工業(yè)環(huán)境下酶蛋白的催化行為與適應(yīng)性改造研究進(jìn)展

王文豪，聞鵬飛，許孔亮，鄭仁朝，鄭裕國(guó)

工業(yè)環(huán)境下酶蛋白的催化行為與適應(yīng)性改造研究進(jìn)展

王文豪1,2，聞鵬飛1,2，許孔亮1,2，鄭仁朝1,2，鄭裕國(guó)1,2

1 浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 生物有機(jī)合成技術(shù)研究浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310014 2 浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江 杭州 310014

酶在工業(yè)上有著廣泛應(yīng)用和巨大潛力，但工業(yè)生產(chǎn)中高溫、強(qiáng)酸/堿、高鹽、有機(jī)溶劑和高底物濃度等條件仍然制約著酶的大規(guī)模應(yīng)用。為使酶能更好地在工業(yè)環(huán)境下發(fā)揮催化作用，目前的主要策略是對(duì)酶進(jìn)行適應(yīng)性改造(如理性或半理性設(shè)計(jì)、定向進(jìn)化、固定化等)。文中簡(jiǎn)要闡述了酶在工業(yè)環(huán)境下的催化行為以及近年對(duì)其適應(yīng)性改造的研究進(jìn)展，以期為酶的適應(yīng)性改造提供參考。

工業(yè)環(huán)境，酶，生物催化，催化行為，適應(yīng)性改造

隨著人類社會(huì)的發(fā)展，生態(tài)惡化、環(huán)境污染和能源短缺已成為全球范圍內(nèi)不容忽視的重大課題。面對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)制造所帶來(lái)的高污染、高能耗等問(wèn)題，環(huán)境友好的生物制造技術(shù)正引起普遍關(guān)注，成為實(shí)現(xiàn)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的重要突破口[1]。酶是高效的生物催化劑，其反應(yīng)條件溫和，可生物降解以及高度立體、區(qū)域和化學(xué)選擇性等特點(diǎn)在生物制造中具有顯著優(yōu)勢(shì)[2]。工業(yè)酶的使用可減少原料、能源消耗以及廢棄物的排放，具有綠色制造和可持續(xù)發(fā)展的典型特征。目前，酶已在化工、醫(yī)藥、食品、環(huán)保、制革、飼料、造紙和紡織等40多個(gè)行業(yè)廣泛應(yīng)用[3]。

現(xiàn)代生物制造業(yè)正朝著高強(qiáng)度、集約化、柔性化的方向快速發(fā)展，對(duì)反應(yīng)過(guò)程、生產(chǎn)強(qiáng)度和操作柔性等提出了更高要求。具體而言，要求工業(yè)酶具有優(yōu)異的酸堿、溫度、離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑及底物耐受性能，能夠在較寬的過(guò)程參數(shù)下發(fā)揮催化作用。然而，酶催化反應(yīng)有賴于酶分子空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與完整性，酶分子變性或亞基解聚均可導(dǎo)致酶活性喪失。因此，酶如何與工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境匹配，發(fā)揮最大催化潛力，成為亟需破解的瓶頸[4]。研究酶在工業(yè)環(huán)境下的催化行為變化，尋找相應(yīng)的適應(yīng)性改造策略，可為工業(yè)生產(chǎn)提供穩(wěn)定性更高、催化速度更快、耐受性更強(qiáng)的生物催化劑。本文對(duì)工業(yè)環(huán)境下酶蛋白催化行為的改變及其適應(yīng)性改造作簡(jiǎn)要綜述。

1 高溫條件下酶蛋白的催化行為及適應(yīng)性改造

目前大多數(shù)酶都來(lái)源于中溫微生物，其最佳酶活溫度一般為20 ℃到45 ℃。但酶在加工及反應(yīng)過(guò)程中常會(huì)遇到高溫條件，高溫會(huì)破壞酶蛋白中的氫鍵、鹽橋、疏水相互作用和范德華力等非共價(jià)鍵，從而破壞酶空間結(jié)構(gòu)，使其從折疊狀態(tài)變?yōu)檎归_(kāi)狀態(tài)，酶活力降低，甚至失活[5]。因此，研究酶蛋白在高溫條件下的催化行為，并對(duì)其進(jìn)行適應(yīng)性改造具有重要意義。

在分子水平上解釋蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性或不穩(wěn)定性是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，并且預(yù)測(cè)導(dǎo)致熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的突變位點(diǎn)也很困難。大量研究表明，只有極少數(shù)序列的變化會(huì)顯著影響酶蛋白的熱穩(wěn)定性[6-9]。能夠提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的突變通常聚集在特定的區(qū)域(如蛋白質(zhì)開(kāi)始展開(kāi)的位置)，在其他區(qū)域引入類似的突變對(duì)酶蛋白熱穩(wěn)定性的影響不明 顯[10]。當(dāng)突變位點(diǎn)位于動(dòng)力學(xué)控制的展開(kāi)區(qū)域中時(shí)，局部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的提高可以改善蛋白質(zhì)的整體穩(wěn)定性[8]。然而，酶蛋白展開(kāi)的途徑通常是未知的，B因子-擬合法可通過(guò)酶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)信息識(shí)別目標(biāo)位置，預(yù)測(cè)對(duì)熱穩(wěn)定性有影響的氨基酸位點(diǎn)[11]。高度靈活的殘基在高溫環(huán)境中會(huì)優(yōu)先展開(kāi)，選擇B因子最高的殘基進(jìn)行突變，在這些位點(diǎn)上進(jìn)行替換會(huì)有更多的機(jī)會(huì)獲得正突變，并進(jìn)一步穩(wěn)定蛋白的折疊狀態(tài)。

