工業(yè)生物發(fā)酵過程模擬：進(jìn)展與發(fā)展趨勢

李德茂，陳吳西，郭蔚，李超峰

工業(yè)生物發(fā)酵過程模擬：進(jìn)展與發(fā)展趨勢

李德茂，陳吳西，郭蔚，李超峰

中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

工業(yè)生物發(fā)酵是工業(yè)生物技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)必需的基本操作單元。對(duì)微生物細(xì)胞及其反應(yīng)器進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬將有助于加深對(duì)發(fā)酵過程的理解，也將為新的合成生物構(gòu)建提供解決策略。文中對(duì)工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)的特點(diǎn)、數(shù)學(xué)模擬的發(fā)展歷史、數(shù)學(xué)模型的分類和特點(diǎn)、用途等作了深入闡述，并展望了全發(fā)酵系統(tǒng)模擬的發(fā)展趨勢。

工業(yè)生物技術(shù)，發(fā)酵，模擬與仿真，機(jī)理模型，經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，混合模?/p>

工業(yè)生物技術(shù)是利用生物化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行大規(guī)模的物質(zhì)加工與轉(zhuǎn)化的先進(jìn)制造技術(shù)，它以工業(yè)發(fā)酵或工業(yè)催化為技術(shù)主體生產(chǎn)包括生物基化學(xué)品、生物基材料、生物燃料等產(chǎn)品，涉及食品、能源等許多重要的工業(yè)領(lǐng)域[1]。近年來，全球工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展迅猛，成為繼醫(yī)藥生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)之后，國際生物技術(shù)發(fā)展的第三次浪潮，占有重要的國際地位。其中，工業(yè)生物發(fā)酵是工業(yè)生物技術(shù)的關(guān)鍵，是工業(yè)生物技術(shù)規(guī)模化生產(chǎn)必需的基本操作單元。我國已成為世界生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)大國，2018年生物發(fā)酵行業(yè)主要產(chǎn)品產(chǎn)量約2 961.6萬t，與2017年相比增長約4.1%；總產(chǎn)值2 472億元，同比增長3.4%。生物發(fā)酵主要行業(yè)、主要產(chǎn)品出口量491.09萬t，出口額53.53億美元，較2017年同期增長25.1%[2]。

中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)“十三五”發(fā)展規(guī)劃[3]指出，加快發(fā)展和壯大生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)、以充分利用可再生資源、解決國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中可能面臨的資源短缺等問題、構(gòu)建可持續(xù)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展之路成為必然選擇。然而，當(dāng)前我國的工業(yè)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)品以中低端為主，附加值較低，品質(zhì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及同類其他國際品牌，其中的原因離不開生產(chǎn)控制技術(shù)落后、發(fā)酵過程優(yōu)化和相關(guān)技術(shù)裝備的智能化水平較低等因素。

微生物發(fā)酵過程集合了化工過程與生物代謝過程的特點(diǎn)，系統(tǒng)的復(fù)雜性導(dǎo)致單憑經(jīng)驗(yàn)來控制生產(chǎn)已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際的需求，如控制不當(dāng)就會(huì)造成較大的損失；而且，傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)控制方法無法實(shí)現(xiàn)智能制造。而數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展為復(fù)雜發(fā)酵過程的分析和監(jiān)控提供了可能。對(duì)微生物細(xì)胞及其反應(yīng)器進(jìn)行嚴(yán)格的數(shù)學(xué)描述將有助于加深對(duì)發(fā)酵系統(tǒng)的理解，并在數(shù)字細(xì)胞模型中產(chǎn)生強(qiáng)大的作用。同時(shí)，在數(shù)學(xué)模擬的指導(dǎo)下也將會(huì)有效提高合成生物構(gòu)建的效率[4]。因此，借助數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)對(duì)發(fā)酵過程建模和模擬越來越受到人們的關(guān)注，也使其成為智能生物制造產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心技術(shù)之一。

本文試圖從工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)的特點(diǎn)、數(shù)學(xué)模擬的發(fā)展歷史、數(shù)學(xué)模型的分類和特點(diǎn)、用途等方面作深入闡述，并展望全發(fā)酵系統(tǒng)模擬的發(fā)展趨勢，為數(shù)學(xué)模擬在工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)的特點(diǎn)

工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)是由微生物、培養(yǎng)介質(zhì)、反應(yīng)器等組成，微生物的生命活動(dòng)是該系統(tǒng)的主體(圖1)。其特點(diǎn)主要有以下幾個(gè)方面：1) 發(fā)酵過程往往比化學(xué)過程更復(fù)雜。細(xì)胞代謝過程是由DNA、mRNA和蛋白質(zhì)等分子參與的，一些隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞代謝的波動(dòng)。這些波動(dòng)包括啟動(dòng)子激活或失活以及mRNA和蛋白質(zhì)的合成和衰變、基因產(chǎn)物如RNA聚合酶、核糖體和某些蛋白質(zhì)等的在基因、代謝網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞等尺度的波動(dòng)。同時(shí)，在工業(yè)反應(yīng)器中也存在不完全混合或分散以及環(huán)境的噪聲涌入，容易導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)路徑的通量分布、產(chǎn)品產(chǎn)量和發(fā)酵穩(wěn)定性等方面的差異。2) 菌體的生長、產(chǎn)物生成均呈非線性。3) 除部分常規(guī)參數(shù)例如溫度、pH等可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線測量以外，大部分?jǐn)?shù)據(jù)難以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線測量。這一過程的復(fù)雜性導(dǎo)致工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)具有非線性和時(shí)變性的特點(diǎn)，發(fā)酵體積越大越容易受到體系流體力學(xué)的影響；生物反應(yīng)器是一種不均勻的流場，存在著溫度、底物濃度、剪切力和溶解氧等的不同，導(dǎo)致體系中的微生物代謝受到反應(yīng)器和自身代謝物的互相影響，而表現(xiàn)出時(shí)變性。

