工業(yè)生物過程智能控制原理和方法進(jìn)展

田錫煒，王冠，張嗣良，莊英萍

工業(yè)生物過程智能控制原理和方法進(jìn)展

田錫煒1,3，王冠1,3，張嗣良1,2,3，莊英萍1,2,3

1 華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，上海 200237 2 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237 3 國家生化工程技術(shù)研究中心 (上海)，上海 200237

工業(yè)生物過程是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)過程，對(duì)活體細(xì)胞代謝過程的認(rèn)識(shí)是實(shí)現(xiàn)高效工業(yè)生物制造的基礎(chǔ)。文中首先綜述了工業(yè)發(fā)酵過程多尺度優(yōu)化控制原理和實(shí)踐，包括多尺度理論與裝備、細(xì)胞宏觀代謝在線檢測(cè)傳感技術(shù)以及生理代謝參數(shù)相關(guān)分析。在此基礎(chǔ)上，對(duì)工業(yè)生物過程智能控制——感知細(xì)胞內(nèi)生理代謝特性新型傳感技術(shù)、大數(shù)據(jù)庫建立和數(shù)據(jù)深度計(jì)算以及生物過程智能決策進(jìn)行了綜述和展望。

工業(yè)生物過程，在線傳感技術(shù)，生理代謝，過程大數(shù)據(jù)，智能控制

工業(yè)生物過程是利用微生物或細(xì)胞代謝生產(chǎn)相關(guān)細(xì)胞或代謝產(chǎn)物的過程，由于涉及到復(fù)雜的活體細(xì)胞代謝，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)完全一樣的操作條件，但最后的結(jié)果卻千差萬別的不可控現(xiàn)象，究其原因就在于對(duì)活體細(xì)胞代謝過程中的核心問題——細(xì)胞代謝特性沒有掌控。因此在實(shí)現(xiàn)高效工業(yè)生物制造過程中，需要對(duì)細(xì)胞生理代謝特性的在線檢測(cè)，進(jìn)而感知過程；在獲得海量的過程參數(shù)變化信息后，如何使過程參數(shù)可視化，同時(shí)建立過程參數(shù)的海量數(shù)據(jù)庫，為后續(xù)的大數(shù)據(jù)分析奠定基礎(chǔ)；對(duì)過程大數(shù)據(jù)如何進(jìn)行深度學(xué)習(xí)、數(shù)據(jù)挖掘等算法，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)生物過程智能分析、診斷與精確控制，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)智能化制造。

本文將就工業(yè)發(fā)酵過程感知——在線傳感技術(shù)、生理代謝特征參數(shù)可視化與過程大數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建、基于過程參數(shù)與大數(shù)據(jù)庫知識(shí)的比對(duì)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)狀態(tài)識(shí)別、狀態(tài)決策的基本研究方法的現(xiàn)狀和未來發(fā)展前景進(jìn)行探討。

1 工業(yè)發(fā)酵過程多尺度優(yōu)化控制原理與實(shí)踐

1.1 多尺度理論與裝備

在生物反應(yīng)器中，細(xì)胞代謝是一個(gè)非常復(fù)雜的活體生命系統(tǒng)：一方面細(xì)胞代謝過程的特性由細(xì)胞類型所確定，例如，頭孢菌素C (Cephalosporin C) 的生產(chǎn)菌主要為頂頭孢霉菌；另一方面細(xì)胞代謝過程的特性也會(huì)受到生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)和外界環(huán)境條件的影響，相同的生產(chǎn)菌種，其培養(yǎng)基、過程調(diào)控策略的不同都會(huì)最終表現(xiàn)在產(chǎn)量上的差異，同時(shí)生物反應(yīng)器內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不同則會(huì)顯著影響其內(nèi)部流場變化，包括物質(zhì)傳遞、混合和剪切等，同樣會(huì)對(duì)最終產(chǎn)物產(chǎn)量造成影響。因此，細(xì)胞反應(yīng)過程是存在著基因尺度、細(xì)胞尺度、反應(yīng)器尺度等多尺度、多輸入、多輸出的復(fù)雜系統(tǒng) (圖1)，為了實(shí)現(xiàn)生物過程的優(yōu)化與放大，需要對(duì)生物反應(yīng)過程進(jìn)行跨尺度的觀察與調(diào)控[1]。

通過設(shè)計(jì)和制造配有多參數(shù)檢測(cè)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，包括生物反應(yīng)器和計(jì)算機(jī)控制及數(shù)據(jù)采集兩部分，能夠較為系統(tǒng)地獲得細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的過程宏觀代謝特性 (圖2)[2]。