目前，可以從兩個(gè)方面來(lái)增加蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。一是通過(guò)增加有利的相互作用或減少不利的相互作用，穩(wěn)定折疊狀態(tài)；二是通過(guò)降低展開(kāi)鏈的熵，破壞未折疊狀態(tài)下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[12]。在大多數(shù)情況下，引入更多二硫鍵、氫鍵、疏水相互作用等分子間相互作用，會(huì)使折疊起來(lái)的空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[13-15]，同時(shí)(β/α)8-barrel折疊、表面電荷、短螺旋、鹽橋也會(huì)使酶在高溫下的構(gòu)象變得更加穩(wěn)定[16-18]。由此出發(fā)，對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析比對(duì)從而進(jìn)行理性或者半理性的設(shè)計(jì)是提高工業(yè)酶熱穩(wěn)定性的一種有效策略(表1)。

Letian等[19]通過(guò)半理性設(shè)計(jì)提高了黑曲霉GH10木聚糖酶Xyn10A_ASPNG的熱穩(wěn)定性；他們首先通過(guò)計(jì)算分析確定了影響酶熱穩(wěn)定性的5個(gè)重要?dú)埢?，隨后通過(guò)輪次迭代飽和突變(ISM) 進(jìn)行隨機(jī)突變，獲得五重突變體4S1 (R25W/V29A/I31L/L43F/T58I)。與野生型相比，突變體4S1在60 ℃時(shí)的半衰期(1/2) 延長(zhǎng)了30倍(圖1A)，解鏈溫度(m) 增加了17.4 ℃ (圖1B)。同時(shí)，其在65 ℃加熱15 min后仍能保持30%的初始酶活(野生型酶加熱2 min后完全失活)。進(jìn)一步分析表明，4S1中的每一個(gè)突變都有助于提高酶的熱穩(wěn)定性，5種突變的協(xié)同效應(yīng)導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性的顯著改善。4S1與野生酶的結(jié)構(gòu)分析及比對(duì)表明，N-末端之間以及N-和C-末端之間的疏水相互作用導(dǎo)致的N-末端卷曲，是其熱穩(wěn)定性提高的主要原因(圖1C–D)。

Liu等[20]通過(guò)定點(diǎn)和組合突變提高納豆激酶(NK) 的熱穩(wěn)定性，在篩選得到11種突變體后，選擇4種突變體進(jìn)一步構(gòu)建多點(diǎn)突變體。最后得到熱穩(wěn)定性最高的突變體QSN，在55 ℃反應(yīng)50 min，仍有40%的活性殘余，而野生型NK完全失活。突變體的1/2為 (33.37±0.27) min，是野生型的3倍。

表1 近年來(lái)增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性的例子

圖1 突變體4S1的熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)示意圖[19].以t1/2 60 ℃ (A) 和Tm (B) 來(lái)評(píng)價(jià)熱穩(wěn)定性(A、B、C和D分別對(duì)應(yīng)于在25、29/31、43和58位點(diǎn)進(jìn)行的隨機(jī)飽和突變).(C)基于Swiss-mode的突變體4S1三級(jí)結(jié)構(gòu)以及有益殘基Ala-29、Leu-31、Phe-43和Ile-58分別在N末端卷曲、螺旋α0、鏈β1和螺旋α1的位置. (D)與Leu-31、Phe-43和Ile-58發(fā)生疏水相互作用的氨基酸殘基示意圖. 此圖已獲John Wiley and Sons授權(quán).

Sun等[21]使用共價(jià)有機(jī)骨架(COFs) 固定洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶PS從而顯著提高其熱穩(wěn)定性。在120 ℃高溫條件下反應(yīng)1 h (苯甲腈為溶劑)，游離酶完全喪失活性，而固定化酶仍保留48%的活性(以轉(zhuǎn)化率計(jì))。這是由于載體增強(qiáng)了酶的剛性，有利于維持蛋白結(jié)構(gòu)的折疊狀態(tài)，防止酶在高溫下發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而提高了其熱穩(wěn)定性。

2 強(qiáng)酸/堿條件下酶蛋白的催化行為及適應(yīng)性改造

酶是兩性生物大分子，具有大量羧基和氨基等酸/堿性基團(tuán)。酶蛋白只有在最佳pH條件下才能發(fā)揮最大的催化活性。然而，工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中存在的強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件會(huì)改變底物分子和酶分子的解離狀態(tài)，從而影響酶和底物的結(jié)合，導(dǎo)致酶活降低，甚至?xí)茐拿傅慕Y(jié)構(gòu)，使其無(wú)法滿足工業(yè)需求，因此需要對(duì)酶進(jìn)行適應(yīng)性改造(表2)。

pH穩(wěn)定性是一種重要的酶學(xué)特性，與蛋白質(zhì)折疊、化學(xué)物質(zhì)干擾和翻譯后修飾(PTMs) 等因素密切相關(guān)[22]。其中PTMs發(fā)生在氨基酸側(cè)鏈或末端，可通過(guò)引入新的官能團(tuán)來(lái)提高其pH穩(wěn)定性，例如磷酸鹽(磷酸化)、乙酸鹽(?；?、酰胺基團(tuán)(酰胺化)、甲基(甲基化) 或碳水化合物分子(糖基化) 等[23]。Wei等[24]在畢赤酵母GS115中表達(dá)了一種新鑒定的β-葡萄糖苷酶(GH3，Bgl3A)，但Bgl3A的pH穩(wěn)定性范圍較窄(4.0–5.0)，限制了其工業(yè)應(yīng)用；他們通過(guò)對(duì)3個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)(Asn23、Asn207和Asn278) 和9個(gè)O-糖基化位點(diǎn)(殘基313、417–421、424、425和429) 進(jìn)行定點(diǎn)突變，篩選得到去除了潛在O-糖基化位點(diǎn)的兩個(gè)突變體，使其在較寬的pH范圍內(nèi)(3.0–10.0) 均比較穩(wěn)定。分析表明，O-糖基化是導(dǎo)致pH作用范圍變窄的主要原因，從整體上看過(guò)量的O-糖基化對(duì)β-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性具有負(fù)效應(yīng)。

