膠體金在不同培養(yǎng)溫度鼠疫FI抗原檢測中遇到的問題※

謝 輝，于曉濤，李 君，張愛萍，魏柏青

(青海省地方病預防控制所鼠疫預防控制科，811602 西寧)

膠體金在不同培養(yǎng)溫度鼠疫FI抗原檢測中遇到的問題※

謝 輝，于曉濤，李 君，張愛萍，魏柏青※※

(青海省地方病預防控制所鼠疫預防控制科，811602 西寧)

目的 對比膠體金紙上色譜試驗(RGICA)、反向血凝試驗(RIHA)及細菌檢驗對于28 ℃與37 ℃鼠疫菌的敏感性及特異性。方法 28 ℃、37 ℃鼠疫菌培養(yǎng)24 h制備菌液與28 ℃、37 ℃的鼠疫菌感染臟器取材制成的菌懸液分別行反向血凝試驗，細菌檢驗及膠體金紙上色譜試驗。結果 37 ℃鼠疫菌懸液及37 ℃鼠疫菌感染動物制備菌懸液，膠體金、反向血凝試驗及細菌檢驗均敏感，28 ℃及28 ℃鼠疫菌感染動物取材制備的菌懸液反向血凝試驗、細菌檢驗敏感，膠體金不敏感。結論 在現場應用與鼠疫監(jiān)測中反向血凝試驗因其具有簡便、快速、敏感已被列入標準，28 ℃鼠疫菌膠體金檢測敏感性差，檢測FI抗原缺乏的鼠疫菌株易漏診，只能作為輔助診斷。

膠體金 溫度 鼠疫 抗原 檢測 問題

鼠疫檢測通常是細菌學方法與血清學方法聯合使用，鼠疫的診斷主要依據細菌培養(yǎng)試驗和反向血凝試驗。隨著免疫膠體金技術日益成熟，免疫膠體金出現取代ELISA等傳統(tǒng)檢測方法的趨勢。但在具體工作中我們發(fā)現，膠體金技術在檢測野外自斃動物材料時存在不足，例如在2012年玉樹地震災區(qū)開展鼠疫防控監(jiān)測中發(fā)現鼠疫菌培養(yǎng)試驗及反向血凝試驗陽性，而鼠疫膠體金檢測FI抗原呈陰性。對此我們開展了相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料

EV76標準株由青海省地方病預防控制所菌種專業(yè)實驗室提供；實驗動物由青海省地方病預防控制所動物中心提供；鼠疫FI抗原致敏血球(2012-1)、赫氏培養(yǎng)基(2012-1)由青海省地方病預防控制所自行生產；鼠疫抗原膠體金試劑盒(2012120509)由北京莊迪浩禾生物醫(yī)學科技有限公司生產；細菌標準比濁管由北京生物藥品檢定所提供。

1.2 方法

用28 ℃和37 ℃的細菌菌液分別行反向血凝試驗、分離細菌檢驗實驗及膠體金紙上色譜試驗，用28 ℃和37 ℃的細菌攻毒，攻毒后動物取材分別行反向血凝試驗、分離細菌檢驗實驗及膠體金紙上色譜試驗。

1.2.1 取EV76標準株接種于0.1%溶血赫氏瓊脂培養(yǎng)基，分別置于28 ℃、37 ℃溫箱，培養(yǎng)24～48 h，用滅菌鹽水沖洗培養(yǎng)物制成菌懸液，用標準比濁管稀釋菌懸液(10億/mL)，分別行細菌培養(yǎng)實驗和鼠疫反向血凝試驗(RIHA)、鼠疫膠體金紙上色譜試驗(RGICA)平行檢測。

1.2.2 將上述兩種培養(yǎng)物制成菌懸液(10億/mL)，菌懸液接種小白鼠腹股溝皮下(5只，每只0.5mL)行感染，觀察3～5 d，處死動物，取肝脾壓印0.1%溶血赫氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時各取肝脾1 g研磨加鹽水制成1：10臟器懸液行鼠疫反向血凝試驗(RIHA)、鼠疫膠體金抗原實驗(RGICA)平行檢測，以生理鹽水與未感染細菌動物臟器作為空白對照。

