mmol/L)]；4DAMP+CCh+低氧組[D，該組細胞在按照C組培養(yǎng)前2 h加入4DAMP(10nmol/L)]。

1.3 細胞損傷的測定

按照CCK-8法細胞活性檢測試劑盒的操作步驟，對各組細胞活性進行測定，每組實驗重復6次。

1.4 細胞凋亡檢測

將各組細胞用PBS液洗滌2次，用適量1×Binding緩沖液重懸，使細胞濃度達到1×106個/mL。然后取100 μL重懸液，加入5 μL FITC Annexin V和5 μL碘化丙啶(PI)，室溫避光15 min。最后加入400 μL Binding緩沖液，利用流式細胞儀進行檢測。

1.5 蛋白表達檢測

收集細胞并用PBS液洗滌3次，加入適量裂解液在冰浴中裂解細胞，收集蛋白做考馬斯亮藍法蛋白定量，行十二烷基磺酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉后加入第1抗體孵育(4℃)過夜，用PBST緩沖液洗滌3次，10 min/次，加入第2抗體于室溫孵育2 h，再用PBST緩沖液洗滌3次，10 min/次，加入發(fā)光試劑ECL顯色曝光，采用Image-Pro圖像分析軟件進行灰度分析，GAPDH作為內參。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 M3受體對低氧H9c2細胞活力的影響(表1)

Table 1 Survival of mediated myocyte in each group

*：與A組比較，P<0.01；#：與B組比較，P<0.01；▲：與C組比較，P<0.01.

表1顯示，與A組相比，B組細胞進行24 h低氧培養(yǎng)后細胞活力明顯降低(P<0.01)；C組細胞低氧處理時給予M3受體激動劑CCh后，細胞活力較B組顯著升高(P<0.01)。但是，D組細胞在給予低氧和M3受體激動劑處理前2 h先給予4DAMP，明顯逆轉了CCh保護低氧導致細胞活力下降的現象。

2.2 M3受體對低氧H9c2細胞凋亡的影響(圖1，表2)

圖1 各組細胞流式細胞術結果圖

Figure 1 Flow cytometry in each group

圖2 Westernblot法檢測各組細胞Caspase-3和Bcl-2蛋白結果圖

Table 2 2Apoptosis of Mediated myocyte in each group

*：與A組比較，P<0.01；#：與B組比較，P<0.01；▲：與C 組比較，P<0.05.

圖1、表2顯示，與A組相比，B組細胞低氧培養(yǎng)24 h后細胞凋亡數明顯增加(P<0.01)；與B組相比，給予M3受體激動劑CCh后明顯減少了低氧導致的細胞凋亡數(P<0.01)；利用4DAMP預先阻斷M3受體后可逆轉CCh的抗凋亡作用。

2.3 M3受體對低氧H9c2細胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響(圖2，表3)

Table 3 The expression of Caspase-3 and Bcl-2 in each group

*：與A組比較，P<0.01；#：與B組比較，P<0.01；▲：與C組比較，P<0.01.

圖2、表3顯示，與A組相比，B組低氧培養(yǎng)的細胞內Bcl-2蛋白的表達降低(P<0.01)、Caspase-3蛋白的表達升高(P<0.01)；與B組相比，C組結果顯示CCh可增加Bcl-2蛋白的表達(P<0.01)、降低Caspase-3蛋白的表達(P<0.01)；給予M3受體阻斷劑4DAMP后明顯逆轉C組現象。

2.4 M3受體對低氧H9c2細胞HIF-1α和HO-1蛋白表達的影響(圖3，表4)

圖3 Westernblot法檢測各組細胞HIF-1α和HO-1蛋白結果圖

Figure 3 The expression of HIF-1αand HO-1 byWesternblot in each group

Table 4 The expression of HIF-1αand HO-1 in each group

*：與A組比較，P<0.01；#：與B組比較，P<0.01；▲：與C組比較，P<0.01.

圖3、表4顯示，與A組相比，B組細胞低氧培養(yǎng)24 h后細胞內HIF-1α、HO-1蛋白的含量明顯增加(P<0.01)；與B組相比，激活M3受體可顯著增加低氧條件下心肌細胞內HIF-1α、HO-1蛋白的表達(P<0.01)；而預先阻斷M3受體可明顯降低由CCh引起的HIF-1α、HO-1蛋白表達的增加(P<0.01)。

3 討論

本研究結果表明，給予膽堿可保護低氧引起的心肌細胞損傷，并誘導HIF-1α、HO-1表達增加，預先給予4DAMP可逆轉膽堿的保護作用，提示膽堿是通過激動心肌M3受體發(fā)揮心肌保護作用，其機制可能與誘導HIF-1α、HO-1表達增加有關。