一般來說，上述提到的生物反應(yīng)器體積在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模為5–50 L，而工業(yè)規(guī)模則多為百噸級(jí)。在檢測(cè)多參數(shù)的過程中，除了常規(guī)環(huán)境參數(shù)包括溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH、溶氧 (Dissolved oxygen, DO) 以外，還會(huì)對(duì)過程中的尾氣組分進(jìn)行在線分析檢測(cè)，主要包括O2濃度和CO2濃度，從而可以用來實(shí)時(shí)在線獲得關(guān)鍵細(xì)胞生理參數(shù)、氧氣攝取速率 (Oxygen uptake rate, OUR) 和二氧化碳釋放速率 (Carbon dioxide evolution rate, CER)。此外，為了精確計(jì)算OUR和CER，在實(shí)驗(yàn)室生物反應(yīng)器中會(huì)配備熱質(zhì)量流量計(jì)和全罐稱重系統(tǒng)來準(zhǔn)確精確控制通氣量和發(fā)酵工作體積，而工業(yè)規(guī)模則一般配置渦街流量計(jì)和差壓變送器來實(shí)現(xiàn)相關(guān)功能。

1.2 細(xì)胞宏觀生理代謝特性在線檢測(cè)傳感設(shè)備

近十幾年來，隨著在線傳感技術(shù)的快速發(fā)展，許多先進(jìn)在線傳感器應(yīng)用到生物工程領(lǐng)域，包括過程尾氣質(zhì)譜儀、活細(xì)胞傳感器、電子鼻等，為生物過程的優(yōu)化和放大技術(shù)進(jìn)步起到了重要作用。

圖1 生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞多尺度網(wǎng)絡(luò)示意圖[2]

圖2 多參數(shù)生物反應(yīng)器示意圖[2]

1.2.1 過程尾氣質(zhì)譜儀

過程尾氣質(zhì)譜儀能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)酵過程尾氣組分的實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，包括N2、O2、CO2等，從而對(duì)于認(rèn)知發(fā)酵過程中細(xì)胞的代謝活性具有重要意義。目前，美國Extrel公司生產(chǎn)的質(zhì)譜儀在生物工程領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用市場。其產(chǎn)品主要通過四級(jí)桿方式進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)檢測(cè)樣品進(jìn)入進(jìn)樣系統(tǒng)后，氣體分子會(huì)受到離子源的轟擊，形成不同帶電荷離子，然后在磁場的作用下，不同的離子會(huì)根據(jù)質(zhì)荷比的不同落在檢測(cè)器的不同位置上，從而實(shí)現(xiàn)全譜掃描。

1.2.2 電子鼻

電子鼻又稱氣味掃描儀，最初是用于快速檢測(cè)食品中特定成分含量的一種儀器。隨著其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，目前在發(fā)酵行業(yè)也已經(jīng)作為一種重要的在線傳感器。電子鼻與過程質(zhì)譜儀類似，也是對(duì)尾氣成分進(jìn)行在線檢測(cè)，但其原理則是通過SnO2氣敏膜對(duì)氣體成分和含量響應(yīng)不同來實(shí)現(xiàn)定性和定量檢測(cè)。一般來說，SnO2氣敏膜具有高靈敏、快速響應(yīng)的特點(diǎn)，因此能夠?qū)怏w中微量成分進(jìn)行測(cè)定。目前，常規(guī)的氣敏膜靈敏度為1–10 000 mg/kg，但是部分氣敏膜能夠達(dá)到100 ng/L的靈敏度。

1.2.3 活細(xì)胞傳感器

活細(xì)胞傳感器的檢測(cè)原理是正常活細(xì)胞具有完整的細(xì)胞膜，其胞內(nèi)的帶電荷離子在特定頻率的交變電場下能夠發(fā)生極化現(xiàn)象，從而使得每一個(gè)正?；罴?xì)胞可以被認(rèn)為是一個(gè)非常小的電容器。因此通過檢測(cè)發(fā)酵液環(huán)境中的電容信號(hào)，再經(jīng)過一定的信號(hào)數(shù)據(jù)處理，就能夠得到相應(yīng)的電容值，其大小與發(fā)酵液環(huán)境中的活細(xì)胞量呈正相關(guān)。相比之下，死細(xì)胞由于細(xì)胞膜破碎，胞內(nèi)離子釋放到環(huán)境中，同時(shí)發(fā)酵液環(huán)境中固體顆粒等物質(zhì)并不帶電荷，因此不會(huì)對(duì)電容值的測(cè)定造成影響，從而能夠很好地特異性檢測(cè)活細(xì)胞生物量。