1.2.3 將制備菌懸液和臟器懸液用生理鹽水按1：10稀釋后，吸取150 μL滴入F1抗原膠體金試紙條內，5 min后可觀察到結果，20 min時終止觀察，結果可見兩條紫紅色線條，C線(質控帶)和T線(反應帶)皆顯色，結果為鼠疫抗原檢測陽性；僅見一條紫紅色線條，結果為鼠疫抗原檢測陰性；無任何線條出現或僅有T線，說明試驗無效，重新測試，同時做空白對照。

1.2.4 鼠疫反向血凝試驗與細菌培養(yǎng)按《鼠疫診斷標準》[1]進行。

2 結果

2.1 37 ℃細菌菌液與37 ℃臟器懸液經RIHA、RGICA和細菌培養(yǎng)這三種方法同步檢測，結果陽性率為100%。

2.2 28 ℃細菌菌液與28 ℃臟器懸液用RIHA和細菌培養(yǎng)檢測，結果陽性率為100%，RGICA檢測結果為陰性，見表1。

表1 鼠疫RIHA、RGICA和細菌學實驗檢驗比較結果

Table 1 Comparison of detecting Yersinia pestis with RIHA，bacteriology and RGICA

2.3 28 ℃和37 ℃菌液及臟器懸液的反向血凝結果見表2

表2 RIHA測定鼠疫抗原結果

Table 2 The results of detecting Yersinia pestis antigen with RIHA

3 討論

3.1 試驗結果表明，將37 ℃的菌懸液及37 ℃的細菌感染動物取材行RGICA、RIHA和細菌培養(yǎng)實驗，陽性率均為100%，說明這三種方法對檢測37 ℃細菌敏感。FI抗原為莢膜抗原，在37 ℃條件下鼠疫菌F1抗原含量高，現有資料表明莢膜抗原具有抗吞噬作用，感染動物后，37 ℃細菌因具有FI抗原表現為促巨噬細胞使捕獲細菌能力減弱，致動物死亡，死亡動物臟器組織FI抗原含量高，由于小白鼠的平均體溫為35.2 ℃～36 ℃，適宜FI抗原的產生。因此，鼠疫菌在動物體內FI抗原產量高，所有特異檢測FI抗原的方法皆能檢測出陽性結果。

3.2 28 ℃菌懸液鼠疫抗原膠體金檢測陽性率為100%。用28 ℃細菌菌懸液感染動物，取材，經鼠疫抗原膠體金檢測呈陰性，反向血凝試驗陽性率為100%，細菌檢測陽性率為100%。28 ℃細菌含有少量FI抗原，膠體金色譜試驗依然能檢測出陽性結果；28 ℃細菌感染動物后，動物發(fā)病死亡取材經膠體金色譜試驗不能檢測出鼠疫FI抗原，我們對于鼠疫菌進入動物體內后，主要在什么部位繁殖，在動物體內如何代謝，所知甚少[2]。因此，對于同一株菌感染動物后檢測結果不同，可能僅因培養(yǎng)溫度不同，即在28 ℃培養(yǎng)的細菌感染小白鼠，由于缺乏FI抗原，細菌對巨噬細胞的防御性降低，很容易被白鼠的巨噬細胞消化，因此在體內孵育無法產生FI抗原[3]。本研究結果表明，28 ℃鼠疫菌FI抗原含量少，感染動物后FI抗原含量依然少，值得檢驗人員注意的是野外現場取材后，按四步檢驗法，培養(yǎng)物均置于28 ℃溫箱，如遇FI抗原缺失的細菌，在細菌難以分離的情況下，膠體金無法測得，容易漏診。反向血凝試驗由于致敏血球制備中抗體是通過全菌免疫自然產生的抗體即“多克隆”抗體，故可檢測到50種鼠疫菌毒力相關蛋白[4-5]，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白印跡兩種方法，對鼠疫FI抗體組分進行分析，多克隆抗體除免疫球蛋白輕、重鏈之外，還有一些其他蛋白，約占總蛋白的60%[6]，鼠疫EV菌具有復雜的抗原成分，在感染和免疫方面鼠疫菌許多抗原特定部位中，FI抗原屬于被膜或外膜抗原，對這種抗原的性質和特點做過較充分的研究，但其他部位的抗原及相應抗體研究較少。有試驗表明，將鼠疫菌的標準株的抗原，通過印跡反應檢測鼠疫菌的全膜蛋白電泳后轉膜分別與FI的3種抗體結合的實驗均出現了交叉反應[7]，可以推測在野外檢測材料中存在多種鼠疫抗原，交叉反應的出現進一步證實了用常規(guī)方法獲得的FI抗體特異性不高。由于制備抗體的免疫原為全菌免疫的抗血清，應有其他免疫蛋白，反向血凝試驗能夠在動物感染材料中檢出含量低的鼠疫FI抗原。RIHA測定鼠疫抗原結果表明，28 ℃鼠疫菌雖然缺失FI抗原，但RIHA依然能夠檢出，其滴度與37 ℃的細菌感染動物后取材檢測RIHA滴度只低一個滴度，這也證明應用多克隆抗體可以檢測相應的多種鼠疫抗原。