圖1 發(fā)酵系統(tǒng)組成與交互

2 數(shù)學(xué)模型的發(fā)展歷程

20世紀(jì)60年代Bird等將數(shù)學(xué)模擬的方法應(yīng)用到化學(xué)工程中[5]。1973年Aiba等出版的《Biochemical Engineering》首次將化學(xué)工程的動(dòng)力學(xué)模型的方法引入到生物過程中，將早期的描述性、經(jīng)驗(yàn)性的方法發(fā)展到嚴(yán)格的數(shù)學(xué)推理[6]。Arnold Fredrickson等于1970年將結(jié)構(gòu)和隔離引入到細(xì)胞研究中，并提出4種不同的隔離和結(jié)構(gòu)組合或缺失，方便地將最常見的數(shù)學(xué)描述和實(shí)驗(yàn)類型劃分為4個(gè)不相交的類別 (結(jié)構(gòu)隔離模型、結(jié)構(gòu)非隔離模型、非結(jié)構(gòu)非隔離模型和非結(jié)構(gòu)隔離模型，見表1)[7]。

生物化學(xué)過程是建立在熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)和化學(xué)計(jì)量學(xué)三大基本原理的基礎(chǔ)上。熱力學(xué)理論對(duì)于化學(xué)和生物化學(xué)過程特別重要，它表征了一個(gè)封閉系統(tǒng)的物質(zhì)、能量、功和熱能之間的關(guān)系，可以用熱力學(xué)分析哪些過程在熱力學(xué)上是否可行。但是，熱力學(xué)研究幾乎排除了反應(yīng)的時(shí)間影響，其結(jié)論只關(guān)注反應(yīng)是否可行，而無法說明是在多長時(shí)間發(fā)生的反應(yīng)。而反之，動(dòng)力學(xué)研究對(duì)于能量的關(guān)注較少，其主要關(guān)注生物化學(xué)反應(yīng)的時(shí)間觀，而且動(dòng)力學(xué)分析還忽略了空間和混合程度的影響。最早期的動(dòng)力學(xué)研究策略是采用微分方程描述狀態(tài)變量的改變，又因?yàn)楹雎粤丝臻g的影響，就可以采用常微分方程來表示，典型的代表就是描述單底物酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的Michaelis- Menten方程。但是，發(fā)酵過程中可能存在著底物添加等的脈沖行為、發(fā)酵過程中的各種隨機(jī)因素的干擾無時(shí)無處不在，導(dǎo)致線性動(dòng)力學(xué)理論已經(jīng)不能滿足對(duì)客觀實(shí)際的發(fā)酵系統(tǒng)的全面了解。近30–40年以來，非線性動(dòng)力學(xué)理論特別是脈沖動(dòng)力系統(tǒng)、隨機(jī)動(dòng)力系統(tǒng)、時(shí)滯動(dòng)力系統(tǒng)和混雜系統(tǒng)等多種理論工具的不斷完善和計(jì)算機(jī)代數(shù)、數(shù)值模擬和圖形技術(shù)的發(fā)展，使得非線性動(dòng)力系統(tǒng)得到了飛速的發(fā)展。建立一個(gè)工業(yè)發(fā)酵體系完整動(dòng)力學(xué)模型的另外一個(gè)有效方式是系統(tǒng)化學(xué)計(jì)量學(xué)研究，而這一基礎(chǔ)是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的代謝途徑的基本生化過程。其中包括了代謝通量分析、流量平衡分析等代謝網(wǎng)絡(luò)分析的方法[8]。

以上的研究都是建立在生物化學(xué)機(jī)理的基礎(chǔ)上的，但是，因?yàn)榘l(fā)酵過程的復(fù)雜性很難建立足夠精確、簡單、靈活、適應(yīng)性強(qiáng)、速度快、魯棒性強(qiáng)的機(jī)理模型。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展和發(fā)酵反應(yīng)器在線測量技術(shù)的發(fā)展，基于人工智能(AI) 的方法開始用于重要變量的在線估計(jì)和生物反應(yīng)器的最優(yōu)控制，例如人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[9]、遺傳算法[10]和模糊邏輯[11]等已在不同的研究中得到應(yīng)用。盡管它們優(yōu)于經(jīng)典的建模和控制方法，但是人工智能方法是一種黑箱模型，并不關(guān)注微生物的生理狀態(tài)和代謝機(jī)理。因此，這種模型需要大量的數(shù)據(jù)來訓(xùn)練，而且模型也僅僅局限于其訓(xùn)練的領(lǐng)域，無法拓展。這些弱點(diǎn)催生了將人工智能與機(jī)理模型相結(jié)合的混合模型，這種混合模型能夠更加準(zhǔn)確地模擬發(fā)酵的實(shí)際過程[12]。

