基于酶約束的代謝網(wǎng)絡(luò)模型研究進展及其應(yīng)用

趙欣，楊雪，毛志濤，馬紅武

基于酶約束的代謝網(wǎng)絡(luò)模型研究進展及其應(yīng)用

趙欣1,2，楊雪1,2，毛志濤1,2，馬紅武1

1 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物技術(shù)重點實驗室，天津 300308 2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型已經(jīng)成功地應(yīng)用于指導(dǎo)代謝工程改造，但由于傳統(tǒng)通量平衡分析法僅考慮化學(xué)計量學(xué)和反應(yīng)方向約束，模擬得到的是理論最優(yōu)結(jié)果，對一些現(xiàn)象如代謝溢流、底物層級利用等無法準確描述。近年來人們通過在代謝網(wǎng)絡(luò)模型中引入新的蛋白量、熱力學(xué)等約束發(fā)展了新的約束優(yōu)化計算方法，可以更準確真實地模擬細胞在不同條件下的代謝行為。文中主要對近年來提出的多種酶約束模型進行評述，對酶約束引入的基本思路、酶約束的數(shù)學(xué)方程表示及優(yōu)化目標(biāo)設(shè)定、引入酶約束后對代謝通量計算結(jié)果的影響及酶約束模型在代謝工程菌種改造中的應(yīng)用等進行了全面深入的介紹，并提出了已有各種方法存在的主要問題，展望了相關(guān)方法的未來發(fā)展方向。通過引入新的約束，代謝網(wǎng)絡(luò)模型能夠更精確模擬和預(yù)測細胞在環(huán)境和基因擾動下的代謝行為，為代謝工程菌種改造提供更準確可靠的指導(dǎo)。

酶約束，代謝網(wǎng)絡(luò)模型，代謝工程，酶動力學(xué)，熱力學(xué)

基于化學(xué)反應(yīng)計量學(xué)關(guān)系和反應(yīng)可逆性約束的約束優(yōu)化方法，如通量平衡分析(FBA)[1]、通量可變性分析(FVA)[2-3]等，是目前基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型(GEM) 分析最常用的方法[4-5]。通過這些分析方法可以計算滿足特定優(yōu)化目標(biāo)(如最大化細胞生長速率、ATP生成或產(chǎn)物生成速率等)的代謝通量分布，并基于結(jié)果分析基因必需性、確定產(chǎn)物合成最優(yōu)途徑、確定代謝工程改造靶點[6]等。雖然這類方法已經(jīng)比較廣泛地應(yīng)用在指導(dǎo)代謝工程改造中，但在很多情況下菌體生長時都處于一種非最優(yōu)代謝狀態(tài)，因此模擬結(jié)果和實際結(jié)果可能有偏差[7]。而且由FBA等方法預(yù)測細胞生長表型時需首先設(shè)定底物消耗速率才能計算最優(yōu)生長速率，但實際上在實驗測定底物輸入速率時可同時測得生長速率，因此對于菌體生長的模擬，這類模型更適合于擬合實驗結(jié)果而不是進行預(yù)測。除此之外，由于模型中僅考慮計量學(xué)和反應(yīng)方向性約束，而真實細胞中的代謝流分布還受到許多其他因素影響，因此有很多生物學(xué)現(xiàn)象不能通過僅考慮計量學(xué)約束而不考慮其他約束的傳統(tǒng)FBA進行準確模擬預(yù)測，舉例如下。

1) 代謝溢流現(xiàn)象

代謝溢流是在有氧條件下，微生物處于高生長速率或高底物吸收速率時，即使氧供應(yīng)充足仍有發(fā)酵副產(chǎn)物如乙酸、乙醇排出的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象通常出現(xiàn)在單細胞生物當(dāng)中[8]，最常見的為釀酒酵母產(chǎn)乙醇和大腸桿菌生成乙酸，被統(tǒng)稱為Crabtree effect[8-9]。此外，這種現(xiàn)象在某些癌細胞中也有相關(guān)報道，被稱為Warburg effect[10]。盡管代謝溢流現(xiàn)象已經(jīng)被廣泛研究，但傳統(tǒng)的代謝網(wǎng)絡(luò)模型由于僅以生長最大化為目標(biāo)，并不能準確描述這種副產(chǎn)物生成的現(xiàn)象。

