藏藥三味檀香散對離體大鼠肺小動脈的舒張作用及機制*

李思霖，南星梅，2，李占強，2，黨占翠，2，吳 萍**，蘆殿香，2***

(1.青海大學醫(yī)學院；2.青海省高原醫(yī)學應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室)

藏藥三味檀香散對離體大鼠肺小動脈的舒張作用及機制*

李思霖1，南星梅1，2，李占強1，2，黨占翠1，2，吳 萍1**，蘆殿香1，2***

(1.青海大學醫(yī)學院；2.青海省高原醫(yī)學應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室)

目的 研究藏藥三味檀香散對離體大鼠肺小動脈的舒張作用并探討其可能機制。方法 利用去甲腎上腺素(NE)和氯化鉀(KCl)預收縮離體大鼠肺小動脈，比較三味檀香散95%乙醇提取物和水提物的舒血管作用；研究不同工具藥對醇提物舒血管作用的影響。結(jié)果 三味檀香散醇提物和水提物均可抑制NE(1μmol·L-1)引起的肺小動脈的收縮作用。其中，醇提物的舒血管作用更優(yōu)，兩者比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在濃度為0.3、0.9mg/mL時，水提物對KCl(60mmol·L-1)預收縮血管環(huán)的作用優(yōu)于醇提物(P<0.05)。在0.6、0.9mg/mL時，一氧化氮合酶阻斷劑左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME，100μmol·L-1)和前列環(huán)素合酶阻斷劑吲哚美辛(IMT，10μmol·L-1)均能抑制醇提物對肺小動脈環(huán)的舒張作用(P<0.05)，在0.9mg/mL濃度時，IMT的阻斷作用優(yōu)于L-NAME。電壓依賴性K+通道(Kv)阻斷劑4-氨基吡啶(4-AP，1mmol·L-1)、內(nèi)向整流K+通道(KIR)阻斷劑氯化鋇(BaCl2，1mmol·L-1)、鈣激活K+通道(KCa)阻斷劑四乙基氯化銨(TEA)均可抑制醇提物對肺小動脈環(huán)的舒張作用(P<0.05)。結(jié)論 三味檀香散95%醇提物對NE預收縮血管環(huán)的舒張作用優(yōu)于水提物。藥物醇提物舒張大鼠肺小動脈的可能作用機制：1)通過抑制細胞膜受體門控性鈣通道，減少Ca2+流入血管平滑肌細胞引起血管舒張；2)作用于肺小動脈內(nèi)皮，促進內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)至平滑肌使平滑肌舒張；3)作用于肺小動脈平滑肌的鉀離子通道(Kv，KIR，KCa)，促進通道開放引起血管平滑肌舒張。

三味檀香散 提取物 血管舒張作用 機制

藏藥三味檀香散，又名贊旦松湯，原載于藏醫(yī)學經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》，由檀香、肉豆蔻、廣棗三味組成，是藏醫(yī)臨床治療“心熱病”的經(jīng)典常用藏醫(yī)藥方。楊梅等將大鼠置于模擬海拔5000 m的低壓氧艙內(nèi)，研究三味檀香散對大鼠肺動脈壓和右心室肥厚重構(gòu)的影響時發(fā)現(xiàn)，三味檀香散不僅可以有效降低HAPH大鼠的平均肺動脈壓，而且明顯減輕HAPH大鼠右心室的重構(gòu)[1]。為了明確三味檀香散干預低氧性肺動脈高壓發(fā)生的機制，本研究制備了三味檀香散95%乙醇提取物和水提物，利用去甲腎上腺素(NE)和氯化鉀(KCl)預收縮大鼠離體肺小動脈血管環(huán)，觀察三味檀香散醇提物和水提物對預收縮血管環(huán)的影響，以此分析藥物藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠[實驗動物許可證號SCXK(陜)2012-003，西安交通大學動物實驗中心，體質(zhì)量(250±20)g，大鼠自由進食飲水]。三味檀香散(青海省藏醫(yī)院)。重酒石酸去甲腎上腺素注射液(Norephinephrine，NE，國藥準字H12020621，天津金耀氨基酸有限公司)，N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽(L-NAME，批號：101150336，Sigma)，四乙基氯化銨(TEA，批號：28460，貨號：1040692，Sigma)，4-氨基吡啶(4-AP，貨號：275875，Sigma)，吲哚美辛(IMT，貨號：18280，Sigma)，氯化鋇(BaCL2，批號：1001900129，Sigma)，Krebs-Henseleit(K-H)液(氯化鈉118，氯化鉀4.7，氯化鈣2.5，硫酸鎂1.2，磷酸二氫鉀1.2，碳酸氫鈉25，葡萄糖11.1mmol·L-1；PH=7.4；無機鹽試劑均為市售分析純試劑)。RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，Alpha1-2 plus型冷凍干燥器(德國Christ公司)，張力傳感器(JH-2，中國北京航空醫(yī)學研究所)，BL-420F型生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，HV-4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 三味檀香散95%乙醇提取物和水提物的制備

