發(fā)酵過程多尺度解析與調(diào)控的研究進(jìn)展

劉延峰，李雪良，張曉龍，徐顯皓，劉龍，堵國成

發(fā)酵過程多尺度解析與調(diào)控的研究進(jìn)展

劉延峰1,2，李雪良2，張曉龍1,2，徐顯皓1,2，劉龍1,2，堵國成1,2

1 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122 2 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122

工業(yè)發(fā)酵科學(xué)致力于實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量、高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強(qiáng)度的相對(duì)統(tǒng)一。通過從分子、細(xì)胞和反應(yīng)器進(jìn)行發(fā)酵過程多尺度解析與調(diào)控，實(shí)施全局與動(dòng)態(tài)的優(yōu)化與控制能夠確保發(fā)酵過程高效、轉(zhuǎn)化定向、過程穩(wěn)定和系統(tǒng)有序。本文從發(fā)酵微生物代謝途徑動(dòng)力學(xué)模型、細(xì)胞代謝特性、發(fā)酵提取相耦合與反應(yīng)器設(shè)計(jì)四個(gè)方面，總結(jié)和討論發(fā)酵過程多尺度解析與調(diào)控的研究進(jìn)展。整合分析發(fā)酵過程不同尺度特征并且針對(duì)性地開展多尺度整合調(diào)控是實(shí)現(xiàn)高效工業(yè)微生物發(fā)酵的重要策略。

動(dòng)力學(xué)模型，細(xì)胞代謝特性，發(fā)酵提取相耦合，反應(yīng)器設(shè)計(jì)

工業(yè)發(fā)酵科學(xué)是工業(yè)生物學(xué)的重要組成部分，是促進(jìn)重要生物產(chǎn)品從實(shí)驗(yàn)室制備走向工廠大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵學(xué)科。工業(yè)發(fā)酵科學(xué)致力于從分子、細(xì)胞和系統(tǒng)不同層次解析工業(yè)環(huán)境下發(fā)酵微生物行為的基本規(guī)律，提高生物制造和生物工藝效率，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量、高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強(qiáng)度的相對(duì)統(tǒng)一 (圖1)。

發(fā)酵過程主要包含分子、細(xì)胞和系統(tǒng)3個(gè)層次，這3個(gè)層次交互作用并且共同決定著發(fā)酵過程的效率。例如枯草芽孢桿菌發(fā)酵合成N-乙酰氨基葡萄糖過程中，N-乙酰氨基葡萄糖合成途徑和競(jìng)爭途徑基因表達(dá)在分子層次影響目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率；底物葡萄糖的和木糖的供給在細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)層次決定產(chǎn)物合成的效率；反應(yīng)器中攪拌轉(zhuǎn)速和溫度等條件在反應(yīng)器層次影響目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率[1]。

圖1 多尺度發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵過程的調(diào)控

發(fā)酵微生物代謝途徑動(dòng)力學(xué)模型設(shè)計(jì)與構(gòu)建、細(xì)胞代謝特性分析與發(fā)酵過程調(diào)控、發(fā)酵-提取耦合系統(tǒng)開發(fā)與應(yīng)用以及新型反應(yīng)器設(shè)計(jì) 4個(gè)方面的進(jìn)展顯著提升了工業(yè)發(fā)酵科學(xué)的技術(shù)手段，促進(jìn)了發(fā)酵過程多尺度解析與調(diào)控。本文針對(duì)上述4個(gè)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和討論，并且對(duì)發(fā)酵過程多尺度解析與調(diào)控的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 基于代謝途徑與發(fā)酵過程動(dòng)力學(xué)模型的發(fā)酵過程優(yōu)化與控制

將經(jīng)驗(yàn)轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)據(jù)模型并且預(yù)測(cè)發(fā)酵過程曲線是發(fā)酵工藝控制和優(yōu)化的重要手段 (圖2)。發(fā)酵過程代謝模型在發(fā)酵工藝控制和優(yōu)化中具有重要意義，主要應(yīng)用于以下3個(gè)方面，包括：指導(dǎo)發(fā)酵過程放大、解決大型發(fā)酵過程中不易測(cè)量數(shù)據(jù)估算的限制以及指導(dǎo)發(fā)酵工藝優(yōu)化以提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。