2) 微生物在多種碳源上的層級利用現(xiàn)象

細菌在兩種及以上混合碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時會表現(xiàn)出“先后利用” (Diauxie) 和“共利用” (Co-utilization) 的不同代謝行為[11-12]。傳統(tǒng)代謝網(wǎng)絡(luò)約束優(yōu)化方法因需要人為設(shè)定底物消耗速率，無法解釋細胞為何傾向于利用兩種底物中的一種或同時利用。需要考慮新的機理整合新的約束進行模擬。

在復(fù)雜的生物體內(nèi)，細胞代謝受到很多因素的調(diào)控與限制，酶濃度的限制就是其中的一種，即在細胞內(nèi)催化代謝反應(yīng)的酶的總量是有限的，在1 g細胞干重中總蛋白的量一般不超過60%，而催化反應(yīng)的酶又只占總蛋白的一定比例。因此當(dāng)存在酶活很低的酶時，細胞代謝轉(zhuǎn)化的速率就會受到限速酶能達到的最高濃度限制。并且，最近的研究結(jié)果表明，代謝溢流以及底物層級利用現(xiàn)象的發(fā)生與微生物體內(nèi)的酶濃度限制有關(guān)[13-15]?；谶@一考慮，近年來科學(xué)家們開發(fā)了多種方法將細胞內(nèi)酶的約束整合到代謝網(wǎng)絡(luò)模型中，由此對與酶濃度限制相關(guān)的代謝現(xiàn)象進行更準確的模擬和預(yù)測。不同的方法從不同角度，如酶在細胞內(nèi)的空間擁擠度、酶的催化活性、代謝反應(yīng)熱力學(xué)等，對細胞內(nèi)的酶量約束進行數(shù)學(xué)表征，進而通過適當(dāng)?shù)募s束條件或優(yōu)化目標(biāo)求出滿足酶總量約束或者最小化酶成本的代謝通量分布及相應(yīng)酶量分布。這種模型目前已經(jīng)被成功地應(yīng)用到指導(dǎo)菌種代謝工程改造當(dāng)中[16]。

文中將結(jié)合筆者的部分研究結(jié)果，對各種酶約束模型的基本原理、構(gòu)建方法及其在生物學(xué)研究和代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用情況進行詳細介紹。

1 整合動力學(xué)信息對酶濃度水平進行限制

2007年Beg等基于大分子擁擠的原理開發(fā)了FBAwMC (Flux balance analysis with molecular crowding) 的酶約束方法[17]?？紤]到細胞的總體積是有限的，在有限的細胞質(zhì)體積內(nèi)大分子(催化各種反應(yīng)的酶) 的濃度受到物理和空間上的一個限制[18-20]，即在細胞質(zhì)中酶的摩爾體積(v) 與摩爾數(shù)(n)滿足

引入一個擁擠系數(shù)i，其中

對于每一個酶都可以根據(jù)底物濃度、m值、cat值、酶的分子量、酶的質(zhì)量體積和細胞質(zhì)密度這6個參數(shù)求解出擁擠系數(shù)a，它反映了第個酶對總體積擁擠程度的貢獻。但是由于底物濃度和m值等實驗數(shù)據(jù)量有限，因此FBAwMC方法在進行模擬計算時通過使實驗測量值與模擬值之間的方差最小，選取了一個統(tǒng)一的擁擠系數(shù)值=(0.004±0.000 5) h?g/mmol。這種在物理空間水平上對酶濃度進行限制的方法能夠通過求解得到催化每個反應(yīng)的酶所占的空間體積以及每一個酶的濃度信息。

在Beg等開發(fā)出第一個在酶濃度水平上對代謝網(wǎng)絡(luò)模型進行約束的方法后，人們又基于相似思路提出了更多類似模型擴展方法。例如2011年Shlomi等為了研究人類癌細胞中Warburg effect現(xiàn)象產(chǎn)生的原因而開發(fā)的方法[23]，以及其在2012年為了探究微生物的實際生長速率針對開發(fā)的MOMENT (Metabolic modeling with enzyme kinetics)算法[24]，都是在FBAwMC方法的基礎(chǔ)上進行的改良和擴展。與FBAwMC不同的是這兩種方法沒有在空間體積上對酶的濃度進行限制，而是直接為細胞內(nèi)酶的總量施加了濃度上限，使細胞代謝時的總酶需求量不超過該設(shè)定值(，單位g/g DW)。根據(jù)反應(yīng)的最大速率與催化反應(yīng)的酶濃度之間的關(guān)系得到約束方程，