表1 數(shù)學(xué)模型的分類

在工業(yè)發(fā)酵的復(fù)雜體系中，還要關(guān)注體系中的流體力學(xué)情況。張嗣良等團(tuán)隊(duì)提出了將反應(yīng)器流場特性與細(xì)胞生理特性相結(jié)合的發(fā)酵工程放大技術(shù)，通過對(duì)反應(yīng)器的計(jì)算流體力學(xué)(Computational fluid dynamics，CFD)的模擬和仿真結(jié)合菌體生理特性的相關(guān)性分析，尋找過程放大的敏感參數(shù)實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的放大[13]。

3 工業(yè)發(fā)酵模型與簡介

將工業(yè)發(fā)酵過程模擬方法分為機(jī)理模型、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃突旌夏Ｐ?種類型(表1)。

3.1 機(jī)理模型

機(jī)理模型是根據(jù)發(fā)酵系統(tǒng)的組成和運(yùn)行機(jī)理對(duì)系統(tǒng)內(nèi)部模擬的數(shù)學(xué)公式。例如，在好氧發(fā)酵中，主要成分是底物、氧氣、細(xì)胞質(zhì)量、反應(yīng)器體積、底物和氣流，而主要機(jī)制是微生物生長、傳質(zhì)(曝氣) 和混合(底物、pH控制試劑)。它以確定性原理為基礎(chǔ)，在給定初始條件下可以預(yù)測發(fā)酵系統(tǒng)的行為。

3.1.1 非結(jié)構(gòu)非隔離模型

模型的基本假設(shè)認(rèn)為發(fā)酵反應(yīng)器的環(huán)境是均勻的，也不考慮細(xì)胞之間的差異，并將細(xì)胞及其成分描述為溶液中的單一成分。該模型基于細(xì)胞質(zhì)量、底物、代謝物的產(chǎn)生和消耗的守恒方程，來表征微生物代謝的表觀速率，因此就有細(xì)胞生長速率、營養(yǎng)吸收速率和代謝物生成速率等參數(shù)。現(xiàn)代微生物生長動(dòng)力學(xué)起源于Monod方程，該方程認(rèn)為細(xì)胞的比生長速率與限制性基質(zhì)的濃度關(guān)系可用=max/(+) 來表示，其中，為菌體的生長比速，為限制性基質(zhì)濃度，為半飽和常數(shù)，max為最大比生長速度。

這種方程表述簡單，應(yīng)用范圍廣泛，目前還有較廣的應(yīng)用[14-15]。但是它僅僅用于細(xì)胞生長速度較慢和細(xì)胞密度較低的環(huán)境下，不能考慮個(gè)體、調(diào)節(jié)復(fù)雜、對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性反應(yīng)以及細(xì)胞器在固有代謝中產(chǎn)生各種產(chǎn)物的能力。

3.1.2 非結(jié)構(gòu)隔離模型

微生物在不同的生長時(shí)期具有不同的形態(tài)和生產(chǎn)能力。非結(jié)構(gòu)化隔離模型通過單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞大小或菌齡等來表征細(xì)胞，而不考慮細(xì)胞內(nèi)成分變化[16]。該模型基于典型的微生物細(xì)胞周期——DNA合成(S)、有絲分裂(M) 和兩次間期(G1和G2)，這些階段具有不同的細(xì)胞活動(dòng)、形態(tài)甚至機(jī)理特性。一個(gè)新的細(xì)胞進(jìn)入間期1期(G1) 的循環(huán)，然后進(jìn)入DNA合成階段(S)。完成S期后，細(xì)胞進(jìn)入間期2期(G2)，然后在有絲分裂期(M) 開始細(xì)胞分裂過程。兩個(gè)子細(xì)胞從G1到M重復(fù)相同的周期[17]?；诩?xì)胞周期的分離模型將生長、代謝過程和產(chǎn)物形成的動(dòng)力學(xué)與各階段種群的分布聯(lián)系起來。Zhang等采用非結(jié)構(gòu)分隔模型，將細(xì)胞質(zhì)量分布的種群平衡方程(Population balance equation，PBE) 與底物速率限制的質(zhì)量平衡耦合研究了導(dǎo)致這些周期解的分岔，解釋了酵母出芽過程中的自激振蕩現(xiàn)象[18]。Jarzebski等將酵母菌連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)乙醇過程中的細(xì)胞分為活性、無活性和死細(xì)胞3種，建立了綜合考慮底物和產(chǎn)品抑制的動(dòng)力學(xué)非結(jié)構(gòu)分離模型來預(yù)測實(shí)驗(yàn)的振蕩和穩(wěn)態(tài)行為[19-20]。

3.1.3 結(jié)構(gòu)非隔離模型

結(jié)構(gòu)非隔離模型考慮了細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和組成，使用細(xì)胞生長及其代謝來描述更準(zhǔn)確的生長速率。該模型一般分為形態(tài)結(jié)構(gòu)模型、化學(xué)結(jié)構(gòu)模型、基因結(jié)構(gòu)模型和代謝結(jié)構(gòu)模型[21]。