首先，基于代謝速率和生長動(dòng)力學(xué)相結(jié)合的發(fā)酵過程模型可用于評(píng)估反應(yīng)器放大過程中的限制條件，通過模型計(jì)算來指導(dǎo)發(fā)酵工藝調(diào)整和優(yōu)化，如pH、DO和發(fā)酵最大體積等參數(shù)優(yōu)化[2]。例如，針對(duì)絲狀真菌發(fā)酵過程，基于發(fā)酵過程模型的分析指導(dǎo)確定了不同工藝條件下的最優(yōu)發(fā)酵體積，并且在此基礎(chǔ)上開發(fā)了在線控制策略模型，成功預(yù)測(cè)了生物量等系統(tǒng)狀態(tài)[3]。另外，在ω-3脂肪酸發(fā)酵過程中，動(dòng)力學(xué)模型被用于分析、優(yōu)化以及指導(dǎo)發(fā)酵工藝放大過程，并且模型分析發(fā)現(xiàn)控制發(fā)酵工藝劃為前期生長和后期合成過程的兩階段法連續(xù)發(fā)酵可以顯著提高目的產(chǎn)物合成效率[4]。根據(jù)數(shù)值分析和流體力學(xué)原理，計(jì)算流體力學(xué)能夠輔助預(yù)測(cè)流體流動(dòng)、傳熱、傳質(zhì)以及發(fā)酵放大過程的潛在限速步驟。計(jì)算流體力學(xué)與反應(yīng)動(dòng)力學(xué)相結(jié)合能夠?yàn)榘l(fā)酵過程放大提供指導(dǎo)[5]。

其次，建立發(fā)酵模型還可以解決大型發(fā)酵過程中檢測(cè)器因位置和成本因素等限制數(shù)據(jù)獲取的限制，包括發(fā)酵罐中不同位置存在的pH和DO梯度等。例如，在700 L發(fā)酵罐中進(jìn)行乳酸發(fā)酵過程中存在pH梯度，通過產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型和流體動(dòng)力學(xué)相結(jié)合的模型，pH梯度范圍得以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)，并且用以指導(dǎo)發(fā)酵工藝優(yōu)化[6]。

圖2 代謝途徑與發(fā)酵過程動(dòng)力學(xué)模型的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

最后，發(fā)酵過程代謝模型能夠指導(dǎo)發(fā)酵工藝優(yōu)化，以提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。針對(duì)發(fā)酵過程的復(fù)雜多變的特點(diǎn)，將群體平衡模擬 (Population balance modeling) 和控制論模擬 (Cybernetic modeling) 之間進(jìn)行柔性連接，能夠使其形成系統(tǒng)性模型用以分析微生物和復(fù)雜發(fā)酵底物之間的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)關(guān)系，指導(dǎo)目的產(chǎn)物乙醇產(chǎn)量的提高[7-8]。結(jié)合Luedeking-Piret反應(yīng)和Monod生長動(dòng)力學(xué)，可對(duì)較難處理的分批發(fā)酵過程進(jìn)行簡便建模，用以計(jì)算生長和產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)[9]?；诰€性微分方程組的發(fā)酵過程動(dòng)力學(xué)模型已被成功應(yīng)用于指導(dǎo)青霉素、乙醇等典型發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)酵過程優(yōu)化與控制[10-12]。

2 針對(duì)細(xì)胞代謝特性的培養(yǎng)條件和補(bǔ)料策略優(yōu)化

通過分析細(xì)胞代謝特性鑒定影響細(xì)胞代謝的關(guān)鍵因素，然后針對(duì)細(xì)胞代謝特性進(jìn)行發(fā)酵過程補(bǔ)料和控制是發(fā)酵過程優(yōu)化的重要策略。