兩種方法在酶約束原理上基本一致，不同的是在計算酶的總濃度時，MOMENT直接將細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)ptot作為酶濃度上限 (中為0.56 g蛋白/g DW[25])，對于微生物來說這顯然是一個偏高的值，因為細胞內(nèi)的蛋白不僅包括催化反應(yīng)的酶還包括一些結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白等。而在對人類癌細胞內(nèi)的Warburg effect現(xiàn)象進行研究時，Shlomi等還基于蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)計算出了模型中催化代謝反應(yīng)的酶占細胞內(nèi)總蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)為0.1 g酶/g蛋白[26]，在此基礎(chǔ)上對細胞內(nèi)的總酶濃度作了進一步限制。兩種方法的共同問題是假定酶均處于底物飽和狀態(tài)，但實際細胞內(nèi)很多酶的底物濃度都未達到飽和濃度，因此這些方法計算得到的酶濃度值都偏低。

2017年，Sánchez等提出GECKO[27]方法成功地構(gòu)建了帶有酶約束的釀酒酵母基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型。與上述提到的兩種方法不同的是，在計算總酶量時考慮到了酶的平均飽和度σ[28-29]的影響(表1)。2019年Massaiu等利用GECKO的方法構(gòu)建出了枯草桿菌的酶約束模型ec_iYO844[16]，該模型中僅運用了17個中心代謝反應(yīng)的cat值，嚴格地講，并不是基因組尺度的酶約束模型，但運用該模型進行與中心代謝途徑相關(guān)的表型預(yù)測時，相對于普通模型iYO844[30]的預(yù)測結(jié)果有了顯著提高。

在上述酶約束模型構(gòu)建時均需要酶的cat值來確定滿足酶約束的最優(yōu)酶濃度分布。目前雖然有很多數(shù)據(jù)庫如BRENDA[31]、SABIO-RK[32]、Metacyc[33]等都已經(jīng)收集了很多酶的相關(guān)動力學(xué)參數(shù)，但是仍有大量酶的cat數(shù)據(jù)缺失，對同一個酶不同文獻報道的結(jié)果也常存在較大差異[34]。因此酶cat值的獲取和可靠性是影響這類模型模擬預(yù)測結(jié)果準確性的關(guān)鍵。最近Palsson課題組針對cat值缺失的問題開發(fā)了一種機器學(xué)習(xí)方法，基于酶結(jié)構(gòu)、通量取樣信息等成功地對cat值進行預(yù)測[35]，為解決這一問題提供了新的思路。

除了對FBAwMC擴展的方法之外，人們還開發(fā)了一些其他將動力學(xué)的相關(guān)信息引入GEM來增加酶約束的方法。例如2010年Yizhak等開發(fā)的IOMA算法[36]整合了代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，通過這些測得數(shù)據(jù)對代謝網(wǎng)絡(luò)模型中部分反應(yīng)的通量進行限制，使實驗測量值與預(yù)測值之間的誤差平方和最小來求得代謝通量分布。它首先從經(jīng)典的米氏方程出發(fā)推導(dǎo)出反應(yīng)通量與代謝物濃度和酶濃度之間的關(guān)系，得到：

其中e表示參考狀態(tài)下的酶濃度，e表示實驗測量的酶濃度。使核心反應(yīng)(可以得到代謝物組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的反應(yīng)) 的模擬通量盡可能與通過公式(8) 計算出來的通量一致，引入一個可變參數(shù)，約束方程變?yōu)椋?/p>

V表示模擬得到的通量，優(yōu)化目標(biāo)是使的誤差平方和最小。

IOMA類似于MOMA[37]的思想，以通量變化最小為優(yōu)化目標(biāo)，可以預(yù)測在不同因素擾動下通量的改變，并且預(yù)測結(jié)果顯著優(yōu)于MOMA。但這種方法依賴大量的實驗數(shù)據(jù)包括代謝物濃度、酶濃度和m值等，對基因組規(guī)模模型應(yīng)用時會因為大量數(shù)據(jù)缺失而無法模擬。