Fushinobu等提出酶催化位點(diǎn)附近的殘基會(huì)影響催化殘基的pKa值，進(jìn)而影響酶的pH穩(wěn)定性[25]。因此，以酸性氨基酸取代堿基殘基是提高酶耐酸性的基本策略。Chen等[26]從瘤胃真菌培養(yǎng)物中克隆了糖基水解酶家族11木聚糖酶XynR8，并在大腸桿菌中表達(dá)獲得低分子量的木聚糖酶。該酶在堿性條件下與氫鍵結(jié)合的殘基為天冬酰胺，在酸性條件下起作用的殘基則是天冬氨酸(酸性氨基酸)[27]?；诜肿咏?，將位于催化裂縫邊緣的環(huán)-β-鏈區(qū)域內(nèi)穩(wěn)定XynR8結(jié)構(gòu)的重要?dú)埢鵑41和N58突變?yōu)樘於彼?，突變體在pH 2.0下顯示出比野生型更好的耐酸性。Yang等[28]也通過(guò)將催化結(jié)構(gòu)域上的4個(gè)堿基組氨酸殘基His222、His275、His293和His310替換為天冬氨酸，突變后α-淀粉酶在酸性條件下的穩(wěn)定性和催化活性均明顯提高。

除此之外，氫鍵、鹽橋、β-折疊以及暴露于溶劑中的帶電殘基也會(huì)對(duì)酶的pH穩(wěn)定性造成影響。Saez-Jimenez等[29]通過(guò)定向進(jìn)化對(duì)多功能過(guò)氧化物酶(VP) 進(jìn)行適應(yīng)性改造，提高了低pH條件下的穩(wěn)定性。基于VP晶體結(jié)構(gòu)及與高pH穩(wěn)定錳過(guò)氧化物酶(MnP4) 的比較分析，通過(guò)定向改造將形成氫鍵、鹽橋等相互作用的8個(gè)氨基酸殘基和7個(gè)表面堿性殘基引入VP中，使酸性和中性pH下的血紅素口袋穩(wěn)定。VP突變體在pH 3.5條件下保持24 h后，仍具有初始酶活61%的活力，而天然酶在同等條件下幾乎完全失活。

Beloqui等[30]將單酶在納米凝膠中(SENs) 進(jìn)行包埋提高了酶的pH穩(wěn)定性。與之前兩步丙烯?；姆椒ú煌?圖2A)，該工作以蔗糖(5%/) 為包埋啟動(dòng)子，然后使用丙烯酰胺、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺一步形成納米凝膠。此方法可以通過(guò)調(diào)整反應(yīng)參數(shù)來(lái)精細(xì)調(diào)節(jié)水凝膠層的厚度。以黑曲霉葡萄糖氧化酶(GOx) 作為模型酶，固定化得到酶-凝膠復(fù)合物(GOx_SENs)。研究結(jié)果表明，殼厚度會(huì)強(qiáng)烈影響酶的活性和穩(wěn)定性，水凝膠層越厚，酶的穩(wěn)定性越好(圖2B)，但相應(yīng)地酶活越低(圖2C)。固定化后形成的水凝膠層，使酶的構(gòu)象更加穩(wěn)定，從而導(dǎo)致寬的pH耐受性。厚度為0.8 nm的GOx_SENs11在pH 3.0–9.0范圍內(nèi)維持著幾乎恒定的高活性(圖2D)。

表2 近年來(lái)增強(qiáng)酶pH穩(wěn)定性的例子

圖2 通過(guò)納米凝膠包埋提高酶的pH穩(wěn)定性[30].(A) SEN的合成方案示意圖.(B) 聚丙烯酰胺層厚度和孔隙率對(duì)SEN活性和穩(wěn)定性的影響. (C) kcat,SEN/kcat,enzyme與凝膠厚度的關(guān)系(根據(jù)9種不同蛋白的測(cè)量數(shù)據(jù)). (D)在不同pH值范圍(從3.0到9.0) 下GOx_SENs的相對(duì)活性曲線，其中GOx_SEN8的[AAm]/[MBAAm]比值為6︰1 (殼厚度為3.2 nm)，GOx_SEN11的比值為2︰1 (0.8 nm). 此圖已獲The Royal Society of Chemistry授權(quán).

3 高鹽條件下酶蛋白的催化行為及適應(yīng)性改造

對(duì)于大多數(shù)酶而言，只有在一定的鹽度范圍內(nèi)才具有催化活性，超出這些范圍會(huì)導(dǎo)致蛋白酶的快速變性與失活。在高鹽環(huán)境中，高濃度鹽離子會(huì)干擾氨基酸殘基之間的靜電相互作用，使蛋白質(zhì)表面必需水分子層減少并導(dǎo)致其疏水相互作用增加，酶蛋白會(huì)因此聚集并發(fā)生變性[31]。但是，從高鹽環(huán)境微生物中分離得到的嗜鹽酶嚴(yán)格依賴體系中一定的鹽離子濃度，可以在高鹽環(huán)境中維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在鹵水、離子液體、離子洗滌劑等高鹽工業(yè)環(huán)境中穩(wěn)定存在，并展現(xiàn)出良好的催化活性[32]。