1.3 生理代謝特征參數(shù)可視化與參數(shù)相關(guān)分析

多參數(shù)生物反應(yīng)器系統(tǒng)能夠通過計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)過程參數(shù)的在線檢測(cè)和采集。一方面，數(shù)據(jù)采集與反應(yīng)器的計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制形成完整的控制系統(tǒng)，另一方面研究人員從大量的數(shù)據(jù)中挖掘工藝過程調(diào)控所需的依據(jù)也是重要的研究內(nèi)容。華東理工大學(xué)張嗣良研究團(tuán)隊(duì)在控制論的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物過程特性以及生物反應(yīng)器特點(diǎn)，自主開發(fā)了適用于發(fā)酵過程多尺度參數(shù)相關(guān)分析用的軟件包 (BIOSTAR)[3]。圖3即為頭孢菌素C發(fā)酵過程多參數(shù)曲線圖，利用BIOSTAR軟件獲得的在線檢測(cè)參數(shù) (包括表征細(xì)胞生理代謝特性的OUR、CER、RQ及離線測(cè)得的頭孢菌素C產(chǎn)量等) 的實(shí)時(shí)變化趨勢(shì)，通過結(jié)合生物學(xué)知識(shí)，對(duì)這些參數(shù)開展相關(guān)分析，就有可能實(shí)現(xiàn)在反應(yīng)器尺度了解細(xì)胞代謝、甚至基因尺度變化的情況，最后實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的優(yōu)化。

1.3.1 細(xì)胞微觀與宏觀生理代謝特性研究

細(xì)胞是生物體完成各種代謝反應(yīng)的場所，在這個(gè)過程中，各種代謝物都會(huì)在胞內(nèi)外形成動(dòng)態(tài)平衡，從而維持細(xì)胞代謝的穩(wěn)定。代謝通量研究是認(rèn)知細(xì)胞代謝的重要內(nèi)容，代謝物濃度與代謝通量密切相關(guān)。細(xì)胞通過代謝網(wǎng)絡(luò)利用環(huán)境中碳源和氮源進(jìn)行生長和生產(chǎn)，整個(gè)過程是一個(gè)復(fù)雜的涉及多組學(xué) (基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、環(huán)境組等) 共同響應(yīng)的過程。其中微觀代謝通量信息是直接認(rèn)識(shí)細(xì)胞生理代謝最有效的手段之一。13C同位素分析法是最常用的微觀代謝通量計(jì)算技術(shù)，但是目前國內(nèi)外更多是基于穩(wěn)態(tài)條件 (代謝穩(wěn)態(tài)和同位素穩(wěn)態(tài)) 下的通量分析，因此很難具體應(yīng)用到實(shí)際的工業(yè)生物過程中，因?yàn)楣I(yè)規(guī)模生產(chǎn)過程多涉及非代謝穩(wěn)態(tài)條件 (分批培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng))。針對(duì)13C代謝流測(cè)定技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中碰到的實(shí)驗(yàn)成本高、實(shí)驗(yàn)周期長等困難，華東理工大學(xué)莊英萍研究團(tuán)隊(duì)提出裝置微型化、標(biāo)記動(dòng)態(tài)化及取樣快速化的解決思路，從而研究批培養(yǎng)和補(bǔ)料批培養(yǎng)過程中胞內(nèi)代謝途徑通量的變化[1]。

圖3 頭孢菌素C發(fā)酵過程在線參數(shù)變化趨勢(shì)圖

另一方面，在生物過程多參數(shù)分析過程中，各參數(shù)表現(xiàn)出離散、非線性、混雜等特性，這主要是由細(xì)胞代謝復(fù)雜性以及對(duì)環(huán)境響應(yīng)敏感性綜合作用的結(jié)果。往往初始狀態(tài)的細(xì)微差別會(huì)隨著生物過程的進(jìn)行在結(jié)果中產(chǎn)生巨大差異，表現(xiàn)出系統(tǒng)的多態(tài)性和不穩(wěn)定性，為此必須開展有關(guān)生物學(xué)機(jī)理現(xiàn)象認(rèn)識(shí)的研究，才有可能在生物反應(yīng)過程的強(qiáng)化中取得突破性進(jìn)展。參數(shù)相關(guān)性分析是指生物過程中環(huán)境參數(shù)和生理參數(shù)、狀態(tài)參數(shù)和過程參數(shù)、直接參數(shù)和間接參數(shù)、在線參數(shù)和離線參數(shù)之間存在的耦合相關(guān)性。其反映的是細(xì)胞代謝過程中物質(zhì)流、能量流、信息流之間的相互作用和平衡，究其原因可能是細(xì)胞多尺度 (基因尺度、細(xì)胞尺度、反應(yīng)器尺度) 代謝過程中某一水平，但其宏觀表征則為不同尺度參數(shù)間的相關(guān)性。