95%乙醇提取物制備：取三味檀香散藥粉30.00 g，置于500 mL燒瓶中，加入150 mL 95%的分析乙醇，回流提取3次，每次60 min，合并提取液旋蒸濃縮至膏狀物，再用去離子水定容至400 mL。分裝并置于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

水提物制備：取三味檀香散藥粉30.00 g，置于500 mL燒瓶中，加入150 mL純凈水，回流提取3次，每次60 min，合并提取液旋蒸濃縮至膏狀物，再用去離子水定容至400 mL。分裝并置于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 大鼠肺小動脈血管環(huán)的分離及離體血管環(huán)灌流實驗

20%烏拉坦腹腔注射(0.5mL/0.1kg)麻醉大鼠，仰臥固定，打開胸腔，將心肺快速取出，置于氧飽和的、冰浴的KH液中。剪下肺葉(左肺上葉)，用大頭針固定肺葉于冰浴的KH液中。快速鈍性分離2～3級肺動脈，分離過程中避免牽拉肺動脈，盡量保持動脈環(huán)完整。隨后將分離的肺小動脈剪成平均長度為2 mm的血管環(huán)。

將肺動脈環(huán)固定在上下兩根三角形掛鉤上，其中一個掛鉤連接張力傳感器，另外一個掛鉤固定在通氣桿上。實驗期間，血管環(huán)被浸泡在含有10 mL KH液的組織浴槽內(nèi)，期間持續(xù)通入混合氣體(95%O2+5%CO2)，并保持37 ℃恒溫。給予血管環(huán)300～400 mg基礎(chǔ)張力，并在此環(huán)境下平衡約120 min后進行實驗。平衡期間每隔15 min將組織浴槽內(nèi)的KH液更換為新鮮的氧飽和的37℃ KH液。血管的張力變化通過張力傳感器輸入信號采集系統(tǒng)，最后呈現(xiàn)并記錄在計算機上。舒張率=(藥物引發(fā)的張力)/1μmol·L-1NE或60mmol·L-1KCl引發(fā)的張力)×100%。

1.2.3 三味檀香散對NE和KCl預收縮血管環(huán)的作用及其機制研究

肺動脈環(huán)調(diào)至基礎(chǔ)張力后，平衡至最佳狀態(tài)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，向浴槽內(nèi)加入NE(1μmol·L-1)，待肺動脈收縮達到最大值并進入平臺期后，向浴槽內(nèi)累積加入三味檀香散95%乙醇提取物(0.3～0.9mg/mL)或者水提物(0.3～1.2mg/mL)，對照組累積加入相同體積的KH液，觀察藥物對NE預收縮肺動脈張力的影響。

肺動脈環(huán)調(diào)至基礎(chǔ)張力后，平衡至最佳狀態(tài)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，向浴槽內(nèi)加入KCl(60mmol·L-1)，待肺動脈收縮達到最大值并進入平臺期后，向浴槽內(nèi)累積加入三味檀香散95%乙醇提取物或水提物(0.3～1.2mg/mL)，對照組累積加入相同體積的KH液，觀察藥物對KCl預收縮肺動脈張力的影響。

阻斷劑對三味檀香散舒張NE預收縮大鼠離體肺動脈影響的實驗方法如下：將肺動脈調(diào)整至基礎(chǔ)張力，并平衡至最佳狀態(tài)，向組織浴槽內(nèi)加入NE(1μmol/L)，待血管環(huán)收縮至最大值，并且出現(xiàn)平臺期之后，分別加入L-NAME(100μmol·L-1)、IMT(10μmol·L-1)、4-AP(1mmol·L-1)、BaCL2(1mmol·L-1)、TEA(1mmol·L-1)，對照組加入相同體積的KH液，待新的平臺期出現(xiàn)后，再向各個組織浴槽內(nèi)累積加入三味檀香散95%乙醇提取物(0.3～0.9mg/mL)，觀察張力的變化。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 三味檀香散醇提物和水提物對NE預收縮肺小動脈舒張率(%)影響的結(jié)果(表1)