通過(guò)對(duì)嗜鹽酶蛋白和非嗜鹽酶蛋白的結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，嗜鹽酶的特點(diǎn)在于鹽橋和氫鍵明顯增多，含有一些特殊的鹽離子結(jié)合位點(diǎn)并且常以低聚體的形式存在，表面酸性氨基酸含量明顯增多。嗜鹽酶蛋白在高鹽環(huán)境中更加穩(wěn)定，這是因?yàn)椋?) 蛋白質(zhì)由于羧基的水合而具有負(fù)電荷，負(fù)電荷會(huì)被高鹽屏蔽，阻止了蛋白質(zhì)的展開(kāi)；2) 酸性氨基酸提供了帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)表面，并且酸性殘基位于蛋白質(zhì)表面會(huì)參與形成較強(qiáng)水化殼層，從而維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定；3) 嗜鹽蛋白只含有少量非極性氨基酸，如半胱氨酸、異亮氨酸、賴氨酸等，這一特征也對(duì)蛋白的嗜鹽性有一定影響；4) 蛋白質(zhì)需要“水合球”來(lái)抵抗蛋白質(zhì)聚集體的形成[33]，因此，其表面含有較少的疏水氨基酸和更多的親水氨基酸[34-35]。這些研究結(jié)果給工業(yè)酶嗜鹽性的適應(yīng)性改造提供一定的指導(dǎo)，為開(kāi)發(fā)高嗜鹽性的工業(yè)酶指明了方向(表3)。

從天然嗜鹽微生物中克隆獲得編碼基因，并進(jìn)行異源表達(dá)是目前獲得高嗜鹽性酶的主要方法。Zhang等[36]從地衣芽胞桿菌中克隆獲得了一種冷適應(yīng)、堿穩(wěn)定和高鹽耐受性的酯酶(Est700)，該酶可被3.5 mol/L NaCl高度激活，并在5 mol/L NaCl中維持良好的穩(wěn)定性，基本無(wú)活性損失。Gao等[37]從嗜鹽古生菌中獲得了一種耐堿嗜鹽的蛋白酶，具有一定的堿穩(wěn)定性(pH 7.0–10.0)，并在較寬的鹽度范圍內(nèi)(0–3 mol/L NaCl) 中表現(xiàn)出催化能力。另外，為進(jìn)一步提高天然嗜鹽酶的催化活性，可采取理性設(shè)計(jì)方法對(duì)天然嗜鹽酶進(jìn)行改造。

另外，為進(jìn)一步提高天然嗜鹽酶的催化活性，可采取理性設(shè)計(jì)方法對(duì)天然嗜鹽酶進(jìn)行改造。Andrew等[38]對(duì)碳酸酐酶Ⅱ進(jìn)行三步合理設(shè)計(jì)，共取代了18個(gè)表面殘基，表面電荷發(fā)生了變化(圖3A–D)。與野生型相比，設(shè)計(jì)得到的突變體(M1–M4) 的催化活性和熱展開(kāi)溫度在高鹽濃度下均有所提高(圖3E–F)。分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算表明，酶蛋白表面酸性氨基酸殘基與陽(yáng)離子形成的互補(bǔ)性螯合作用，以及由陽(yáng)離子組成的高度有序的水化層作用是導(dǎo)致其嗜鹽性形成的主要原因。

Wang等[39]通過(guò)定點(diǎn)突變提高了膽堿-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(CCT) 的嗜鹽性?；贑CT三維結(jié)構(gòu)模型，通過(guò)增加蛋白質(zhì)表面酸性氨基酸的數(shù)量，減輕高乙酸鹽濃度下的疏水效應(yīng)，并對(duì)蛋白質(zhì)表面變化最大的殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變。獲得的突變體在高鹽條件下顯示出良好的耐受能力，特別是當(dāng)鹽濃度(乙酸鹽) 超過(guò)1 200 mmol/L時(shí)仍保持較高的反應(yīng)速率，比野生型CCT的反應(yīng)速率高了2.2倍。Zheng等[40]也通過(guò)在蛋白質(zhì)表面替換3–10個(gè)酸性氨基酸殘基，減輕了高乙酸鹽濃度下的疏水效應(yīng)，提高了膽堿激酶(CKI) 在高鹽濃度下的催化活性和IC50值(活性抑制50%)。

表3 近年來(lái)增強(qiáng)酶的鹽耐受性的例子

圖3 碳酸酐酶Ⅱ的表面電荷分布圖及其在高鹽條件下的活性[38]. (A–D) 為WT和M4中表面電荷的分布圖(藍(lán)色代表正電荷，紅色帶代表負(fù)電荷). (E–F)不同酶在分別在不同濃度Na2SO4溶液(E) 和NaCl溶液(F) 中的活性與對(duì)照組的活性百分比. 此圖已獲Springer Nature授權(quán).

4 有機(jī)溶劑中酶蛋白的催化行為及適應(yīng)性改造

有機(jī)相生物催化具有增加非極性底物溶解度、進(jìn)行逆水解反應(yīng)、抑制水依賴性副反應(yīng)和利于酶與產(chǎn)品分離等優(yōu)勢(shì)，因此，有機(jī)溶劑中的酶促反應(yīng)在工業(yè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，由于酶在有機(jī)溶劑中的活性較低且不穩(wěn)定，蛋白酶在工業(yè)有機(jī)介質(zhì)中的應(yīng)用能力受到限制，需對(duì)酶進(jìn)行適應(yīng)性改造(表4)。引起酶蛋白在有機(jī)相中活力下降及穩(wěn)定性降低的原因較多[2,17]，包括：酶三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子疏水核心的破壞；在水-有機(jī)溶劑兩相體系中，酶蛋白分子與介質(zhì)接觸的界面處存在著大量的有機(jī)液體，使跨越兩相界面的傳質(zhì)速率大幅度降低而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的靜電、疏水相互作用和氫鍵作用力不穩(wěn)定，進(jìn)一步導(dǎo)致酶的不可逆變性。一般認(rèn)為，完全脫水的蛋白質(zhì)是無(wú)活性的，酶在有機(jī)溶劑中能保持活性和穩(wěn)定性，與蛋白質(zhì)分子和水分子的結(jié)合密不可分。作為潤(rùn)滑劑的水可促進(jìn)酶催化所需的構(gòu)象變化，使酶的穩(wěn)定性提高[41]。