以枯草芽孢桿菌生產(chǎn)異源蛋白、功能糖等目標(biāo)產(chǎn)物為例，對(duì)于不同目標(biāo)產(chǎn)物需要針對(duì)性地優(yōu)化培養(yǎng)基組成和補(bǔ)料策略[13]。當(dāng)利用枯草芽孢桿菌合成人類生長激素 (hGH) 時(shí)，使用富含蛋白胨為氮源的補(bǔ)料培養(yǎng)基有助于菌體快速生長，并且使得目的蛋白產(chǎn)量提高了約3倍[14]。當(dāng)枯草芽孢桿菌用于合成N-乙酰氨基葡萄糖時(shí)，采用富含酵母粉和蛋白胨的復(fù)合培養(yǎng)基有助于提高N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量，添加尿素可進(jìn)一步顯著提高N-乙酰氨基葡萄糖的產(chǎn)量[1]。當(dāng)利用枯草芽孢桿菌合成四甲基吡嗪時(shí)，在補(bǔ)料過程中添加(NH4)2HPO4可使四甲基吡嗪產(chǎn)量提高近2倍[15]。

使用特殊基因表達(dá)調(diào)控元件時(shí)，需要針對(duì)性地優(yōu)化補(bǔ)料策略。例如采用特定條件激活啟動(dòng)子調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)時(shí)，需要優(yōu)化特定的培養(yǎng)條件和補(bǔ)料策略。相關(guān)條件激活啟動(dòng)子包括來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖饑餓誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P、磷酸鹽饑餓啟動(dòng)子P、DO饑餓型啟動(dòng)子P等[16-18]。

針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物合成過程進(jìn)行針對(duì)性且系統(tǒng)性的細(xì)胞代謝分析和前體供給平衡，能夠促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的合成。例如，優(yōu)化畢赤酵母合成granulyte- colony stimulating factor (G-CSF) 過程中，通過整合分析培養(yǎng)基優(yōu)化和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，獲得了有利于細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)合成的培養(yǎng)基，使得目的產(chǎn)物 (G-CSF) 產(chǎn)量提高5倍[19]。以束絲放線菌為宿主生產(chǎn)安絲菌素P-3時(shí)，在工程菌株強(qiáng)化前體供給的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合發(fā)酵補(bǔ)料策略強(qiáng)化前體供給，即通過在60、96和120 h間歇性補(bǔ)加15 g/L果糖和1.64 g/L異丁醇，安絲菌素產(chǎn)量顯著提高[20]。

當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物積累對(duì)于細(xì)胞生長具有一定抑制作用時(shí)，針對(duì)性補(bǔ)加能夠緩解抑制作用的物質(zhì)可以顯著促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成。例如，以出芽短梗霉作為宿主生產(chǎn)蘋果酸時(shí)，培養(yǎng)基中需要添加30 g/L的CaCO3，用以緩沖低pH對(duì)細(xì)胞的毒害作用[21-23]。另外，通過原位產(chǎn)物分離策略也可以實(shí)現(xiàn)解除有毒性的產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞生長的抑制，例如通過添加有機(jī)相來萃取目的產(chǎn)物游離脂肪酸，以減少產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞的毒害作用[24]。

3 發(fā)酵過程與提取過程相耦合的過程設(shè)計(jì)與優(yōu)化

生物合成途徑的調(diào)控機(jī)制包括誘導(dǎo)、營養(yǎng)阻遏 (包括碳、氮、磷、硫等) 和反饋調(diào)控等。其中，反饋調(diào)控是發(fā)酵與提取相耦合工藝 (product recovery/removal, ISPR) 及其優(yōu)化所依賴的理論基礎(chǔ)。它指的是代謝途徑受其自身產(chǎn)物的控制，可以是限制已有酶的活性 (反饋抑制)，或者是阻遏相關(guān)酶的繼續(xù)合成 (反饋?zhàn)瓒?。一般認(rèn)為這是微生物進(jìn)化出來的競(jìng)爭和自保機(jī)制的一種。