Table 1 95% ethanol and aqueous extracts of Sanweitanxiang on NE pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation

表1顯示，三味檀香散95%乙醇提取物(0.3～0.9mg/mL)和水提物(0.3～1.2mg/mL)均可呈劑量依賴性地舒張NE預收縮的肺小動脈。與水提物相比，95%乙醇提取物對NE預收縮肺小動脈的舒張作用更優(yōu)，兩者比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 三味檀香散醇提物和水提物對KCl預收縮肺小動脈舒張率(%)影響的結(jié)果(表2)

Table 2 95% ethanol and aqueous extract of Sanweitanxiang on KCl pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation

表2顯示，三味檀香散95%乙醇提取物和水提物(0.3～1.2mg/mL)均可呈劑量依賴性地舒張KCl預收縮的肺小動脈。在濃度為0.3、0.9mg/mL時，水提物對KCl預收縮血管環(huán)的作用優(yōu)于醇提物(P<0.05)。

2.3 L-NAME和IMT預處理對三味檀香散醇提物舒張NE預收縮肺小動脈舒張率(%)作用影響的結(jié)果(表3)

Table 3 95% ethanol extract of Sanweitanxiang on NE pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation treated by L-NAME and IMT

*：與對照組比較，P<0.05；▲：與L-NAME組比較，P<0.05.

表3顯示，三味檀香散醇提物對NE預收縮肺小動脈血管環(huán)的舒張作用能夠被L-NAME、IMT不同程度地阻斷，兩組的最大舒張率分別為61.07±1.74、31.73±0.58，低于對照組的最大舒張率(79.73±2.71，P<0.05)。在濃度為0.6、0.9mg/mL時，L-NAME和IMT均能阻斷醇提物對肺小動脈環(huán)的舒張作用(P<0.05)，在0.9mg/mL時，IMT的阻斷作用優(yōu)于L-NAME。

2.4 4-AP、BaCl2和TEA預處理對三味檀香散醇提物舒張NE預收縮肺小動脈舒張率(%)作用影響的結(jié)果(表4)

Table 4 95% ethanol extract of Sanweitanxiang on NE pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation in presence of 4-AP，BaCl2and TEA

*：與對照組比較，P<0.05；▲：與4-AP組比較，P<0.05；△：與BaCl2組比較，P<0.05.

表4顯示，三味檀香散醇提物對NE預收縮肺小動脈血管環(huán)的舒張作用能夠被4-AP、BaCl2和TEA不同程度地阻斷，三組的最大舒張率分別為63.00±1.67、21.42±0.88、39.59±0.35，低于三味檀香散對照組的最大舒張率(79.73±2.71，P<0.05)。在濃度為0.6、0.9mg/mL時，BaCl2的阻斷作用優(yōu)于4-AP和TEA(P<0.05)。

3 討論

血管張力的維持主要受血管平滑肌的收縮和內(nèi)皮依賴性舒張兩者的動態(tài)調(diào)控。細胞外Ca2+內(nèi)流及細胞內(nèi)Ca2+釋放所產(chǎn)生的Ca2+，在血管平滑肌的收縮中起關(guān)鍵作用。細胞膜上的受體門控性鈣通道、電壓門控性鈣通道在調(diào)控細胞外Ca2+內(nèi)流中起主要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，三味檀香散95%乙醇提取物和水提物均可呈劑量依賴性地舒張NE和KCl預收縮的肺小動脈。其中，95%乙醇提取物對NE預收縮血管環(huán)的舒張作用更優(yōu)，而醇提物和水提物對KCl預收縮的肺小動脈無明顯的舒張作用(最大舒張率僅在35%左右)，說明這種舒張作用與抑制受體門控性鈣通道的作用有關(guān)，與抑制電壓門控性鈣通道的關(guān)系較小[2-3]。

血管內(nèi)皮細胞中的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)可以催化L-精氨酸生成NO，NO進入血管平滑肌細胞，激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生cGMP，通過cGMP依賴性蛋白激酶使Ca2+內(nèi)流減少，增加肌漿網(wǎng)上鈣ATP酶對Ca2+的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化而使血管發(fā)生舒張[4]。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-NAME預處理能降低三味檀香散95%醇提物的舒血管作用，提示三味檀香散可能通過NO途徑介導血管舒張的作用。血管內(nèi)皮細胞還可產(chǎn)生PGI2。PGI2可以作用于血管的平滑肌細胞，使細胞內(nèi)cAMP生成增加，從而導致血管的舒張。本研究顯示，用吲哚美辛抑制環(huán)氧合酶可以減弱藥物的舒血管作用，提示三味檀香散可能通過環(huán)氧合酶途徑發(fā)揮血管舒張的作用[5]。