Mohtashami等[42]使用洋蔥伯克霍爾德氏菌脂肪酶(BCL，PDB ID: 3lip) 和變色栓菌漆酶(TVL，PDB ID: 1gyc) 進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，其中BCL屬于α/β水解酶折疊，β鏈形成酶的活性中心，而TVL是一種含3個(gè)結(jié)構(gòu)域的單亞基酶。研究發(fā)現(xiàn)，相比之下TVL在甲醇溶液中的耐受度更好。另外，結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，有機(jī)溶劑與水相中BCL的構(gòu)象發(fā)生了變化，導(dǎo)致其穩(wěn)定性及酶活性的降低。構(gòu)象變化是酶在有機(jī)溶劑存在下失活的最常見(jiàn)原因，特別是能夠滲透到酶活性位點(diǎn)的親水性溶劑能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[43]。

獲得在有機(jī)介質(zhì)中穩(wěn)定的酶的策略可分為3大類：分離可在極端條件下起作用的新酶；修飾酶結(jié)構(gòu)以增加其對(duì)有機(jī)溶劑的抗性；改變?nèi)軇┉h(huán)境以降低其對(duì)酶的變性作用。

提高酶在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性最簡(jiǎn)單的方法是酶固定化。Ruiz等[44]通過(guò)將變色栓菌漆酶吸附在玻璃、玻璃粉、硅膠等載體上，觀察到漆酶在乙醚和乙酸乙酯中的活性和穩(wěn)定性得到顯著改善，而游離酶在這些溶劑中沒(méi)有活性。同樣，Liu等[45]開(kāi)發(fā)出能夠在有機(jī)溶劑中固定漆酶的膜，將漆酶與膜結(jié)合得到酶膜反應(yīng)器(EMRs)。該研究中，漆酶通過(guò)共價(jià)鍵固定在有機(jī)溶劑抗性羥基化聚酮(PK-OH) 膜上，酮基團(tuán)通過(guò)氫鍵的方式促進(jìn)了酶與膜的固定。在均相含水有機(jī)溶劑中，固定化漆酶對(duì)2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 的活性較游離酶提高了2.5倍，并且能夠儲(chǔ)存40 d，重復(fù)使用10次和連續(xù)反應(yīng)50 h后保持其活性。Zheng等[46]首次將酰胺酶固定在磁性多級(jí)孔金屬有機(jī)框架材料(MOF) 中，該固定化酰胺酶顯示出了優(yōu)異的有機(jī)耐受性以及催化活性，固定化酰胺酶相互作用力以及結(jié)構(gòu)剛性的增強(qiáng)使其在各有機(jī)溶劑(如乙醇、甲醇和DMSO) 中孵育24 h后仍能保持50%以上的原始活性，而游離酶活性損失超過(guò)80%。另外，通過(guò)突變改變蛋白質(zhì)一級(jí)序列也能夠提高酶蛋白在有機(jī)介質(zhì)中的催化穩(wěn)定性。Batra等[47]使用隨機(jī)與定點(diǎn)突變結(jié)合的方法開(kāi)發(fā)了畢赤酵母有機(jī)耐受性β-葡萄糖苷酶Ι (BGLI)，改造后編碼基因有3個(gè)有益突變，即G414D、Y722H和N789D (圖4)。其中兩個(gè)突變(Y722H和N789D) 位于酶表面，一個(gè)(G414D) 位于亞表面。突變殘基之間的氫鍵數(shù)和離子相互作用增加，使酶的穩(wěn)定性和對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性提高。Zhou等[48]通過(guò)表面電荷工程修飾改變枯草芽胞桿菌脂肪酶A蛋白分子表面所帶電荷。高度帶負(fù)電的突變酶在高濃度離子液體中顯示出較強(qiáng)的穩(wěn)定性，因?yàn)楸砻尕?fù)電荷的引入可以誘導(dǎo)酶蛋白從β折疊向α螺旋的轉(zhuǎn)變，提高在有機(jī)溶劑中的耐受性。

表4 近年來(lái)增強(qiáng)酶有機(jī)溶劑耐受性的例子

圖4 β-葡萄糖苷酶Ι的結(jié)構(gòu)模型及其有機(jī)溶劑耐受性[47]. (A) OT-BGLI的模型結(jié)構(gòu)，推定的活性位點(diǎn)殘基(D227和E592) 和突變的殘基(D414，Y722和D789)在各位置標(biāo)記，催化殘基的活性位點(diǎn)用箭頭標(biāo)記. (B) OT-BGLI和WT-GBLI在不同有機(jī)溶劑中處理3 h后的殘余活性，二甲基亞砜、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺和四氫呋喃濃度為30%，2-丙醇濃度為20%，甲苯濃度為15% (以體積比計(jì)). 此圖已獲Elsevier授權(quán).