1.3.2 細(xì)胞生理代謝特性與生物反應(yīng)器流場特性相結(jié)合的放大研究

細(xì)胞代謝過程在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模取得小試優(yōu)化成功后，如何實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模生物反應(yīng)器的放大，關(guān)鍵在于大規(guī)模生物反應(yīng)器中重現(xiàn)細(xì)胞最優(yōu)的生理狀態(tài)。通過先進(jìn)的過程在線傳感檢測(cè)技術(shù)能夠有效認(rèn)識(shí)過程細(xì)胞生理代謝特性的變化，并對(duì)關(guān)鍵敏感參數(shù)進(jìn)行表征，因此在大規(guī)模生物反應(yīng)器中獲得小試生物反應(yīng)器相似的關(guān)鍵參數(shù)變化，則能夠大大提升生物過程放大成功率。同時(shí)，在此過程中需要對(duì)生物反應(yīng)器流場特性進(jìn)行研究，不同規(guī)模生物反應(yīng)器并不只是簡單的體積比例放大，更多的是內(nèi)部結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞代謝的影響，因此需要在工藝調(diào)控策略和生物反應(yīng)器流場特性之間找到最適平衡點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)小試規(guī)模的最優(yōu)細(xì)胞生理狀態(tài)。

雖然攪拌反應(yīng)器結(jié)構(gòu)比較簡單，但其內(nèi)部流場的結(jié)構(gòu)卻隨著攪拌槳結(jié)構(gòu)形式、操作條件的不同而存在很大差異。攪拌反應(yīng)器內(nèi)流場特性的研究主要通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定和數(shù)值模擬兩種方法。早期的流速測(cè)定方法有畢托管、電磁流速計(jì)、壓電探頭及熱線風(fēng)速儀等，這些測(cè)定方法有一個(gè)共同的特點(diǎn)也是影響其在流場測(cè)定中發(fā)展的一個(gè)缺點(diǎn)，即它們都是接觸式的，也就是它們?cè)诹鲌鲋袝?huì)與流場相互作用從而影響流場使測(cè)得的速度并不能真實(shí)還原流場的信息。為了解決這一問題，各種不同的非接觸式流場測(cè)定技術(shù)相繼產(chǎn)生，其中多以激光為重要手段獲取流場內(nèi)的詳細(xì)信息，比較典型的是激光粒子成像測(cè)速技術(shù) (PIV)。這種方法以激光為媒介，不需要在流場中插入探頭，實(shí)現(xiàn)了流場測(cè)定的非接觸性要求。

1.4 發(fā)酵過程優(yōu)化放大案例——基于全局調(diào)控的紅霉素發(fā)酵過程優(yōu)化與放大

紅霉素 (Erythromycin) 是由紅色糖多孢菌代謝產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是我國目前年產(chǎn)量達(dá)萬噸的抗生素大品種。隨著臨床用途增加和新一代紅霉素衍生物的開發(fā)，紅霉素的生產(chǎn)和銷售日趨活躍。我國已成為紅霉素生產(chǎn)的第一大國，但相比于國外先進(jìn)的生產(chǎn)水平和產(chǎn)品質(zhì)量還是存在一定差距。紅霉素生產(chǎn)過程中發(fā)酵單位、組分及設(shè)備大型化過程的工程放大難題是紅霉素產(chǎn)業(yè)所面臨的主要問題。為此，結(jié)合紅霉素生物合成及生理代謝特性，從發(fā)酵組分代謝工程改造調(diào)控、發(fā)酵過程全局敏感參數(shù)調(diào)控、生理參數(shù)OUR跨尺度放大調(diào)控等層面，解析紅霉素發(fā)酵過程微觀與宏觀代謝流相結(jié)合的細(xì)胞代謝特性，并在大型生物反應(yīng)器 (372 m3發(fā)酵罐) 實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)效能強(qiáng)化。

1.4.1 紅霉素組分代謝工程改造調(diào)控

紅霉素發(fā)酵過程存在有效組分紅霉素A含量低、雜質(zhì)組分偏高等問題，通過傳統(tǒng)誘變改造等方法很難實(shí)現(xiàn)抗生素發(fā)酵組分改善，因此采用代謝工程策略，建立紅霉素工業(yè)生產(chǎn)菌高效遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，通過表達(dá)單元設(shè)計(jì)和插入位點(diǎn)調(diào)節(jié)紅霉素A合成后修飾途徑中關(guān)鍵基因甲基化酶 (EryK) 和羥基化酶 (EryG) 的表達(dá)強(qiáng)度，發(fā)酵表型篩選發(fā)現(xiàn)重組菌可實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)組分 (紅霉素B和C) 的完全消除，有效組分紅霉素A 發(fā)酵產(chǎn)量提高20%以上[4-5]。