隨著生長速率的變化，另外3個部分的蛋白成本會相應(yīng)調(diào)整以滿足方程(12)的約束，進而引起碳源攝入的再調(diào)整。

與CAFBA原理相似，專門針對的溢流代謝研究開發(fā)的PAT (Proteome allocation theory) 方法[42]將細胞內(nèi)總酶量分為發(fā)酵相關(guān)的酶、呼吸相關(guān)的酶以及用于細胞其他活動的酶這3部分，根據(jù)3部分的總和為1得出約束方程。這個方程只適合專注于對微生物的溢流代謝現(xiàn)象進行分析，在對其他代謝現(xiàn)象分析時存在一定的局限性。

2 整合動力學(xué)與熱力學(xué)信息對酶濃度水平進行限制

前面提到的方法都是從動力學(xué)角度出發(fā)經(jīng)過公式推導(dǎo)得出酶限制的方程，接下來將主要介紹結(jié)合熱力學(xué)和動力學(xué)經(jīng)典公式來對GEM添加酶約束的方法。

最早將熱力學(xué)信息引入GEM的思想是2004年Holzhütter[43]提出的，將熱力學(xué)平衡常數(shù)K作為可逆反應(yīng)通量的權(quán)重因子來求出通量和最小的解。之后就出現(xiàn)了將熱力學(xué)與動力學(xué)信息結(jié)合來對代謝反應(yīng)的酶成本進行表征進而約束代謝網(wǎng)絡(luò)模型的方法。2013年開發(fā)的mTOW (Metabolic tug-of-war)[44]能夠求解出穩(wěn)態(tài)時酶效率最高、總代謝物負載最小的途徑。在估計酶成本時，引入了一個懲罰項，假定需要維持一定反應(yīng)通量的細胞必須通過更高的酶成本來補償較小的熱力學(xué)驅(qū)動力，熱力學(xué)驅(qū)動力越小酶成本就會越高。由可逆速率定律=(+––) (表示催化反應(yīng)的酶濃度，+和–分別表示正向和逆向的反應(yīng)速率)出發(fā)，得到酶成本的函數(shù)關(guān)系(方程14)。當(dāng)反應(yīng)的熱力學(xué)驅(qū)動力小于下限的閾值時，酶成本無窮大；當(dāng)大于一定閾值時，酶成本可以忽略不計；在閾值范圍內(nèi)酶成本是反應(yīng)速率與代謝物濃度的函數(shù)。

代謝物濃度通過以下約束求出，其在滿足經(jīng)驗值[45](17)約束的同時還需使反應(yīng)的吉布斯自由能變化大于閾值。

mTOW可以求解出反應(yīng)的吉布斯自由能變化、代謝物濃度以及酶濃度信息，是第一個不需要利用動力學(xué)模型就可以得到代謝物濃度的方法。在求解上，得到的是代謝物濃度與酶濃度之間的一個折中，它沒有考慮動力學(xué)參數(shù)對酶濃度的影響，因此不需要動力學(xué)參數(shù)的輸入。雖然對酶濃度的估計是一個近似值，但模擬生長在以葡萄糖為碳源的基本鹽培養(yǎng)基上的酶濃度時，預(yù)測結(jié)果與實驗結(jié)果之間仍有比較好的相關(guān)性。

與mTOW同期，F(xiàn)lamholz等[46]提出的方法可以求出反應(yīng)在滿足熱力學(xué)驅(qū)動力為正值下的最小酶成本。類似于mTOW，在求解最小酶成本時，F(xiàn)lamholz的方法限制了熱力學(xué)驅(qū)動力必須為正值，以保證反應(yīng)可以正向進行。在對酶成本進行表征時，首先從米氏方程出發(fā)結(jié)合Haldane關(guān)系推導(dǎo)出一個簡化的適合于任意反應(yīng)的速率方程。在推導(dǎo)時假設(shè)了酶全部與底物結(jié)合，對產(chǎn)物飽和度的影響忽略不計，因此計算得到的酶濃度值偏低。對這個方法進行完善和優(yōu)化以后的ECM方法[47]將cat、代謝物濃度、吉布斯自由能變化、飽和度相關(guān)因素以及與調(diào)控有關(guān)的因素等作為反應(yīng)通量的權(quán)重因子來對酶成本進行評估，這個方法可以自由地選擇將哪些因素考慮到酶成 本的計算當(dāng)中。同樣的，考察的因素越多需要的實 驗參數(shù)就會越多，但結(jié)果就會更加接近于真實情況。

corsoFBA[48]也是求解的FBA解空間下酶成本最小的途徑，通過熱力學(xué)驅(qū)動力來對酶成本進行罰分，驅(qū)動力越大酶成本越小。這種方法可以將熱力學(xué)的限制整合入模型中，計算出途徑的酶成本大小。但它在表征酶成本時，僅定性地考慮了分子量和熱力學(xué)驅(qū)動力這兩個因素的影響，因此計算結(jié)果僅能用于途徑之間酶成本的評價排序，數(shù)值本身并不代表真實的酶用量。各種酶約束模型的約束方程及相關(guān)信息見表1和表2。