以往研究認為，心肌細胞中只有M2受體。但近年研究發(fā)現，心肌細胞中也存在M3受體等其他類型，并且M3受體在很多心臟疾病中發(fā)揮重要的作用[2]。Liu課題組研究發(fā)現，心肌過表達M3受體可通過抑制MAPK通路明顯減弱血管緊張素II誘導的心肌肥厚[3]。另有研究發(fā)現，激動心肌M3受體可抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡[4]。張偉志課題組研究發(fā)現，在H9c2細胞中，氨甲酰膽堿通過M3受體調控MEK1/2-ERK1/2信號通路促進細胞的生存[5]。本研究利用M3受體激動劑CCh和抑制劑4DAMP發(fā)現，心肌M3受體在低氧引起的心肌細胞損傷中發(fā)揮保護作用。

慢性低氧會引起心肌組織結構的異常，如心肌細胞肥大、凋亡和間質纖維化等[6，7]。研究認為，低氧能夠通過調節(jié)生長因子、應激蛋白和酶等基因的表達調控心肌細胞的生長和分化[8，9]。本研究發(fā)現，給予低氧處理H9c2細胞24 h后，心肌細胞增殖能力明顯降低，心肌細胞凋亡明顯增加，促凋亡蛋白Caspase-3表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達減少。但是，低氧時給予CCh處理可明顯增加心肌細胞的增殖和減少心肌細胞的凋亡，并且促凋亡蛋白Caspase-3表達減少，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達增加。進一步發(fā)現，該現象可在預先給予4DAMP后明顯逆轉。該結果提示低氧對心肌細胞的生長有抑制作用，激動心肌M3受體可抑制低氧誘導的心肌細胞活力降低和凋亡增加。

研究證實，低氧可誘導心肌、肝臟、腎臟、骨骼肌等組織中HIF-1α和HO-1表達增加，并發(fā)揮重要的保護作用[10，11]。Hui課題組研究發(fā)現，激動心肌M3受體可通過HIF-1α/HO-1/VEGF通路抑制依托泊苷誘導的心肌細胞凋亡[12]。本研究同樣發(fā)現，低氧培養(yǎng)H9c2細胞24 h可明顯誘導HIF-1α、HO-1表達增加；低氧條件下激動心肌M3受體可明顯誘導HIF-1α、HO-1表達增加，預先給予4DAMP后可阻斷膽堿的作用，提示激動心肌M3受體可保護低氧誘導的心肌細胞損傷的作用可能是通過誘導HIF-1α、HO-1表達增加實現的。

激動心肌M3受體可能是通過誘導HIF-1α、HO-1的表達增加抑制低氧引起的心肌細胞損傷。本研究為低氧條件下心肌M3受體與HIF-1α/HO-1之間的關系提供了新的證據。

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Protective effect of M3receptor on hypoxia damage of H9c2 cell※

Si lining1，Gan Guifen1，Zhao Yanli2，Yan Haiping1，Dang Guoquan2，Yu Dongyue3，Wang Rong2

(1.Qinghai University Affiliated Hospital，Xining 810000；2.Basic Science Research Center of Qinghai University Medical College，Xining810000；3.China Pharmaceutical University，Nanjing 211198)

Objective To observe the effect of activation of M3receptor on hypoxia damage in cultured H9c2 cell and to investigate its possible mechanisms.Methods A model of Hypoxia damage was performed as cells cultured in a tri-gas incubator.Cells were divided into four groups，including control(A)，hypoxia(B)，CCh+hypoxia(C)and 4DAMP+ CCh+hypoxia(D).The viability of cells was determined by CCK-8 assay.Western blot was used to determine Caspase-3，Bcl-2，HIF-1α and HO-1 levels.Results Hypoxia mediated myocyte damage was attenuated by M3receptor agonist choline(10mmol/L).Pretreatment of cardiac myocytes with choline also increased Bcl-2，HIF-1α and HO-1，decreased Caspase-3 expression in hypoxia stimulated H9c2 cell.However，blockade of M3receptor by 4DAMP(10nmol/L)completely inhibited the effects of choline on hypoxia stimulated H9c2 cell.Conclusions Activation of M3receptor showed protective effect on hypoxia induced damage in cultured H9c2 cell and this effect might be related tomodulating the expression of some genes including HIF-1α and HO-1.

M3receptor Cell damage Hypoxia HIF-1α HO-1

※：國家自然科學基金項目(81060162)；國家自然科學基金項目(81460284)；青海省自然科學基金青年項目(2014-ZJ-944Q)；青海省自然科學基金項目(2015-ZJ-744) 司立寧(1980～)，女，漢族，主治醫(yī)師.* ：通訊作者，qhwr2007@163.com

R331.3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.004

2015-11-09