5 高底物濃度條件下酶蛋白的催化行為及適應(yīng)性改造

在高強(qiáng)度工業(yè)生產(chǎn)中，往往要求較高的底物濃度，從而對(duì)酶產(chǎn)生特異或非特異性抑制。在高濃度底物條件下，酶會(huì)與底物結(jié)合形成酶-底物復(fù)合物，酶分子活性中心被底物覆蓋使酶無(wú)法繼續(xù)催化反應(yīng)，需對(duì)酶蛋白進(jìn)行適應(yīng)性改造(表5)。

由于底物對(duì)酶的抑制作用機(jī)理因酶與底物的不同而有所差異，以下以2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA) 的底物抑制機(jī)理為主探討酶在高濃度底物下的催化行為。DERA的應(yīng)用受到對(duì)高濃度乙醛(其天然底物) 耐受性差的阻礙。Markus等[49]提出了DERA在高濃度乙醛中失活的機(jī)理是由于兩分子乙醛醛縮反應(yīng)后生成的巴豆醛與蛋白質(zhì)內(nèi)的賴氨酸殘基形成席夫堿，共價(jià)連接到附近的半胱氨酸殘基，從而阻斷DERA活性中心。為了證明機(jī)理的準(zhǔn)確性，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)將半胱氨酸替換成甲硫氨酸，新突變體能夠?qū)σ胰┊a(chǎn)生良好的抗性(圖5)。類似的底物抑制機(jī)理診斷機(jī)制和預(yù)防策略也適用于其他生物催化劑，即需要對(duì)酶改造以適應(yīng)高底物濃度時(shí)，可以通過(guò)質(zhì)譜、NMR和X射線晶體分析等方法的單獨(dú)或組合使用，揭示底物與蛋白質(zhì)的作用機(jī)制，進(jìn)一步通過(guò)合理設(shè)計(jì)改善酶在高濃度底物下的穩(wěn)定性。例如Cao等[50]通過(guò)截短DERA C-末端19個(gè)氨基酸提高對(duì)底物磷酸酯部分的識(shí)別靈活性，提高了對(duì)底物磷酸酯的耐受性。

表5 近年來(lái)增強(qiáng)酶底物耐受性的例子

圖5 DERA的晶體結(jié)構(gòu)及其底物耐受性[49].(A) 大腸桿菌DERA的晶體結(jié)構(gòu). (B) DERA的催化中心(用方框標(biāo)出的部分)，氨基酸側(cè)鏈和底物的共價(jià)結(jié)合以球-棒模式展示(藍(lán)色為氮，紅色為氧，綠色為硫，淺灰色和黃色為碳). (C)野生型DERA與突變體C47M在不同乙醛濃度下的活性. 此圖已獲The Royal Society of Chemistry授權(quán).

使用上述策略改造酶提高底物耐受性的例子還有很多，如轉(zhuǎn)氨酶催化前體酮生成手性胺制備西他列汀。Codexis和Merck公司的科學(xué)家[51-52]使用計(jì)算機(jī)輔助活性位點(diǎn)設(shè)計(jì)和定點(diǎn)飽和突變，得到含有27個(gè)突變位點(diǎn)的突變體。在預(yù)測(cè)能夠與底物相互作用的17種非催化必需氨基酸中，10種被突變，突變體能在50%的DMSO中將100 g/L底物轉(zhuǎn)化為西他列汀。

6 總結(jié)與展望

生物催化技術(shù)誕生百余年來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的酶多達(dá)3 000余種，但商品酶只有200種左右，而工業(yè)上應(yīng)用的酶僅有50多種，至于大量工業(yè)生產(chǎn)的酶只有10多種。目前，生物催化正處于以體外進(jìn)化為標(biāo)志的第三次浪潮，酶改造的進(jìn)程大幅加快?？梢灶A(yù)見(jiàn)，隨著人工智能的迅速發(fā)展，酶的設(shè)計(jì)與合成將更為快速、理性、精準(zhǔn)，酶催化功能改善的幅度和范圍將進(jìn)一步拓展。工業(yè)酶的使用將迎來(lái)新的浪潮，其綠色與可持續(xù)的特征將進(jìn)一步凸顯。

結(jié)合筆者在工業(yè)酶催化行為與適應(yīng)性改造方面的研究實(shí)踐，近期應(yīng)著重在以下方面取得突破：1) 利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息和不斷進(jìn)步的計(jì)算工具，對(duì)影響酶穩(wěn)定性的機(jī)理進(jìn)行深入探究，以期加強(qiáng)工業(yè)酶適應(yīng)性改造的設(shè)計(jì)性和可預(yù)測(cè)性；2) 加強(qiáng)產(chǎn)學(xué)研用的合作，了解工業(yè)環(huán)境對(duì)酶性能的需求，破解酶在工業(yè)應(yīng)用中的瓶頸；3) 加快酶的商品化速度，提高可及性，使品種豐富的酶像普通商品化試劑一樣易于獲得。

[1] Schmid A, Dordick JS, Hauer B, et al. Industrial biocatalysis today and tomorrow. Nature, 2001, 409(6817): 258–268.

[2] Luetz S, Giver L, Lalonde J. Engineered enzymes for chemical production. Biotechnol Bioeng, 2010, 101(4): 647–653.

[3] Zhang YF, Ge J, Zheng L. Enhanced activity of immobilized or chemically modified enzymes. ACS Catal, 2015, 5(8): 4503–4513.

[4] Lee JW, Na D, Park JM, et al. Systems metabolic engineering of microorganisms for natural and non-natural chemicals. Nat Chem Biol, 2012, 8(6): 536–546.

[5] Atalah J, Cáceres-Moreno P, Espina G, et al. Thermophiles and the applications of their enzymes as new biocatalysts. Bioresour Technol, 2019, 280: 478–488.

[6] Eijsink VGH, G?seidnes S, Borchert TV, et al. Directed evolution of enzyme stability. Biomol Eng, 2005, 22(1/3): 21–30.

[7] Bommarius AS, Broering JM. Established and novel tools to investigate biocatalyst stability. Biocatal Biotransformat, 2005, 23(3/4): 125–139.

[8] Wijma HJ, Floor RJ, Janssen DB. Structure- and sequence-analysis inspired engineering of proteins for enhanced thermostability. Curr Opin Struct Biol, 2013, 23(4): 588–594.

[9] Bommarius AS, Paye MF. Stabilizing biocatalysts. Chem Soc Rev, 2013, 42(15): 6534–6565.