形態(tài)結(jié)構(gòu)模型常用來描述重要生產(chǎn)生物體、絲狀真菌的生長，并區(qū)分菌絲元素的不同區(qū)域[22-23]。

化學(xué)結(jié)構(gòu)模型考慮了化學(xué)物質(zhì)在發(fā)酵動(dòng)力學(xué)中的作用，并將所有的速率參數(shù)考慮在內(nèi)。Garcia-Ochoa等提出了一種同時(shí)考慮碳源和氮源代謝的黃原膠生產(chǎn)化學(xué)結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型，該模型考慮了8個(gè)集中反應(yīng)(氨基酸的合成、未形成和形成堿基、核酸合成、RNA和DNA、黃原膠的產(chǎn)生、總糖代謝、氧化磷酸化和維持能量) 和8個(gè)關(guān)鍵化合物(生物量、銨、RNA、DNA、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、黃原膠、蔗糖和溶氧)。該動(dòng)力學(xué)模型能夠與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非常一致地描述之前在所有運(yùn)行中提到的8種關(guān)鍵化合物的濃度演變。此外，結(jié)構(gòu)化動(dòng)力學(xué)模型能夠預(yù)測系統(tǒng)在某些操作條件變化時(shí)的行為，如溫度和初始氮濃度，以及不同的氧氣輸送速率，根據(jù)操作條件和介質(zhì)成分(氮) 預(yù)測不同的黃原膠生產(chǎn)速率[24]。

基因結(jié)構(gòu)模型是建立在基因分子機(jī)制基礎(chǔ)上的，該模型包括操作調(diào)控基因的表達(dá)速率和轉(zhuǎn)錄、翻譯和折疊過程的動(dòng)力學(xué)方程。Koh等提出了一種基于已知的阻遏物蛋白、輔阻遏子和誘導(dǎo)物分子相互作用的TRP操縱子遺傳結(jié)構(gòu)數(shù)學(xué)模型，該模型定性和定量地模擬了這些調(diào)控物對(duì)克隆基因產(chǎn)物抑制和表達(dá)程度的影響?；谠撃Ｐ偷挠?jì)算可以預(yù)測有效抑制的最佳載脂蛋白和色氨酸水平，同時(shí)還可以預(yù)測誘導(dǎo)低質(zhì)粒和高質(zhì)?？截悢?shù)克隆所需的對(duì)吲哚丙烯酸濃度。利用這個(gè)模型還可以解釋研究人員在研究TRP啟動(dòng)子時(shí)所觀察到的似乎不正常的、有時(shí)是矛盾的現(xiàn)象[25]。Lee和Bailey構(gòu)建了大腸桿菌lac操縱子功能的遺傳結(jié)構(gòu)模型[26]，Keasling等構(gòu)建了結(jié)構(gòu)lac操縱子模型[27]。當(dāng)這類模型與代謝物水平的描述結(jié)合時(shí)，可能預(yù)測基因表達(dá)的變化。

代謝結(jié)構(gòu)模型可以更好地理解過程調(diào)節(jié)機(jī)制，如反饋調(diào)節(jié)。該模型以主要代謝途徑為基礎(chǔ)，大多數(shù)情況下包含在代謝流量分析(Metabolic flux analysis，MFA) 中。在代謝物濃度變化的情況下，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)將反應(yīng)和代謝物濃度作為矩陣陣列表示。Hatzimanikatis等進(jìn)一步提出了這一概念，并建立了大腸桿菌糖酵解動(dòng)力學(xué)模型，該模型與混合整數(shù)線性規(guī)劃優(yōu)化程序相結(jié)合，以預(yù)測網(wǎng)絡(luò)酶的最佳調(diào)節(jié)特性[28]。然而，對(duì)于無法獲得機(jī)理信息的大型網(wǎng)絡(luò)、基因、代謝等結(jié)構(gòu)描述可能就會(huì)比較困難。

3.1.4 結(jié)構(gòu)隔離模型

結(jié)構(gòu)隔離模型綜合考慮細(xì)胞組成變化和細(xì)胞之間的差別，因此結(jié)構(gòu)隔離模型非常復(fù)雜需要復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)測量技術(shù)(如流式細(xì)胞儀) 來對(duì)其可行性進(jìn)行驗(yàn)證[29]。Henson建立了一個(gè)描述細(xì)胞外環(huán)境的簡單結(jié)構(gòu)化分離模型，并對(duì)其進(jìn)行了評(píng)價(jià)[30]。該模型解釋了與葡萄糖基質(zhì)細(xì)胞生長有關(guān)的3個(gè)最重要的代謝途徑。與完全非結(jié)構(gòu)化模型相比，該模型的主要優(yōu)點(diǎn)是可以將細(xì)胞外變量的預(yù)測直接與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。因此，該模型結(jié)構(gòu)非常適合于從可用的細(xì)胞外測量中確定未知的模型參數(shù)。Fordyce和Rawlings構(gòu)建了一個(gè)分離模型來預(yù)測地衣芽孢桿菌在液體發(fā)酵系統(tǒng)中生長和分化的有效性[31]。分離模型解釋了芽孢桿菌生命周期的3種形態(tài)。利用年齡-種群模型對(duì)孢子囊生物量進(jìn)行了表征，以反映孢子形成的年齡依賴過程。提出了控制營養(yǎng)細(xì)胞繁殖率、孢子萌發(fā)率、產(chǎn)孢率和底物消耗率之間的關(guān)系。