工業(yè)生產(chǎn)中多種初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物是具有反饋調(diào)控功能的，包括氨基酸、有機(jī)酸酸和抗生素等。例如，在大腸桿菌中，不但、和編碼的天冬氨酸激酶同工酶受到蘇氨酸、蛋氨酸和賴氨酸等終產(chǎn)物的反饋抑制，代謝途徑中的每個(gè)節(jié)點(diǎn)還受到各自中間產(chǎn)物的抑制[25]。檸檬酸對(duì)其合成途徑中的磷酸果糖激酶也有一定的抑制作用[26]。Sanchez和Demain總結(jié)了多種初級(jí)代謝產(chǎn)物反饋調(diào)控的例子[27]?？股氐睦觿t更多，且通常是直接抑制其合成途徑中最后一步或者接近最后一步的酶，在此不再贅述。有些次級(jí)代謝產(chǎn)物還能首先通過物理和化學(xué)的機(jī)制對(duì)菌體產(chǎn)生破壞作用，比如乳酸乳球菌素Nisin[28-30]。Nisin是乳酸乳球菌分泌的一種小分子多肽，由于其對(duì)革蘭氏陽性菌具有很強(qiáng)的抑制作用，而作為多肽在人的消化道可以被迅速分解，常作為一種安全的防腐劑用于肉制品和奶制品中。其作用機(jī)理是通過與細(xì)胞膜中的磷脂及磷脂前體相結(jié)合，干擾細(xì)胞膜平衡離子濃度及pH的功能，造成胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，破壞細(xì)菌的生理功能。與此類似但更加復(fù)雜的是傳統(tǒng)丙酮-丁醇-乙醇發(fā)酵中 (ABE fermentation) 3種溶劑尤其是丁醇對(duì)生產(chǎn)菌丙酮丁醇酸菌的抑制[31]。ABE發(fā)酵在二戰(zhàn)前曾是世界最大的生物產(chǎn)業(yè)，但戰(zhàn)后隨著石油工業(yè)的興起及原料成本的增加而迅速失去了競(jìng)爭力[32]。其中由于產(chǎn)物抑制，總?cè)軇舛炔怀^18–20 g/L，后期分離提取能耗較高也是其中的一個(gè)原因。近年來，由于化石燃料面臨枯竭及其對(duì)自然環(huán)境的巨大破壞，人們開始重新探索生物方法生產(chǎn)可再生能源，ABE發(fā)酵再次引起了研究人員的興趣。在2009年時(shí)，我國仍有至少12家ABE發(fā)酵工廠[33]，之后又有十幾家新建或者恢復(fù)生產(chǎn)[34]。

雖然通過基因工程的方法可以在一定程度上改進(jìn)生產(chǎn)菌對(duì)產(chǎn)物的耐性[35]，但這與發(fā)酵提取相耦合的工藝并不矛盾，甚至是相輔相成的。在抗生素的生產(chǎn)中，ISPR通常采用膜分離或者是液-液萃取的方式[36]，其他產(chǎn)品還有用到結(jié)晶[37]。前面提到的Nisin傳統(tǒng)上是分批培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后通過泡沫分離進(jìn)行提取[38]。Zheng等[39]發(fā)現(xiàn)，將泡沫分離與發(fā)酵工程相結(jié)合，在線提取Nisin可以明顯提高底物利用率和產(chǎn)量。關(guān)于ABE發(fā)酵-提取相耦合的研究則更多，幾乎所有常規(guī)的分離提取技術(shù)都有嘗試，包括液-液萃取、滲透萃取、精餾、滲透蒸發(fā)、氣提等[40-41]。美國現(xiàn)在仍在運(yùn)行的唯一ABE發(fā)酵工廠明尼蘇達(dá)州的Green Biologics采用的是低溫真空精餾連續(xù)培養(yǎng)，其工藝流程應(yīng)與圖3所示類似。為了進(jìn)一步降低氣相中溶劑的分壓，還可以在精餾塔中注入惰性氣體[42]，相當(dāng)于氣提與精餾相結(jié)合。實(shí)際上，發(fā)酵與一種以上分離提取技術(shù)相耦合的情況并不少見。同樣在可再生能源的大環(huán)境下興起的合成氣發(fā)酵(Syngas fermentation) 也面臨傳統(tǒng)ABE發(fā)酵類似的問題。Phillips等給出的過程流程圖就使用了超濾和精餾兩種技術(shù)[43]，簡化后如圖4所示。圖3、圖4各代表了ISPR回收目標(biāo)產(chǎn)物的兩種基本思路：直接接觸式和間接接觸式。