[10] Eijsink VGH, Bj?rk A, G?seidnes S, et al. Rational engineering of enzyme stability. J Biotechnol, 2004, 113(1/3): 105–120.

[11] Reetz MT, Carballeira JD, Vogel A. Iterative saturation mutagenesis on the basis of B factors as a strategy for increasing protein thermostability. Angewand Chem Int Ed, 2006, 45(46): 7745–7751.

[12] Sun ZT, Liu Q, Qu G, et al. Utility of B-factors in protein science: Interpreting rigidity, flexibility, and internal motion and engineering thermostability. Chem Rev, 2019, 119(3): 1626–1665.

[13] Li WF, Zhou XX, Lu P. Structural features of thermozymes. Biotechnol Adv, 2005, 23(4): 271–281.

[14] Rakotoarivonina H, Hermant B, Aubry N, et al. Engineering the hydrophobic residues of a GH11 xylanase impacts its adsorption onto lignin and its thermostability. Enzyme Microb Technol, 2015, 81: 47–55.

[15] Wang YW, Fu Z, Huang HQ, et al. Improved thermal performance of Thermomyces lanuginosus GH11 xylanase by engineering of an n-terminal disulfide bridge. Bioresour Technol, 2012, 112(5): 275–279.

[16] Alponti JS, Maldonado RF, Ward RJ. Thermostabilization of Bacillus subtilis GH11 xylanase by surface charge engineering. Int J Biol Macromol, 2016, 87: 522–528.

[17] Careri G. Cooperative charge fluctuations by migrating protons in globular proteins. Progr Biophys Mol Biol, 1998, 70(3): 223–249.

[18] Schütte M, Fetzner S. EstA from Arthrobacter nitroguajacolicus Rü61a, a thermo- and solvent-tolerant carboxylesterase related to class C β-lactamases. Curr Microbiol, 2007, 54(3): 230–236.

[19] Song LT, Tsang A, Sylvestre M. Engineering a thermostable fungal GH10 xylanase, importance of N-terminal amino acids. Biotechnol Bioeng, 2015, 112(6): 1081–1091.

[20] Liu ZM, Zhao H, Han LC, et al. Improvement of the acid resistance, catalytic efficiency, and thermostability of nattokinase by multisite-directed mutagenesis. Biotechnol Bioeng, 2019, 116(8): 1833–1843.

[21] Sun Q, Fu CW, Aguila B, et al. Pore environment control and enhanced performance of enzymes infiltrated in covalent organic frameworks. J Am Chem Soc, 2018, 140(3): 984–992.

[22] Jung SK, Parisutham V, Jeong SH, et al. Heterologous expression of plant cell wall degrading enzymes for effective production of cellulosic biofuels. J Biomed Biotechnol, 2012, 2012: 405842.

[23] Wood EJ. Fundamentals of biochemistry: Life at the molecular level (Third Edition) by D. Voet, J. Voet, and C. W. Pratt. Biochem Mol Biol Educ, 2008, 36(4): 319–320.

[24] Wei X, Xu XX, Qian LC, et al. Engineering a highly active thermophilic β-glucosidase to enhance its pH stability and saccharification performance. Biotechnol Biofuels, 2016, 9: 147.

[25] Fushinobu S, Ito K, Konno M, et al. Crystallographic and mutational analyses of an extremely acidophilic and acid-stable xylanase: biased distribution of acidic residues and importance of Asp37 for catalysis at low pH. Protein Eng, 1998, 11(12): 1121–1128.

[26] Chen Y C, Chiang YC, Hsu LC, et al. Structural modeling and further improvement in pH stability and activity of a highly-active xylanase from an uncultured rumen fungus. Bioresour Technol, 2012, 123: 125–134.

[27] Joshi MD, Sidhu G, Pot I, et al. Hydrogen bonding and catalysis: a novel explanation for how a single amino acid substitution can change the pH optimum of a glycosidase. J Mol Biol, 2000, 299(1): 255–279.

[28] Yang HQ, Liu L, Shin HD, et al. Structure-based engineering of histidine residues in the catalytic domain of α-amylase fromfor improved protein stability and catalytic efficiency under acidic conditions. J Biotechnol, 2013, 164(1): 59–66.

[29] Sáez-Jiménez V, Fernández-Fueyo E, Medrano FJ, et al. Improving the pH-stability of versatile peroxidase by comparative structural analysis with a naturally-stable manganese peroxidase. PLoS ONE, 2015, 10(10): e0140984.

[30] Beloqui A, Kobitski AY, Nienhaus GU, et al. A simple route to highly active single-enzyme nanogels. Chem Sci, 2018, 9(4): 1006–1013.

[31] Sinha R, Khare S K. Effect of organic solvents on the structure and activity of moderately halophilicsp. EMB9 protease. Extremophiles, 2014, 18(6): 1057–1066.

[32] Munawar N, Engel PC. Prospects for robust biocatalysis: engineering of novel specificity in a halophilic amino acid dehydrogenase. Extremophiles, 2013, 17(1): 43–51.

[33] Paul S, Bag SK, Das S, et al. Molecular signature of hypersaline adaptation: insights from genome and proteome composition of halophilic prokaryotes. Genome Biol, 2008, 9: R70.

[34] Mokashe N, Chaudhari B, Patil U. Operative utility of salt-stable proteases of halophilic and halotolerant bacteria in the biotechnology sector. Int J Biol Macromol, 2018, 117: 493–522.

[35] Yin J, Chen JC, Wu Q, et al. Halophiles, coming stars for industrial biotechnology. Biotechnol Adv, 2015, 33(7): 1433–1442.

[36] Zhang WJ, Xu H, Wu YQ, et al. A new cold-adapted, alkali-stable and highly salt-tolerant esterase from Bacillus licheniformis. Int J Biol Macromol, 2018, 111: 1183–1193.