3.2 經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h3>

被稱作白箱模型的機(jī)理模型雖然能夠展示實(shí)際發(fā)酵過程的內(nèi)部反應(yīng)機(jī)理，然而，由于生物發(fā)酵過程涉及細(xì)胞的生長繁殖和代謝，存在著嚴(yán)重的非線性、時(shí)變性和不確定性。因此，在實(shí)際發(fā)酵過程中的機(jī)理建模是十分困難的，而且需要大量的試驗(yàn)對(duì)機(jī)理模型進(jìn)行參數(shù)辨識(shí)和估計(jì)，在實(shí)際應(yīng)用中難以做到。而且，一些生物變量很難在線檢測，往往需要離線采樣分析，不能及時(shí)反映和跟蹤過程變化，加之對(duì)許多生化過程的代謝途徑尚不清楚，難以得到準(zhǔn)確的機(jī)理模型。因此，需要一種更加有效的建模方法[8]。綜合以上的問題，需要一種不考慮發(fā)酵過程機(jī)理的建模方法，僅僅考慮其輸入的變量(溫度、壓力、pH、溶氧、補(bǔ)料速率、基質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度等) 和輸出的變量(建模的目的變量，如產(chǎn)物濃度、基質(zhì)濃度、菌體濃度) 的模型，建立在統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)上的模型營運(yùn)而生。該模型只需要建立輸入和輸出的相關(guān)關(guān)系，其主要的方法有回歸模型、模糊邏輯和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等。

3.2.1 回歸模型

回歸模型可以定量地描述某一現(xiàn)象和某些因素之間的函數(shù)關(guān)系，將各變量的已知值代入回歸方程可以求出因變量的估計(jì)值，從而可以進(jìn)行預(yù)測等相關(guān)研究。該方法在發(fā)酵過程模擬中得到了大量的應(yīng)用。Wu等研究表明非線性回歸模型結(jié)合拉曼光譜檢測可以作為發(fā)酵過程的快速監(jiān)測方法[32]。Azman等建立了一個(gè)二階多項(xiàng)式回歸模型來優(yōu)化農(nóng)業(yè)工業(yè)廢水制氫性能[33]。

3.2.2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Artificial neural network，ANN) 是20世紀(jì)80 年代以來人工智能領(lǐng)域興起的研究熱點(diǎn)。它從信息處理角度對(duì)人腦神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行抽象，建立某種簡單模型，按不同連接方式組成不同的網(wǎng)絡(luò)，其機(jī)理可參考文獻(xiàn)[34-38]。

在Elnekave等的研究中采用3種不同的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，即前饋反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Feed forward back-propagation neural network，BPNN)、徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Radial basis function，RBF) 和廣義回歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Generalized regression neural network，GRNN)，模擬了流量、體積負(fù)荷、初始化學(xué)需氧量和初始總懸浮物對(duì)最終化學(xué)需氧量和最終總懸浮物的影響。結(jié)果表明，BPNN的預(yù)測結(jié)果最好，平均偏差在實(shí)驗(yàn)值的6.4%–15.6%之間。優(yōu)化后的模型驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)能夠達(dá)到較高的COD去除效率(77%–79%)，同時(shí)產(chǎn)生880–11 000 m3/d的沼氣[39]。

但是，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型需要大量的參數(shù)，不能觀察中間學(xué)習(xí)過程，輸出結(jié)果較難解釋，會(huì)影響到結(jié)果的可信度，需要較長的學(xué)習(xí)時(shí)間，當(dāng)數(shù)據(jù)量較大的時(shí)候，學(xué)習(xí)速度會(huì)制約其應(yīng)用。

3.2.3 模糊邏輯模型

模糊邏輯(Fuzzy logic) 指的是模仿人腦的不確定性概念判斷、推理思維方式，對(duì)于模型未知或不能確定的描述系統(tǒng)，以及強(qiáng)非線性、大滯后的控制對(duì)象，應(yīng)用模糊集合和模糊規(guī)則進(jìn)行推理，表達(dá)過渡性界限或定性知識(shí)經(jīng)驗(yàn)，模擬人腦方式，實(shí)行模糊綜合判斷，推理解決常規(guī)方法難以解決的規(guī)則型模糊信息問題。其機(jī)理可以參考文獻(xiàn)[40]。Márquez-Vera等基于線性矩陣不等式構(gòu)建了一種模糊控制和模糊觀測器，用此模糊模型對(duì)狀態(tài)反饋控制器和觀測器增益進(jìn)行了調(diào)整，可以進(jìn)行狀態(tài)反饋以控制產(chǎn)品濃度[41]。Flores-Asis等[42]采用模糊邏輯模型的方法對(duì)某禽類加工廠污水處理的污泥進(jìn)行了熱預(yù)處理，確定了影響沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量最大的變量，以加速污泥厭氧消化過程。設(shè)計(jì)的模糊邏輯模型包括688條推理規(guī)則，預(yù)測數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的相關(guān)性為99.3%，沼氣變量的相關(guān)性為97%。利用響應(yīng)面模型對(duì)模糊邏輯模型的預(yù)測進(jìn)行了分析，得出了在沼氣生產(chǎn)中，溫度和操作時(shí)間變量是相互決定的結(jié)論。這項(xiàng)研究為專家決策支持系統(tǒng)的設(shè)計(jì)提供了可靠的方法。