表2 縮略語與名稱的對應(yīng)信息

3 酶約束模型在生物表型分析和代謝工程中的應(yīng)用

目前構(gòu)建出來的酶約束模型能夠顯著提高對細胞表型的預(yù)測能力，通過模擬預(yù)測各種生物學(xué)現(xiàn)象揭示微生物代謝策略，在基礎(chǔ)生物學(xué)研究和指導(dǎo)代謝工程改造當(dāng)中得到廣泛的應(yīng)用。

3.1 模擬微生物在單一碳源下的生長情況

Beg等和Adadi等分別利用FBAwMC、MOMENT對在10種和24種不同單一碳源下的最大生長速率進行了預(yù)測，結(jié)果顯示與實驗測量值顯著相關(guān)，其中MOMENT預(yù)測的最大生長速率與實驗測量值的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.47 (值為0.02)[17,24]。通過GECKO方法構(gòu)建的的酶約束模型ecYeast7顯著降低了模型中60%的反應(yīng)的通量可變性，也成功預(yù)測了其在3種不同培養(yǎng)基、12種不同碳源下的最大生長速率，同時還與未考慮酶約束的普通基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型Yeast7的預(yù)測值進行比較，ecYeast7預(yù)測結(jié)果的平均相對偏差僅為8%，而Yeast7預(yù)測值的平均相對偏差高達100%。證明了酶約束模型能夠在不需要人為設(shè)定底物輸入速率的情況下很好地對微生物的最大生長速率進行預(yù)測[27]。

Flamholz等利用酶成本最小化的方法對EMP和ED途徑間的選擇進行分析，揭示了微生物生長是在能量和酶成本之間進行權(quán)衡之后選擇了不同的糖酵解策略。EMP途徑能量產(chǎn)生效率高但酶成本也高，當(dāng)酶成為限制因素時就會切換到能量產(chǎn)生效率低但酶成本也低的ED途徑[46]。

3.2 模擬并研究微生物體內(nèi)的代謝溢流(Overflow) 現(xiàn)象

代謝溢流現(xiàn)象普遍存在于微生物體內(nèi)(圖1)，針對普通基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型不能預(yù)測該現(xiàn)象的問題，Sánchez利用構(gòu)建的ecYeast7模型成功模擬出在無氧和有氧條件時高生長速率和高壓生長狀態(tài)下體內(nèi)產(chǎn)生的Crabtree effect[27]，展示了釀酒酵母體內(nèi)存在的高效率代謝途徑(即經(jīng)過TCA和呼吸鏈產(chǎn)能) 與低效率代謝途徑(即經(jīng)過糖酵解后溢出發(fā)酵產(chǎn)物) 間的切換。但利用普通的Yeast7模型則無法模擬出釀酒酵母體內(nèi)的這種代謝溢流現(xiàn)象。

圖1 不同菌株體內(nèi)存在的代謝溢流現(xiàn)象

Vazquez等利用已經(jīng)開發(fā)出來的FBAwMC方法也解釋了細胞內(nèi)酶濃度的限制是代謝溢流產(chǎn)生的主要原因[49]，與目前對于代謝溢流現(xiàn)象的研究結(jié)論相統(tǒng)一。van Hoek還利用分子擁擠的方法探究了不同微生物采取不同溢流策略的現(xiàn)象(酵母在開始利用低效率的溢流代謝途徑后高效率代謝途徑的比例隨之下降，而大腸桿菌在出現(xiàn)溢流時高效率途徑仍維持較高的水平)，發(fā)現(xiàn)維持氧化還原平衡在微生物途徑調(diào)整策略中發(fā)揮關(guān)鍵作用[50]。

今年Mori等利用CAFBA的方法研究了在生長和酶成本之間進行權(quán)衡之后選擇的呼吸和發(fā)酵兩種代謝行為。通過將攝入的碳源通量分為生成能量的碳和生成生物質(zhì)前體的碳兩部分，證明了ATP合成的效率是微生物在細胞得率和酶成本之間進行權(quán)衡的關(guān)鍵驅(qū)動力[51]。