1.4.2 發(fā)酵過程全局敏感參數(shù)調(diào)控

結(jié)合紅霉素生產(chǎn)菌的生理特性，研究發(fā)現(xiàn)生物反應(yīng)器中細(xì)胞生理受到環(huán)境氮響應(yīng)調(diào)節(jié)，并影響胞內(nèi)微觀代謝流特征性變化，因此通過建立從種子培養(yǎng)、菌體前期生長、產(chǎn)物合成不同階段的全局氮調(diào)控策略，能夠強(qiáng)化紅霉素合成代謝流[6-10]。氮調(diào)控作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，種子培養(yǎng)階段，氮響應(yīng)調(diào)節(jié)胞內(nèi)蛋白酶、淀粉酶等酶活性及菌絲形態(tài)是影響種子培養(yǎng)質(zhì)量的關(guān)鍵；發(fā)酵前期生長階段，速效氮源玉米漿可調(diào)節(jié)發(fā)酵氧代謝強(qiáng)度OUR水平，并促進(jìn)紅霉素合成單元丙酰輔酶A前體來源的主要氨基酸代謝流增加，強(qiáng)化啟動(dòng)紅霉素合成；紅霉素合成期，速效氮源硫酸銨無阻遏抑制作用，NH4+的吸收依靠谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨途徑強(qiáng)化TCA循環(huán)，增加紅霉素A合成的供應(yīng)量，并有效調(diào)節(jié)菌體細(xì)胞活性及紅霉素發(fā)酵組分。上述研究成果在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模中得到應(yīng)用并建立了多種氮源全局跨尺度調(diào)控策略，使紅霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)水平從7 000 U/mL 提高到8 000 U/mL以上，實(shí)現(xiàn)了國內(nèi)首個(gè)紅霉素基因工程菌的產(chǎn)業(yè)化，且發(fā)酵組分優(yōu)勢(shì)明顯，雜質(zhì)組分遠(yuǎn)低于歐洲藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.3 生理參數(shù)OUR 跨尺度放大調(diào)控

由于反應(yīng)器結(jié)構(gòu)形式和操作條件的變化，細(xì)胞在不同反應(yīng)器尺度表現(xiàn)出不同的代謝特性，通過發(fā)酵過程氮調(diào)控、OUR、RQ等參數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，大型生物反應(yīng)器 (372 m3生產(chǎn)罐) 發(fā)酵后期TCA循環(huán)關(guān)鍵酶活降低、紅霉素合成前體利用減弱是造成紅霉素合成速率下降的重要原因。細(xì)胞生理參數(shù)OUR可表征紅霉素合成的代謝強(qiáng)度，從而作為反應(yīng)器過程放大跨尺度操作因子；同時(shí)結(jié)合流場特性研究進(jìn)行反應(yīng)器結(jié)構(gòu)形式設(shè)計(jì)優(yōu)化，采用基于不同反應(yīng)器細(xì)胞生理代謝特性趨于一致原則，實(shí)現(xiàn)紅霉素從50 L-132 m3–372 m3發(fā)酵罐規(guī)模逐級(jí)放大。上述研究克服了傳統(tǒng)發(fā)酵放大過程依據(jù)相似原理的缺陷，為大型生物反應(yīng)器過程強(qiáng)化提供了新思路[11-13]。

2 工業(yè)生物過程智能控制展望

2.1 感知細(xì)胞內(nèi)生理代謝特性的新型傳感器

過程分析技術(shù) (Process analytical technology, PAT) 是由美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 引入的一項(xiàng)監(jiān)管舉措，通過即時(shí)測(cè)量原料、過程中物料以及過程本身的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)來實(shí)現(xiàn)過程設(shè)計(jì)、分析和控制，目的是保證過程的可靠性，確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量[14]。在生物過程監(jiān)測(cè)和控制領(lǐng)域，過程變量的監(jiān)測(cè)能力尤其是連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)至關(guān)重要，它是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高效生產(chǎn)的基礎(chǔ)。美國FDA關(guān)于PAT的倡議與生物制藥的過程分析和控制密切相關(guān)。該倡議旨在應(yīng)用高效過程傳感技術(shù)，對(duì)生產(chǎn)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)過程診斷和精確調(diào)控來提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量，并建立一種通過監(jiān)測(cè)與質(zhì)量相關(guān)的過程變量來確保生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)流程。