[37] Gao RC, Shi T, Liu XD, et al. Purification and Characterisation of a salt-stable protease from the halophilic archaeon. J Sci Food Agric, 2017, 97(5): 1412–1419.

[38] Warden AC, Williams M, Peat TS, et al. Rational engineering of a mesohalophilic carbonic anhydrase to an extreme halotolerant biocatalyst. Nat Commun, 2015, 6: 10278.

[39] Wang JZ, Zheng C, Cao Y, et al. Rational design of an efficient halotolerant enzymatic system for in vitro one-pot synthesis of cytidine diphosphate choline. Biotechnol J, 2018, 13(7): 1700577.

[40] Zheng C, Li ZJ, Yang HF, et al. Computation-aided rational design of a halophilic choline kinase for cytidine diphosphate choline production in high-salt condition. J Biotechnol, 2019, 290: 59–66.

[41] Stepankova V, Bidmanova S, Koudelakova T, et al. Strategies for stabilization of enzymes in organic solvents. ACS Catal, 2013, 3(12): 2823–2836.

[42] Mohtashami M, Fooladi J, Haddad-Mashadrizeh A, et al. Molecular mechanism of enzyme tolerance against organic solvents: insights from molecular dynamics simulation. Int J Biol Macromol, 2019, 122: 914–923.

[43] Serdakowski AL, Dordick JS. Enzyme activation for organic solvents made easy. Trends Biotechnol, 2008, 26(1): 48–54.

[44] Ruiz AI, Malavé AJ, Felby C, et al. Improved activity and stability of an immobilized recombinant laccase in organic solvents. Biotechnol Lett, 2000, 22(3): 229–233.

[45] Liu CJ, Saeki D, Cheng L, et al. Polyketone-based membrane support improves the organic solvent resistance of laccase catalysis. J Colloid Interface Sci, 2019, 544: 230–240.

[46] Lin CP, Xu KL, Zheng RC, et al. Immobilization of amidase into a magnetic hierarchically porous metal-organic framework for efficient biocatalysis. Chem Commun, 2019, 55(40): 5697–5700.

[47] Batra J, Mishra S. Organic solvent tolerance and thermostability of a β-glucosidase co-engineered by random mutagenesis. J Mol Catal B: Enzym, 2013, 96: 61–66.

[48] Zhou Y, Pérez B, Hao WW, et al. The additive mutational effects from surface charge engineering: A compromise between enzyme activity, thermostability and ionic liquid tolerance. Biochem Eng J, 2018, 148: 195–204.

[49] Dick M, Hartmann R, Weiergr?eber OH, et al. Mechanism-based inhibition of an aldolase at high concentrations of its natural substrate acetaldehyde: structural insights and protective strategies. Chem Sci, 2016, 7(7): 4492–4502.

[50] Cao TP, Kim JS, Woo MH, et al. Structural insight for substrate tolerance to 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase from the pathogen. J Microbiol, 2016, 54(4): 311–321.

[51] Sheldon RA, Woodley JM. Role of biocatalysis in sustainable chemistry. Chem Rev, 2017, 118(2): 801–838.

[52] Savile CK, Janey JM, Mundorff EC, et al. Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture. Science, 2010, 329(5989): 305–309.

Catalysis of enzymes under industrial environment and their adaptive modifications: a review

Wenhao Wang1,2, Pengfei Wen1,2,Kongliang Xu1,2, Renchao Zheng1,2, and Yuguo Zheng1,2

1 Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, Zhejiang, China 2 Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of Ministry of Education, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, Zhejiang, China

Enzymes have a wide range of applications and great industrial potential. However, large-scale applications of enzymes are restricted by the harsh industrial environment, such as high temperature, strong acid/alkali, high salt, organic solvents, and high substrate concentration. Adaptive modification (such as rational or semi-rational design, directed evolution and immobilization) is the most common strategy to improve the catalysis of enzymes under industrial conditions. Here, we review the catalysis of enzymes in the industrial environment and various methods adopted for the adaptive modifications in recent years, to provide reference for the adaptive modifications of enzymes.

industrial environment, enzymes, biocatalysis, catalysis, adaptive modification

10.13345/j.cjb.190258

鄭仁朝 浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院教授、執(zhí)行院長(zhǎng)，兼任中國(guó)化工學(xué)會(huì)生物化工專委會(huì)副秘書(shū)長(zhǎng)、浙江省化工學(xué)會(huì)生物化工專委會(huì)副主任。從事工業(yè)生物催化應(yīng)用基礎(chǔ)和產(chǎn)業(yè)化研究，主持國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、浙江省杰出青年基金等項(xiàng)目10余項(xiàng)。在、、等期刊發(fā)表論文50余篇，授權(quán)中國(guó)/美國(guó)發(fā)明專利27件。獲國(guó)家技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)1項(xiàng)和省部級(jí)科學(xué)技術(shù)一等獎(jiǎng)3項(xiàng)。入選浙江省首批“萬(wàn)人計(jì)劃”青年拔尖人才、獲侯德榜化工科學(xué)技術(shù)青年獎(jiǎng)等獎(jiǎng)勵(lì)。

王文豪, 聞鵬飛, 許孔亮, 等. 工業(yè)環(huán)境下酶蛋白的催化行為與適應(yīng)性改造研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(10): 1857–1869.

Wang WH, Wen PF, Xu KL, et al. Catalysis of enzymes under industrial environment and their adaptive modifications: a review. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1857–1869.

June16, 2019;

August 16, 2019

Supported by: National Key Research and Development Project (No. 2017YFE0129400), Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No. LR19B06001).

Renchao Zheng. Tel: +86-571-88320391; E-mail: zhengrc@zjut.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 (No. 2017YFE0129400)，浙江省自然科學(xué)基金 (No. LR19B06001) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)