3.3 混合模型

發(fā)酵代謝反應(yīng)是由結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜的分子調(diào)節(jié)的，這些分子在遺傳水平上對(duì)噪聲敏感，其變異會(huì)顯著影響微生物表型；而且，細(xì)胞代謝過程也對(duì)環(huán)境變化作出反應(yīng)。因?yàn)槿狈局R(shí)或是因?yàn)槠鋸?fù)雜性，單獨(dú)的機(jī)理模型難以描述整個(gè)發(fā)酵過程。面對(duì)復(fù)雜的生物反應(yīng)器的噪聲和空間變化，經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ统１挥脕砟M宏觀微生物行為。然而經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒话?xì)胞過程的生理特征，很難為這些模型的參數(shù)提供精確的機(jī)理解釋。而且，沒有一個(gè)模型能夠同時(shí)考慮細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的噪聲，因此有必要將機(jī)理模型與人工智能模型相結(jié)合來表述微生物過程[43]。

混合模型已被公認(rèn)為生物過程分析的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。最常用的混合模型是基于質(zhì)量平衡方程(如傳統(tǒng)的第一原理方法) 與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型相結(jié)合的方法[44-45]。Oliveira提出了一種將第一原理建模與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合的生物反應(yīng)器混合模型結(jié)構(gòu)：用一組質(zhì)量平衡方程描述生物反應(yīng)器系統(tǒng)，用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和機(jī)理模型共同來表示細(xì)胞群系統(tǒng)?；谶@種混合結(jié)構(gòu)的數(shù)學(xué)公式，他們從系統(tǒng)工程的角度對(duì)發(fā)酵系統(tǒng)進(jìn)行了分析[45]。

混合模型可以集成更多的參數(shù)和信息，因此可以實(shí)現(xiàn)更高的精度、更少的迭代次數(shù)和更低的開發(fā)成本。這些復(fù)合模型原則上應(yīng)該像智能模型一樣具有適應(yīng)性、靈活性和自我調(diào)節(jié)性，但也具有機(jī)理模型的基本生物學(xué)基礎(chǔ)。

3.4 流體力學(xué)模擬

發(fā)酵系統(tǒng)是由微生物和反應(yīng)器組成的，微生物的生長和產(chǎn)物的形成是由細(xì)胞內(nèi)部代謝和反應(yīng)器環(huán)境之間的交互作用決定的。因此，對(duì)發(fā)酵過程建模時(shí)，除了關(guān)注細(xì)胞內(nèi)功能單元的復(fù)雜相互作用以外，還要關(guān)注生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)與內(nèi)部流場情況(混合和傳質(zhì)強(qiáng)度的時(shí)空變化、各種基質(zhì)和產(chǎn)物的濃度梯度等)。因此，如果將微生物和反應(yīng)器作為一個(gè)系統(tǒng)來看待，模型需要加入反應(yīng)器的流場情況。目前，反應(yīng)器流場的模擬一般用計(jì)算流體力學(xué)來開展。CFD的基本思想是求解反應(yīng)器中流體的運(yùn)動(dòng)方程(即Navier-Stokes方程)，這些方程描述了流體的質(zhì)量守恒和動(dòng)量平衡。Wolf等提出了基于拉格朗日-歐拉模型的方法，其中液相被視為連續(xù)體(歐拉)，分散相借助拉格朗日表示進(jìn)行跟蹤[46]。還有研究采用混合方法，將多區(qū)域模型與CFD計(jì)算結(jié)合起來[47]。Delvigne等構(gòu)建了一個(gè)完整的發(fā)酵放大/縮小的模擬方法，該方法將計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)、代謝通量分析和Agent-based Modelling (ABM) 關(guān)聯(lián)起來，以便更好地理解非均勻環(huán)境中的細(xì)胞生命行為[48]。

3.5 組學(xué)指導(dǎo)下的數(shù)學(xué)建模

隨著組學(xué)時(shí)代的到來，描述微生物生長的模型的覆蓋范圍和深度達(dá)到了一個(gè)新的水平，從而開創(chuàng)了組學(xué)建模方法的時(shí)代。人們開始試圖建立代謝組、蛋白質(zhì)組和基因組之間的關(guān)系。代謝網(wǎng)絡(luò)的基因組尺度重構(gòu)與基于約束的建模相結(jié)合是微生物系統(tǒng)生物學(xué)中日益流行的方法。雖然重建主要基于基因組學(xué)數(shù)據(jù)，但它是通過對(duì)相關(guān)生物體的生物化學(xué)、遺傳和/或生理學(xué)知識(shí)的反復(fù)修正將網(wǎng)絡(luò)重建轉(zhuǎn)化為一個(gè)數(shù)學(xué)模型，通常稱為基因組尺度模型(GEM)，通過一系列基于約束的方法，如通量平衡分析，可以進(jìn)行定性和定量分析。這有助于進(jìn)一步完善網(wǎng)絡(luò)重建，并為基因型-表型關(guān)系提供有價(jià)值的見解[49]。

從細(xì)胞生長的角度來看，與簡單的非結(jié)構(gòu)化生長模型相比，基因組尺度模型使用更詳細(xì)和準(zhǔn)確的機(jī)制(以及相關(guān)的數(shù)學(xué)表達(dá)式)。Yizhak等將代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)整合到Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)表達(dá)式中，使用體外m參數(shù)比不考慮動(dòng)力學(xué)的方法更準(zhǔn)確地預(yù)測通量變化[50]。Cotten等[51]通過整合通量組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，估算了大腸桿菌中心代謝動(dòng)力學(xué)模型中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