生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)是復(fù)雜的三相系統(tǒng)，包括氣相 (罐頂氣體、發(fā)酵液氣泡)、液相 (發(fā)酵液) 和固相 (懸浮生物質(zhì))。因此，傳感器必須監(jiān)測(cè)生物過程所有三相的化學(xué)、物理和生物參數(shù) (圖4)。生物學(xué)變量，如細(xì)胞密度、細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)、蛋白質(zhì)或DNA含量等，這些需要取樣和后續(xù)分析。細(xì)胞培養(yǎng)過程最常用的傳感器主要測(cè)量過程 (在線) 物理參數(shù)和化學(xué)參數(shù)。培養(yǎng)液中葡萄糖、乳酸鹽、代謝物等物質(zhì)監(jiān)測(cè)可以通過在線監(jiān)測(cè)生物傳感器 (電化學(xué)或光學(xué)) 或通過配有熒光吸收和質(zhì)譜檢測(cè)器的液相/氣相色譜儀來實(shí)現(xiàn)。在這些傳感器的基礎(chǔ)上，如今一些新型的生物過程監(jiān)測(cè)傳感器，尤其是光譜傳感器，如在線拉曼分析儀、在線中紅外分析儀、在線熒光分析儀以及低場核磁共振儀等正在逐漸被應(yīng)用于工業(yè)生物過程分析[15]。

生物反應(yīng)器是工業(yè)生物過程進(jìn)行的場所，受限于生物反應(yīng)器自身內(nèi)部結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)以及外界通氣攪拌等功率輸入，細(xì)胞會(huì)有很長的運(yùn)動(dòng)軌跡，加之高的細(xì)胞代謝活性，大規(guī)模培養(yǎng)常常是一個(gè)不均一的體系，表現(xiàn)在大規(guī)模反應(yīng)器內(nèi)存在溶氧、底物濃度、pH以及剪切梯度問題[16-18]。開發(fā)感知細(xì)胞內(nèi)生理代謝特性的新型傳感器可以加速對(duì)于細(xì)胞在大規(guī)模反應(yīng)器內(nèi)動(dòng)態(tài)生理代謝響應(yīng)的了解與認(rèn)識(shí)，總結(jié)細(xì)胞應(yīng)對(duì)秒級(jí)至小時(shí)級(jí)擾動(dòng)的響應(yīng)機(jī)理。在過去十年中，遺傳編碼的熒光傳感器 (Genetically encoded fluorescent sensors) 已經(jīng)逐步被開發(fā)應(yīng)用于生物 (醫(yī)學(xué)) 過程研究，揭示細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)代謝調(diào)節(jié)規(guī)律[19]。自然界中，部分細(xì)菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和細(xì)胞周質(zhì)結(jié)合蛋白對(duì)其相應(yīng)底物具有很強(qiáng)的親和力和特異性，結(jié)合后會(huì)引發(fā)顯著的構(gòu)象變化。通過融合這些蛋白與熒光蛋白 (Fluorescent protein)，在蛋白特異性結(jié)合過程引起構(gòu)象變化進(jìn)而產(chǎn)生熒光變化，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞或亞細(xì)胞分辨率下的動(dòng)態(tài)代謝變化檢測(cè)與成像 (圖5)。此類型的高靈敏探針已經(jīng)在動(dòng)態(tài)檢測(cè)胞內(nèi)pH、K+、Ca2+、NADH、NAD+/NADH比、NADPH、谷氨酸、NO、ROS、GSSG/GSH比、ATP/ADP比等方面得到應(yīng)用[20]。

未來細(xì)胞內(nèi)生物傳感器的研究工作包括傳感元件、檢測(cè)元件的開發(fā)，微型化與智能化生物傳感器的研究等，從而適應(yīng)于選擇性、靈敏性、穩(wěn)定性更高的應(yīng)用環(huán)境。同時(shí)，為適應(yīng)未來高通量檢測(cè)的需求，將細(xì)胞傳感器技術(shù)和生物芯片技術(shù)結(jié)合開發(fā)細(xì)胞芯片傳感器，即陣列化的細(xì)胞群將細(xì)胞傳感器高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)和生物芯片高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，亦具有廣闊的發(fā)展前景[21]。

圖4 生物過程監(jiān)測(cè)示意圖[14]