除上述目標(biāo)產(chǎn)物的反饋調(diào)控，發(fā)酵過程中最常見的副產(chǎn)物CO2對(duì)微生物的生長和代謝也有很大的影響。Shimoda等[44]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母在CO2的作用下呈現(xiàn)一階線性死亡動(dòng)力學(xué)特性。溶解的CO2對(duì)青霉素生產(chǎn)菌的影響較為復(fù)雜：在延遲生長期，低水平的CO2能促進(jìn)菌的生長，但是以犧牲青霉素的產(chǎn)率為代價(jià)。較高的CO2溶解度則會(huì)嚴(yán)重抑制底物的攝取，造成生產(chǎn)菌形態(tài)學(xué)上的變化，影響目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[45]。在好氧發(fā)酵中，通過監(jiān)測(cè)呼吸商(Respiratory quotient, RQ) 來推算反應(yīng)器內(nèi)生物代謝狀態(tài)是多尺度發(fā)酵控制的經(jīng)典案例[46-47]。在合成氣發(fā)酵中，雖然CO2是Wood Ljungdahl路徑的底物，但推動(dòng)反應(yīng)進(jìn)行的能源是由一氧化碳在一氧化碳脫氫酶(CODH) 的催化下還原鐵氧化還原蛋白來提供的[48-50]，如圖5所示。此外，氫氣在氫化酶的催化下被氧化也能提供一部分能量。原料氣H2和CO的比例決定整個(gè)反應(yīng)的最終結(jié)果是否有CO2排出以及各個(gè)產(chǎn)物之間的比例[51]。Simpson等[52]通過提高CO2的溶解度將產(chǎn)品導(dǎo)向2,3-丁二醇。相反，降低CO2分壓則應(yīng)有利于目標(biāo)產(chǎn)物乙醇的合成。從發(fā)酵液中分離溶解的CO2可以使用選擇性膜分離技術(shù)，但成本和能耗較高，得不償失，目前未見報(bào)道。帝國化學(xué)工業(yè)(ICI) 在20世紀(jì)70年代末曾轟動(dòng)一時(shí)的大規(guī)模單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)所用60 m高的氣升式反應(yīng)器，則是利用從底部到頂部高達(dá)303.975 kPa 靜壓差使溶解的CO2析出，使循環(huán)到底部的發(fā)酵液含有較低的CO2，達(dá)到緩解其對(duì)生產(chǎn)菌抑制的效果[53]。

圖3 真空精餾與發(fā)酵過程相耦合在線提取揮發(fā)性產(chǎn)物示意圖

圖4 合成氣連續(xù)發(fā)酵與過濾、精餾相耦合流程示意圖[42]

當(dāng)然，發(fā)酵-提取相耦合也并不能適用于所有的發(fā)酵。使用基因重組大腸桿菌以果糖為原料生產(chǎn)的乙酸紫蘇酯的中間產(chǎn)品檸檬烯是不溶于水的，而且在很低濃度下即可完全抑制大腸桿菌的生長。一般的思路是在反應(yīng)器內(nèi)添加有機(jī)相來萃取檸檬烯。然而，由于檸檬烯在有機(jī)相中分配系數(shù)過高，這反而阻斷了反應(yīng)的進(jìn)行。Willrodt等[54]把檸檬烯的合成路徑與乙酸紫蘇酯的合成路徑分別在兩個(gè)大腸桿菌菌株中實(shí)現(xiàn)，然后以特定的比例將兩個(gè)菌株混合培養(yǎng)，對(duì)檸檬烯生產(chǎn)菌來講相當(dāng)于產(chǎn)物在線提取，而對(duì)乙酸紫蘇脂生產(chǎn)菌來講相當(dāng)于補(bǔ)料培養(yǎng)，很好地解決了檸檬烯溶解度低和生長抑制的問題。類似的例子并不多，可以說Willrodt等的工作為解決難溶、易揮發(fā)的中間產(chǎn)物抑制提供了一個(gè)新的思路。

圖5 簡化的Wood Ljungdahl路徑固定CO2示意圖，包括向乙醇、乙酸、2,3-丁二醇的延伸

有些微生物還會(huì)依據(jù)培養(yǎng)環(huán)境中的菌體濃度調(diào)節(jié)基因表達(dá)，但一般不被歸納到反饋調(diào)節(jié)，而是自動(dòng)誘導(dǎo)，因?yàn)槠湓硎腔诰w自身分泌的微量信號(hào)物質(zhì)——自動(dòng)誘導(dǎo)因子。如果需要延長對(duì)數(shù)生長期進(jìn)而得到更高的菌體濃度，將自動(dòng)誘導(dǎo)因子的濃度控制在較低水平的方法與發(fā)酵-分離相耦合是一致的。總之，發(fā)酵與分離相耦合本質(zhì)上是為了達(dá)到系統(tǒng)中菌體停留時(shí)間 (Cell retention time) 與水力停留時(shí)間 (Hydraulic retention time) 解耦，進(jìn)而使發(fā)酵產(chǎn)物可以獨(dú)立于菌體濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，給代謝調(diào)控更大的操作空間。