3.3 探究微生物的底物層級利用情況

Beg等利用FBAwMC評估了酶濃度限制對細胞代謝的作用，檢測了在混合碳源限制培養(yǎng)基中的底物利用情況。FBAwMC模擬結(jié)果顯示在混合碳源下微生物會經(jīng)過首先利用葡萄糖，再同時利用半乳糖、乳酸鹽和麥芽糖，最后利用甘油和乙酸這3個階段[17]，與實驗觀察到的結(jié)果一致。但僅考慮計量學(xué)約束而不考慮其他約束的傳統(tǒng)FBA模擬結(jié)果表示菌體會同時利用所有的碳源，這與實驗結(jié)果不相符。最近湯超研究組也利用粗粒模型對微生物在多碳源下的底物利用策略進行模擬[15]，但與酶約束模型相比粗粒模型并不能給出特定蛋白的濃度。由此可見，基于酶約束的模型可更好地用來研究微生物的底物層級利用情況(圖2)。

圖2 E. coli在23種單一碳源下單位質(zhì)量生物質(zhì)合成需要的酶成本(以核糖作為碳源時的酶成本進行歸一化)

3.4 酶約束模型在代謝工程中的應(yīng)用

除了基礎(chǔ)的生物學(xué)現(xiàn)象和機理研究以外，酶約束模型還能夠成功地進行靶點預(yù)測指導(dǎo)代謝工程改造。Sánchez等利用ecYeast7通過通量控制分析(FCC)[52]的方法找到了釀酒酵母產(chǎn)富馬酸的關(guān)鍵酶作為改造靶點[27]。

Massaiu等通過利用MOMA算法對iYO844和ec_iYO844兩個模型進行單基因和雙基因敲除，來預(yù)測提高多聚谷氨酸產(chǎn)量的靶點基因。兩個模型對于單基因敲除的預(yù)測結(jié)果相一致，雙基因敲除結(jié)果存在差異。后對雙基因敲除靶點的預(yù)測結(jié)果進行驗證，結(jié)果表明，的酶約束模型ec_iYO844預(yù)測的雙基因敲除靶點的敲除能夠明顯提高目標(biāo)產(chǎn)品多聚谷氨酸的產(chǎn)量，而按照傳統(tǒng)的iYO844模型預(yù)測結(jié)果進行的雙基因敲除卻未能達到預(yù)期結(jié)果。進一步證明基于酶約束的模型在指導(dǎo)代謝工程改造中相較于普通模型具有更廣泛的應(yīng)用前景[16]。

雖然目前酶約束模型在指導(dǎo)代謝工程改造中的應(yīng)用實例較少，但其構(gòu)建原理和方法具有很好的生物學(xué)意義及可行性，可以預(yù)見這類模型具備更為精確地指導(dǎo)代謝工程改造的潛力。如根據(jù)催化每一步反應(yīng)所需的酶量來確定限速酶，然后理性選擇過表達或酶改造等實驗策略來優(yōu)化途徑，提高目標(biāo)產(chǎn)品得率。另外，此類模型模擬的理論上非最優(yōu)但更接近于實際的途徑還可用于指導(dǎo)途徑中副產(chǎn)物的去除等，對于工業(yè)生產(chǎn)也具有重要的意義。此外酶約束模型還可以預(yù)測在環(huán)境擾動下(如高溫條件)，細胞內(nèi)發(fā)生的代謝行為變化，進而指導(dǎo)過程控制和菌株優(yōu)化[27]。

4 總結(jié)與展望

本文主要總結(jié)了近年來開發(fā)的各種基于酶約束的代謝網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建方法，這些方法結(jié)合動力學(xué)中的米氏方程或熱力學(xué)第二定律通過引入cat、m、飽和度、eq、吉布斯自由能以及代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)來對反應(yīng)消耗的酶成本進行表征，進而通過適當(dāng)?shù)募s束條件或優(yōu)化目標(biāo)求出滿足酶總量約束或者最小化酶成本的代謝通量分布及相應(yīng)酶量分布等信息。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這種整合了酶約束的代謝網(wǎng)絡(luò)模型在表型預(yù)測上顯著優(yōu)于普通FBA模型，能夠解決目前普通基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型不能解釋的一些生物學(xué)現(xiàn)象，可以提供更準確可靠的代謝工程改造指導(dǎo)。雖然目前這些方法還存在一些不足和可以改進的地方，但其為開發(fā)其他以酶約束為基礎(chǔ)的新的約束方法奠定了堅實的基礎(chǔ)。