圖5 熒光傳感器工作原理示意圖

2.2 大數(shù)據(jù)庫的建立和數(shù)據(jù)深度計(jì)算

自從阿法狗戰(zhàn)勝人類頂級(jí)棋手之后，深度學(xué)習(xí)、人工智能再一次變得火熱起來。然而，更大的數(shù)據(jù)庫并不一定有助于模型學(xué)習(xí)到更深刻的見解。訓(xùn)練數(shù)據(jù)的質(zhì)量是模型性能的主導(dǎo)因素，應(yīng)該重點(diǎn)專注于數(shù)據(jù)的質(zhì)量、價(jià)值以及多樣性，而不僅僅是數(shù)據(jù)的規(guī)模，“深度數(shù)據(jù)” (Deep data) 比大數(shù)據(jù) (Big data) 更具價(jià)值。生物技術(shù)過程中智能控制的發(fā)展在十年前僅被認(rèn)為是令人興奮但又模糊不清的愿景，如今已成為一個(gè)密集而現(xiàn)實(shí)的研究領(lǐng)域。在該領(lǐng)域取得成功的關(guān)鍵之一是選擇合適的軟件工具來構(gòu)建智能系統(tǒng)。理想的工具必須既能反映控制問題的實(shí)時(shí)性，又能反映生物技術(shù)系統(tǒng)本身的特性[22]。

隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，針對(duì)海量數(shù)據(jù)存儲(chǔ)過程中并發(fā)、可用、可擴(kuò)展性等高性能要求，傳統(tǒng)的關(guān)系型數(shù)據(jù)庫已經(jīng)不能應(yīng)對(duì)這些調(diào)整。在選擇數(shù)據(jù)存儲(chǔ)解決方案時(shí)，相比較SQL (關(guān)系型數(shù)據(jù)庫)，NoSQL (非關(guān)系型數(shù)據(jù)庫) 脫穎而出。NoSQL的優(yōu)越性體現(xiàn)在：1) 具有靈活的數(shù)據(jù)模型，可以處理非結(jié)構(gòu)化/半結(jié)構(gòu)化的大數(shù)據(jù)；2) 很容易實(shí)現(xiàn)可伸縮性 (向上擴(kuò)展與水平擴(kuò)展)；3) 數(shù)據(jù)庫支持動(dòng)態(tài)模式；4) 支持自動(dòng)分片；5) 支持自動(dòng)復(fù)制。但是不管選用哪種數(shù)據(jù)存儲(chǔ)方案，大數(shù)據(jù)庫的建立一般會(huì)經(jīng)歷數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)可視化與輸出 (智能決策) 階段。其中，數(shù)據(jù)收集、清理和管理通常占機(jī)器學(xué)習(xí)項(xiàng)目總開發(fā)工作的90%以上。為了更好地為機(jī)器學(xué)習(xí)準(zhǔn)備數(shù)據(jù)集，一般需要做到如下幾點(diǎn)：1) 闡明問題；2) 建立數(shù)據(jù)收集機(jī)制；3) 格式化數(shù)據(jù)；4) 減少數(shù)據(jù)；5) 完成數(shù)據(jù)清理；6) 分解數(shù)據(jù)；7) 重新調(diào)整數(shù)據(jù)；8) 將數(shù)據(jù)分散。其中針對(duì)數(shù)據(jù)信息融合的問題，通過采用主成分分析、因子分析、貝葉斯學(xué)習(xí)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等方法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗、填充和降維，進(jìn)而采用聚類分析、主成分回歸等方法提取特征數(shù)據(jù)信息，從而將多源數(shù)據(jù)在同一層次進(jìn)行融合。圖6概述了生物過程大數(shù)據(jù)相關(guān)分析的數(shù)據(jù)處理。

生物過程研究解決實(shí)際生產(chǎn)問題時(shí)，面對(duì)細(xì)胞內(nèi)高度分支研究的海量數(shù)據(jù)和反應(yīng)器過程中所獲得的各種傳感器數(shù)據(jù)，以及生物過程具有生命系統(tǒng)的復(fù)雜性、時(shí)變性、全局性等特點(diǎn)，遇到極大困難[22]。但是如何在這些紛繁而又混雜的生物過程海量數(shù)據(jù)中找出關(guān)鍵因果關(guān)系，并作出過程優(yōu)化的科學(xué)決策，是一項(xiàng)艱巨、費(fèi)時(shí)的工作[22]。抓住大數(shù)據(jù)時(shí)代發(fā)展機(jī)遇，加速推進(jìn)生物過程智能化，需要將機(jī)器學(xué)習(xí) (Machine learning，ML)應(yīng)用于生物過程大數(shù)據(jù)分析與智能決策。機(jī)器學(xué)習(xí)是一門多領(lǐng)域交叉學(xué)科，涉及概率論、統(tǒng)計(jì)學(xué)、逼近論、凸分析、算法復(fù)雜度理論等多門學(xué)科，其專門研究計(jì)算機(jī)是怎樣模擬或?qū)崿F(xiàn)人類的學(xué)習(xí)行為，以獲取新的知識(shí)或技能，重新組織已有的知識(shí)結(jié)構(gòu)，使之不斷改善自身的性能[24]。

圖6 用于生物過程大數(shù)據(jù)相關(guān)分析的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[23]