4 針對(duì)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)優(yōu)化的反應(yīng)器設(shè)計(jì)

發(fā)酵微生物代謝過程是生物反應(yīng)器的核心和基礎(chǔ)，生物反應(yīng)器服務(wù)于細(xì)胞代謝與產(chǎn)物合成。因此，針對(duì)發(fā)酵微生物代謝的特點(diǎn)設(shè)計(jì)反應(yīng)器能夠顯著提升發(fā)酵過程的效率。在小型和微型生物反應(yīng)器中，保持發(fā)酵參數(shù)的均一性相對(duì)容易[55]，但在工業(yè)規(guī)模的大型裝置中，其不均一性是不可忽視的[56-57]。解決方法只能是針對(duì)生產(chǎn)菌的代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行反應(yīng)器優(yōu)化設(shè)計(jì)。我國科研人員[47]根據(jù)計(jì)算流體力學(xué)(CFD) 模擬結(jié)果，將一個(gè)12 m3攪拌釜反應(yīng)器的徑向流攪拌槳更換成組合式的軸流攪拌槳來提高氣液兩相的混合效率，這不但顯著降低了攪拌能耗，還使頭孢霉素C的產(chǎn)量提高了15%。之后，該實(shí)驗(yàn)室與Haring等[58]合作，通過CFD模擬與底物消耗動(dòng)力學(xué)相結(jié)合，預(yù)測(cè)在一個(gè)54 m3的反應(yīng)器內(nèi)，底物濃度梯度的存在能造成18%–46%的產(chǎn)黃青霉素得率損失 (與完全混合的理想反應(yīng)器相比)。經(jīng)進(jìn)一步研究，他們將CFD與更為復(fù)雜的代謝動(dòng)力學(xué)模型相結(jié)合，提出了理性生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)策略[59]，如圖6所示。University of Massachusetts Amherst與LanzaTech合作將基因組規(guī)模代謝模型 (Flux balance analysis) 與流體力學(xué)、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和傳質(zhì)模型相結(jié)合，對(duì)活塞流鼓泡塔合成氣發(fā)酵進(jìn)行了研究[60-61]。

在特定情況下，反應(yīng)器內(nèi)底物的梯度可能產(chǎn)生有利的結(jié)果。Enfors等[62]用流式細(xì)胞儀觀測(cè)到在大規(guī)模反應(yīng)器以及模型縮小反應(yīng)器的動(dòng)態(tài)環(huán)境的誘導(dǎo)下，大腸桿菌細(xì)胞的完整性得到了提升。有此類代謝特性的系統(tǒng)，可以考慮使用活塞流反應(yīng)器，或者是多級(jí)反應(yīng)器串聯(lián)發(fā)酵。南京工業(yè)大學(xué)團(tuán)隊(duì)通過動(dòng)力學(xué)模擬，優(yōu)化了2–3級(jí)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)二十二碳六烯酸 (DHA) 工藝，取得了比普通補(bǔ)料分批發(fā)酵高出將近一倍的產(chǎn)量[63]。合成氣發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇工藝是通過反應(yīng)器設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行精確代謝調(diào)控的經(jīng)典例子[60-61]。如圖5所示，Woold Ljungdahl路徑下從乙酰輔酶A經(jīng)乙酸、乙醛到乙醇這一分支上，乙酸的合成產(chǎn)生ATP有利于菌體生長，而目標(biāo)產(chǎn)物乙醇的合成則需要消耗還原當(dāng)量，與菌體生長是競(jìng)爭關(guān)系。這一步的調(diào)控，對(duì)維持系統(tǒng)的穩(wěn)定性和產(chǎn)物的選擇性起著關(guān)鍵的作用。還原乙酸到乙醛的鐵氧還蛋白氧化還原酶以及催化乙醛成乙醇的醇還原酶通常都是過量表達(dá)的，對(duì)產(chǎn)物選擇性沒有太大的影響，反應(yīng)基本上是受還原當(dāng)量[H]的濃度決定[49]。還原當(dāng)量主要來自于一氧化碳脫氫酶催化的COàCO2這一步反應(yīng)，而這一步反應(yīng)又直接受反應(yīng)器傳質(zhì)速率的控制，所以反應(yīng)器的設(shè)計(jì)就直接決定了發(fā)酵的效果。