4 發(fā)酵過程數(shù)學(xué)模型用途

4.1 發(fā)酵過程的優(yōu)化、控制與故障診斷

發(fā)酵過程本身比較復(fù)雜，優(yōu)化、放大與控制的難度都較大；批次間的重復(fù)性很差，極易造成產(chǎn)量和質(zhì)量的波動(dòng)。同時(shí)，隨著發(fā)酵原料成本的增加、環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，發(fā)酵過程的精準(zhǔn)控制要求越來越高。因此，常規(guī)、簡單的控制方法已不能滿足生產(chǎn)的需求。大量的研究將數(shù)學(xué)模型用于發(fā)酵過程優(yōu)化、放大、控制與故障診斷中。這將會(huì)為產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供智能發(fā)酵技術(shù)支持。

4.2 為途徑設(shè)計(jì)與理性改造提供策略方案

隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)各種不同的化學(xué)品成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。常規(guī)方法從能夠產(chǎn)生少量所需化學(xué)品的菌株到獲得一種符合商業(yè)可行工藝要求的菌株需要3–5年的時(shí)間和超過5 000萬美元的投資。隨著新的基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)(例如CRISPR/Cas9技術(shù))，目前的挑戰(zhàn)已經(jīng)變?yōu)槿绾螢榫N改造提供技術(shù)方案[52]。將分子、蛋白、網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞和反應(yīng)器的大數(shù)據(jù)采用機(jī)理模型和人工智能模型的手段整合為一個(gè)全局模型將會(huì)為途徑的改造提供全局模擬。這種模擬代謝將會(huì)為化學(xué)品的生產(chǎn)途徑和代謝網(wǎng)絡(luò)的改進(jìn)提供信息。例如，全基因組代謝模型與整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)中的化學(xué)計(jì)量學(xué)相耦合，非常適合于代謝工程設(shè)計(jì)[53]。

4.3 全細(xì)胞生命現(xiàn)象的解析

工業(yè)發(fā)酵不同于常規(guī)細(xì)胞生命活動(dòng)，微生物細(xì)胞除了在生產(chǎn)中表現(xiàn)出穩(wěn)定性、魯棒性等優(yōu)良特性以外，它還要適應(yīng)不同發(fā)酵規(guī)模下空間的不均一性的變化。而這些現(xiàn)象的解析，除了常規(guī)方法在基因?qū)用娴闹щx破碎的信息以外，基于模型模擬的細(xì)胞整體生命活動(dòng)特性的解析就顯得尤為重要。它們可以解析細(xì)胞的自組織空間模式、動(dòng)力學(xué)和流體響應(yīng)信息，從個(gè)體和群體層面上增進(jìn)對(duì)發(fā)酵系統(tǒng)的理解。

5 模型的評(píng)價(jià)

模型是否能夠服務(wù)于對(duì)微生物代謝的理解、工藝過程的優(yōu)化和控制應(yīng)該成為評(píng)價(jià)一個(gè)模型的重要指標(biāo)，即為“目標(biāo)適用性”[54]。一個(gè)微生物發(fā)酵系統(tǒng)非常復(fù)雜，目前的技術(shù)還不可能面面俱到實(shí)現(xiàn)完美的模擬，但是如果實(shí)現(xiàn)了“目標(biāo)適用性”即可以認(rèn)為該過程模擬達(dá)到了目的。

良好的建模規(guī)范(Good modeling practice，GMoP) 將不確定性和敏感性分析與建模相結(jié)合是將模型構(gòu)建過程或模型后續(xù)應(yīng)用和解釋中的錯(cuò)誤風(fēng)險(xiǎn)降至最低的必要條件。與模擬模型預(yù)測相關(guān)的不確定性通常被分為：(a) 描述隨機(jī)系統(tǒng)所需的模擬模型的隨機(jī)組成部分產(chǎn)生的隨機(jī)不確定性；(b) 主觀(或輸入) 不確定性，表示對(duì)用作模型輸入的固定值的不完全了解；(c) 與數(shù)學(xué)相關(guān)的結(jié)構(gòu)不確定性公式或模型結(jié)構(gòu)。靈敏度分析是對(duì)不確定度分析的補(bǔ)充，可以對(duì)參數(shù)重要性進(jìn)行排序，以減少最有影響的參數(shù)的不確定性，而不是將實(shí)驗(yàn)工作浪費(fèi)在對(duì)模型輸出影響很小或沒有影響的參數(shù)上[55]，以此可以分析出模擬需要的重要參數(shù)和條件。

6 總結(jié)與展望

工業(yè)發(fā)酵過程擁有一個(gè)非常復(fù)雜的代謝過程，涉及大量的代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)以及相關(guān)的基因調(diào)控和環(huán)境影響。而數(shù)學(xué)建模從早期現(xiàn)象學(xué)描述發(fā)展到代謝網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)建模，從簡單的基因調(diào)控發(fā)展到系統(tǒng)級(jí)整合的嘗試將會(huì)使研究人員可以深入了解復(fù)雜的發(fā)酵過程，并能實(shí)現(xiàn)過程的優(yōu)化與控制。而數(shù)學(xué)模擬的終極目標(biāo)是要建立全發(fā)酵系統(tǒng)的細(xì)胞、反應(yīng)器和過程的模型，也就是數(shù)字化的生產(chǎn)系統(tǒng)(包括細(xì)胞、反應(yīng)器及其交互系統(tǒng))，而不僅僅是數(shù)字化細(xì)胞。