2.3 生物過程智能決策

大數(shù)據(jù)時(shí)代的生物過程研究，在實(shí)現(xiàn)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化時(shí)，由于從基因、細(xì)胞到生物反應(yīng)器操作的生物過程高度復(fù)雜性[22]，細(xì)胞內(nèi)外海量組學(xué)數(shù)據(jù)和細(xì)胞外過程傳感器數(shù)據(jù)的智能處理與整合需要實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)人機(jī)交互與智能信息處理。生物過程多參數(shù)相關(guān)分析時(shí)，遵循的一個(gè)重要理念就是不熱衷于尋找因果關(guān)系，注重相關(guān)關(guān)系的發(fā)現(xiàn)和利用，從生物過程的海量數(shù)據(jù)中找到與過程優(yōu)化和放大相關(guān)的關(guān)鍵參數(shù)[23]。

在海量數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析過程中，應(yīng)用有效的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)能夠大大提升數(shù)據(jù)處理的速度，同時(shí)也能夠提升數(shù)據(jù)處理的準(zhǔn)確性[23]。應(yīng)用融合生物過程機(jī)理和工業(yè)生物過程大數(shù)據(jù)的智能建模和分析技術(shù)，能夠綜合數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)和機(jī)理分析兩者的優(yōu)點(diǎn)，從而在挖掘海量數(shù)據(jù)內(nèi)在知識(shí)信息的基礎(chǔ)上，表征機(jī)理特征，降低模型計(jì)算復(fù)雜度，提升模型魯棒性。通過采用軟測(cè)量、模糊聚類、回歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)生物過程機(jī)理模型與數(shù)據(jù)模型深度融合的智能動(dòng)態(tài)模型。通過大數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)計(jì)算系統(tǒng)，調(diào)用復(fù)雜的機(jī)器學(xué)習(xí)、數(shù)據(jù)挖掘、智能推薦等算法，在計(jì)算機(jī)與細(xì)胞之間實(shí)現(xiàn)海量數(shù)據(jù)交互 (學(xué)習(xí)能力、自適應(yīng)能力、糾偏能力)，掀起一場以“智能細(xì)胞工廠”為核心的工業(yè)生物技術(shù)革命，從而開啟行業(yè)智慧應(yīng)用新時(shí)代，搶占科技競爭制高點(diǎn)，提升我國工業(yè)生物過程自動(dòng)化、數(shù)字化和智能化水平，躋身創(chuàng)新型工業(yè)生物技術(shù)強(qiáng)國。

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Progress in intelligent control of industrial bioprocess

Xiwei Tian1,3, Guan Wang1,3, Siliang Zhang1,2,3, and Yingping Zhuang1,2,3

1,,200237,2,200237,3(),200237,

Industrial bioprocess is a complex systematic process and bio-manufacturing can be realized on the basis of understanding the metabolism process of living cells. In this article, the multi-scale optimization principle and practice of industrial fermentation process are reviewed, including multi-scale optimizing theory and equipment, on-line sensing technology for cellular macroscopic metabolism, and correlated analysis of physiological parameters. Furthermore, intelligent control of industrial bioprocess is further addressed, in terms of new sensing technology for intracellular physiological metabolism, big database establishment and data depth calculation, intelligent decision.

industrial bioprocess, on-line sensing technology, physiological metabolism, process big data, intelligent control

10.13345/j.cjb.190240

莊英萍 博士，研究員，博導(dǎo)，現(xiàn)任華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院院長，國家生化工程技術(shù)研究中心 (上海) 主任，“國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863)”生物和醫(yī)藥領(lǐng)域工業(yè)生物技術(shù)主題專家，中國微生物學(xué)會(huì)第十屆理事會(huì)常務(wù)理事，生化過程模型化與控制專業(yè)委員會(huì)主任委員，中國化工學(xué)會(huì)生物化工專業(yè)委員會(huì)副主任委員。長期從事發(fā)酵過程的優(yōu)化與放大研究，與團(tuán)隊(duì)共同建立了完整的理論、方法與裝備，并在數(shù)十個(gè)品種的工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品中成功應(yīng)用。近年獲“國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)”三項(xiàng)，發(fā)表SCI論文100余篇，獲授權(quán)發(fā)明專利近30項(xiàng)。

田錫煒, 王冠, 張嗣良, 等. 工業(yè)生物過程智能控制原理和方法進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(10): 2014–2024.

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June9, 2019;

August 7, 2019

Supported by: Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. 22221817014, WF1814032).

Yingping Zhuang. Tel: +86-21-64251257; Fax: +86-21-64253702; E-mail: ypzhuang@ecust.edu.cn

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(Nos. 22221817014, WF1814032)資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)