3.3 從實驗研究結果及現場應用來看，鼠疫抗原膠體金試驗最主要的問題是漏檢，漏檢的主要原因除上述FI抗原缺乏的問題外，還存在試劑和樣本問題。試劑的靈敏度限制膠體金檢測方法的靈敏度，膠體金試劑的靈敏度為10 ng/mL，當檢測量低于10 ng/mL時，就容易出現假陰性。樣本的原因是由于被檢物抗原含量過高時，膠體金法全部不顯現陽性條帶，出現“前置現象”，將被檢物稀釋后 ，陽性條帶可立即顯現，該現象是由于樣本抗原濃度明顯多于膠體金制備濃度造成比例不適引起[8]。因此，在現場檢測中遇到可疑條帶不能判斷時，首先應稀釋樣本，建議用不同濃度同時檢測避免漏診。

鼠疫是一種傳播迅猛亟需快速診斷判定的傳染病，因此鼠疫的早期診斷與鼠疫菌的快速鑒定對于鼠疫的防御與治療具有重要的意義。以往鼠疫的診斷主要依靠病原菌的分離，這往往受被檢材料的腐敗程度、取材前患者是否服用過抗生素、病原菌的毒力差異等因素影響，而且鼠疫菌的分離需要時間，因此僅僅靠細菌學診斷是不能滿足鼠疫疫源檢索、疫情監(jiān)測、動物鼠疫調查、鼠疫患者診斷早期的需要及現場迅速判定的要求；RGICA采用鼠疫單克隆抗體作為捕捉抗原的探針，捕捉特異的FI抗原具有較強的特異性，由于操作簡便、快速，已被檢驗人員廣泛使用，但其敏感性不高，在實際工作中有局限，只能用于初篩檢測，檢測結果不能作為確診依據；反向凝集試驗檢測快、敏感度高，在鼠疫疫情判定和疫源地追溯診斷中依然是經典的檢測方法。

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Explore the problems of colloidal gold paper chromatography in plague FI antigen detection

Xie Hui，Yu Xiaotao，Li Jun，Zhang Aiping，Wei Baiqing

(Qinghai Province Institute of Endemic Disease Prevention and Control，Xining 811602)

Objective Compared the specificity and sensitivity of colloidal gold paper chromatography(RGICA)，reverse indirect hemagglutination assay(RIHA)and bacteria inspection for Yersinia pestis which were cultured at 28 ℃ and 37 ℃，respectively.Methods Yersinia pestis were cultivated 24 h at 28 ℃ and 37 ℃ to prepare with bacteria liquid and infected animals preparation of bacteria suspension and then were respectively performed RGICA，RIHA and bacteria inspection.Results RGICA，RIHA and bacteria inspection were sensitive in 37 ℃ plague bacteria liquid and 37 ℃ plague bacteria infected animals prepared with bacteria suspension.RGICA，RIHA and bacteria inspection were not sensitive in 28 ℃ plague bacteria liquid and 28 ℃ plague bacteria infected animal prepared with bacteria suspension.Conclusion Because of its simple，rapid and sensitive characteristics，RIHA has been used as a diagnostic criteria for plague.the sensitivity of 28 ℃ colloidal gold paper is poor and the absence of f1-negative strains antigen detection may lead to misdiagnosis，it can only be used as a auxiliary diagnosis.

Colloidal gold Temperature Plague Antigen Test Problems

※：國家自然科學基金(81260438)；※※：通訊作者，主任醫(yī)師，Email：wbq9@163.com 謝 輝(1974～)女，漢族，湖北籍， 主管醫(yī)師

R378.61

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.008

2015-12-23