在研究K+通道阻斷劑對三味檀香散舒張肺小動脈的影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，電壓依賴性K+通道(Kv)阻斷劑4-氨基吡啶(4-AP)、大電導鈣激活性鉀離子通道(BKCa)和內(nèi)向整流鉀離子通道(KIR)阻斷劑(TEA和BaCL2)能夠不同程度地阻斷三味檀香散醇提物對大鼠肺小動脈的舒張作用，說明藥物可能促進了鉀通道的開放，從而引起血管平滑肌的舒張[6]。根據(jù)文獻報道[7]，NO-cGMP通路在內(nèi)皮依賴性的血管舒張中占主要地位。NO誘導的血管舒張作用部分依賴于cGMP、PKG介導的大電導鈣激活性鉀離子通道(BKCa)的活化。因此我們推測，三味檀香散95%乙醇提取物誘導的大鼠肺小動脈的舒張作用可能是通過作用于NO-cGMP-PKG- BKCa通路，引起細胞內(nèi)Ca2+水平下降而導致血管舒張。

[1]陳宏，趙媛，李亞楠，等.三味檀香散預處理對低壓低氧性大鼠右心室重構(gòu)的影響[J].青海醫(yī)學院學報，2015，36(3)153-157.

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Research on the Effect and Mechanism of SANWEITANXIANG Powder on Inducing Rat Pulmonary Artery Vasorelaxation

Li Silin1，Nan Xingmei1，2，Li Zhanqiang1，2，Dang Zhancui1，2，Wu Ping1**，Lu Dianxiang1，2***

(1.Medical College of Qinghai University； 2.Key laboratory of application and foundation for high altitude medicine research in Qinghai province)

Objective To investigate the Tibetan medicinal complex Sanweitanxiang powder(SWTXP)on rat pulmonary artery vasorelaxatioan in vitro and it′s mechanism.Methods NE and KCl pre-contracted pulmonary artery vascular rings methodinvitrowas used to detect the effects of aqueous extract and 95% ethanol extract of SWTXP.The effects of different tool drugs on rat’s pulmonary artery vasorelaxation by 95% ethanol extract were studied.Results The effect of pulmonary artery contraction with NE was inhibited by the aqueous extract and 95% ethanol extract.The effect of 95% ethanol extract on NE pre-contracted pulmonary artery vascular rings was better than that of the aqueous extractand showed significant statistical difference(P<0.05).The effect of aqueous extract on KCl pre-contracted pulmonary artery vascular rings was better than that of the 95% ethanol extract at concentration of 0.3mg/mL and 0.9mg/mL(P<0.05).And the effect of pulmonary artery vasorelaxation of the 95% ethanol extract was inhibited by adding L-NAME(100μmol·L-1)and IMT(10μmol·L-1)at 0.6mg/mL.And IMT performed a better inhibition effect than that of L-NAME at 0.9mg/mL(95% ethanol extract).Additionally，the pulmonary artery vasorelaxation of the 95% ethanol extract was also inhibited by 4-AP(1mmol·L-1)，BaCl2(1mmol·L-1)and TEA(1mmol·L-1).Conclusions The effect of 95% ethanol extract on NE pre-contracted pulmonary artery vascular rings was better than that of the deionized water extract.And the mechanism weve included as follows：1)The vasorelaxation effect was based on inhibiting receptor-operated calcium channel which reducing intracellular Ca2+levels；2)The 95% ethanol extract could increase NO and PGI2concentration by influencing pulmonary artery endothelium which played a role in inducing pulmonary artery vasorelaxation；3)The 95% ethanol extract could induce vasorelaxation by opening the potassium ion channels(Kv，KIRand Kca)

Sanweitanxiang powder Extracts Vasorelaxation Mechanism

*：青海省人力資源和社會保障廳2015年度留學人員科技活動擇優(yōu)資助項目[青人社廳函(2015)386號，青人社廳函(2015)522號] 李思霖(1988～)，女，漢族，黑龍江籍，在讀碩士研究生.**：通訊作者，教授，wupingyixue@163.com；***：第一通訊作者，教授，ludianxiang@qhu.edu.cn

R96

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.012

2016-04 -04