微生物數(shù)字細(xì)胞模型的研究因?yàn)橛?jì)算能力、未知的代謝機(jī)理等因素的限制，進(jìn)展并不順利，截至目前僅有3個(gè)細(xì)胞模型：1) 由Shuler開發(fā)的大腸桿菌模型，可以描述14個(gè)關(guān)鍵變量的細(xì)胞功能[56]；2) 由Tomita等開發(fā)的大腸桿菌ECELL模型，允許用戶根據(jù)特定的需求模擬細(xì)胞功能[57]；3) 由Karr等開發(fā)的生殖支原體模型，代表了整個(gè)細(xì)胞最全面的數(shù)學(xué)模型[58]。

工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)中微生物和反應(yīng)器是一種交互共存的系統(tǒng)，微生物細(xì)胞本身、發(fā)酵反應(yīng)器和外環(huán)境對(duì)整個(gè)體系的影響非常大。因此，發(fā)酵過程建模應(yīng)綜合考慮微生物細(xì)胞內(nèi)部體系、交互體系和反應(yīng)器體系的參數(shù)。如能建立全系統(tǒng)細(xì)胞模型，將會(huì)實(shí)現(xiàn)全發(fā)酵系統(tǒng)的模擬計(jì)算，為菌種途徑改造、發(fā)酵優(yōu)化和反應(yīng)器設(shè)計(jì)等提供全方位的計(jì)算和信息支持。但是，以上3個(gè)細(xì)胞模型(大腸桿菌模型[56]、大腸桿菌ECELL模型[57]和支原體模型[58]) 僅僅是建立在細(xì)胞中不同生物學(xué)過程的簡單描述的基礎(chǔ)上，并未考慮外界環(huán)境對(duì)細(xì)胞模型的影響。為了提高工業(yè)發(fā)酵模型的預(yù)測和控制能力，首先需要擴(kuò)展相關(guān)分子、細(xì)胞和反應(yīng)器信息的系統(tǒng)級(jí)整合，包括細(xì)胞對(duì)反應(yīng)器時(shí)空的響應(yīng)、基因調(diào)控程序及其環(huán)境信號(hào)激活調(diào)控機(jī)制等；其次對(duì)現(xiàn)有模型也要進(jìn)行擴(kuò)容，除了批量發(fā)酵數(shù)據(jù)以外，還應(yīng)包括使模型適應(yīng)連續(xù)生產(chǎn)或其他發(fā)酵系統(tǒng)。而這些信息的整合需要建立更加復(fù)雜的模型框架，這對(duì)當(dāng)前細(xì)胞代謝機(jī)理和數(shù)據(jù)處理能力都提出了巨大的挑戰(zhàn)。

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Simulation of industrial fermentation: current status and future perspectives

Demao Li, Wuxi Chen, Wei Guo, and Chaofeng Li

Tianjin Key Laboratory for Industrial Biosystems and Bioprocessing Engineering, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Industrial fermentation is the basic operation unit of industrial biotechnology in large-scale production. Mathematical simulation of microbial cells and their reactors will help deepen the understanding of microorganisms and fermentation processes, and will also provide solutions for the construction of new synthetic organisms. In this paper, the characteristics of industrial fermentation system, the development of mathematical simulation, the classification, characteristics and functions of mathematical models are described in depth, and the development trend of whole fermentation system simulation is prospected.

industry biotechnology, fermentation, modeling and simulation, mechanistic model, empirical model, hybrid model

10.13345/j.cjb.190249

李德茂 博士，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員，碩士生導(dǎo)師。天津市利用3年時(shí)間引進(jìn)千名高技術(shù)人才獲得者、中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)會(huì)員、天津市濱海新區(qū)“131”創(chuàng)新型人才培養(yǎng)工程第二層次人才。曾獲國家海洋局海洋創(chuàng)新成果獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)、海洋工程科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)。研究方向?yàn)楣I(yè)發(fā)酵生物學(xué)。正式發(fā)表學(xué)術(shù)論文91篇，含第一作者或通訊作者SCI文章32篇；出版專著1部。獲得授權(quán)專利16項(xiàng) (包括美國專利1項(xiàng))；主持包括科技部國際合作重點(diǎn)項(xiàng)目、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃子課題等項(xiàng)目10余項(xiàng)。

李德茂, 陳吳西, 郭蔚, 等. 工業(yè)生物發(fā)酵過程模擬：進(jìn)展與發(fā)展趨勢. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(10): 1974–1985.

Li DM, Chen WX, Guo W,et al. Simulation of industrial fermentation: current status and future perspectives. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1974–1985.

June 12, 2019;

September 9, 2019

Supported by: National Key Research and Development Project (No. 2018YFA0902200), STS Project of the Chinese Academy of Sciences (No.KFJ-STS-ZDTP-065), Key Project of Tianjin (No. 14ZCZDSY00157).

Demao Li. Tel/Fax: +86-22-24828745; E-mail: li_dm@tib.cas.cn

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 (No. 2018YFA0902200)，中科院STS計(jì)劃(No. KFJ-STS-ZDTP-065)，天津市科技計(jì)劃 (No. 14ZCZDSY00157) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)