首先，在給酶成本添加總濃度限制的方法中，考慮的是整個細胞內(nèi)代謝酶的總量，這個值只適合用于對微生物的生長進行預(yù)測，當(dāng)對某一產(chǎn)品的合成途徑預(yù)測時這往往是一個過高的酶濃度值(因可用于某一特定合成途徑的酶占總蛋白量更小)。對此可以通過將總酶量的限制拆分成對幾個不同功能相關(guān)的酶的量限制來進一步細化，這實際上反映了細胞在基因調(diào)控水平的一種約束。

其次，在同工酶、多功能酶的處理上，目前的優(yōu)化結(jié)果都是傾向于利用其中酶活最高的酶，而在真實細胞中具有不同比酶活的同工酶會在不同條件下表達，對此酶約束模型并不能很好模擬。可以考慮以酶約束模型作為基礎(chǔ)，引入某種形式的調(diào)控約束，通過兩者結(jié)合開發(fā)出能模擬細胞內(nèi)同工酶和多功能酶表達策略的方法，以實現(xiàn)更精確的細胞行為模擬。

最后，這些不同的方法都僅僅是涉及到細胞內(nèi)影響酶成本的部分因素。對相同質(zhì)量的酶可能會因為氨基酸組成不同而具有不同合成成本，如何以酶約束方法為基礎(chǔ)，再將這些氨基酸合成成本的約束因素引入到模型中開發(fā)新的方法，也是這些酶約束模型進一步完善的方向。

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Progress and application of metabolic network model based on enzyme constraints

Xin Zhao1,2, Xue Yang1,2, Zhitao Mao1,2, and Hongwu Ma1

1 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Genome-scale metabolic network models have been successfully applied to guide metabolic engineering. However, the conventional flux balance analysis only considers stoichiometry and reaction direction constraints, and the simulation results cannot accurately describe certain phenomena such as overflow metabolism and diauxie growth on two substrates. Recently, researchers proposed new constraint-based methods to simulate the cellular behavior under different conditions more precisely by introducing new constraints such as limited enzyme content and thermodynamics feasibility. Here we review several enzyme-constrained models, giving a comprehensive introduction on the biological basis and mathematical representation for the enzyme constraint, the optimization function, the impact on the calculated flux distribution and their application in identification of metabolic engineering targets. The main problems in these existing methods and the perspectives on this emerging research field are also discussed. By introducing new constraints, metabolic network models can simulate and predict cellular behavior under various environmental and genetic perturbations more accurately, and thus can provide more reliable guidance to strain engineering.

enzyme constraints, metabolic network model,metabolic engineering, enzyme kinetics, thermodynamics

10.13345/j.cjb.190220

馬紅武 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所“百人計劃”研究員，中科院系統(tǒng)微生物技術(shù)重點實驗室副主任。2001年在天津大學(xué)獲得生物化工博士學(xué)位。后分別在德國和英國從事研究工作。2011年底回國任中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員。主要研究方向包括代謝網(wǎng)絡(luò)分析和途徑設(shè)計、代謝工程、計算生物學(xué)軟件開發(fā)等，在相關(guān)領(lǐng)域取得了在國際上具有重要影響的研究成果，在、等刊物發(fā)表學(xué)術(shù)論文40余篇，SCI引用千余次，2014年獲湯森路透高被引科學(xué)家獎。兼任中國生物工程學(xué)會生物資源專業(yè)委員會副主任委員。

趙欣, 楊雪, 毛志濤, 等. 基于酶約束的代謝網(wǎng)絡(luò)模型研究進展及其應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(10): 1914–1924.

Zhao X, Yang X, Mao ZT, et al. Progress and application of metabolic network model based on enzyme constraints. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1914–1924.

May 29, 2019;

July 15, 2019

Supported by: International Partnership Program of Chinese Academy of Sciences (No. 153D31KYSB20170121), National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFA0900301).

Hongwu Ma. Tel: +86-22-24828735; E-mail: ma_hw@tib.cas.cn

中國科學(xué)院國際合作局對外合作重點項目(No. 153D31KYSB20170121)，科技部重點專項(No. 2018YFA0900301) 資助。

2019-07-23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190722.1442.004.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)