圖6 理性反應(yīng)器設(shè)計(jì)工作流程

總之，無論是以有機(jī)物為底物的傳統(tǒng)發(fā)酵，還是近年來興起的氣體發(fā)酵，反應(yīng)器的設(shè)計(jì)影響底物、產(chǎn)物、pH甚至溫度等在反應(yīng)器內(nèi)的分布，對(duì)代謝調(diào)控有直接或者間接的影響。有時(shí)候，僅僅是改變一下進(jìn)料位置，就能顯著提高發(fā)酵的性能[66]。優(yōu)化反應(yīng)器設(shè)計(jì)能提高產(chǎn)量，降低能耗和成本，減少廢物排放。它涉及到合成生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、流體力學(xué)、材料、機(jī)械、電子、計(jì)算機(jī)等多個(gè)學(xué)科，進(jìn)一步將多學(xué)科深度融合是發(fā)酵產(chǎn)業(yè)邁向現(xiàn)代化的發(fā)展方向。

5 結(jié)論

針對(duì)工業(yè)發(fā)酵過程分子、細(xì)胞和系統(tǒng)3個(gè)層次，發(fā)酵過程多尺度解析與調(diào)控在發(fā)酵微生物代謝途徑動(dòng)力學(xué)模型設(shè)計(jì)與構(gòu)建、細(xì)胞代謝特性分析與發(fā)酵過程調(diào)控、發(fā)酵-提取相耦合系統(tǒng)開發(fā)與應(yīng)用以及新型反應(yīng)器設(shè)計(jì)4個(gè)方面取得了顯著的進(jìn)展，促進(jìn)了工業(yè)發(fā)酵過程高產(chǎn)量、高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強(qiáng)度的實(shí)現(xiàn)。未來研究中，進(jìn)一步從以下3個(gè)方面開展研究能夠提升基于多尺度發(fā)酵條件的過程優(yōu)化與控制：1) 建立工業(yè)規(guī)模多尺度實(shí)時(shí)生物感應(yīng)系統(tǒng)，包括在分子尺度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)代謝途徑的生物感應(yīng)器，在細(xì)胞尺度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)特性的生物感應(yīng)器，在反應(yīng)器尺度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)多種代謝物濃度及多種發(fā)酵參數(shù)的在線檢測(cè)系統(tǒng)；2) 建立發(fā)酵過程大數(shù)據(jù)系統(tǒng)，使細(xì)胞生理代謝特性可視化，建立基于大數(shù)據(jù)指導(dǎo)下的發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵過程優(yōu)化；3) 建立智能化高效發(fā)酵與分離耦合過程，提升發(fā)酵過程與分離過程的適配性與協(xié)調(diào)性，提升發(fā)酵過程的智能化控制。綜上所述，進(jìn)一步整合分析發(fā)酵微生物不同尺度特征并且針對(duì)性地開展多尺度整合調(diào)控能夠提升工業(yè)微生物發(fā)酵的效率并且拓展生物制造的應(yīng)用范圍。

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Advances in multi-scale analysis and regulation for fermentation process

Yanfeng Liu1,2, Xueliang Li2, Xiaolong Zhang1,2, Xianhao Xu1,2, Long Liu1,2, and Guocheng Du1,2

1,,,214122,,2,,,214122,,

Industrial fermentation focuses on realizing the uniform of high titer, high yield, and high productivity. Multi-scaleanalysis and regulation, including molecule level, cell level, and bioreactor level, facilitate global optimization and dynamic balance of fermentation process, which determine high efficiency of biosynthesis, targeted directionality of bioconversion, process robustness, and well-organized system. In this review, we summariz and discuss advances in multi-scale analysis and regulation for fermentation process focusing on the following four aspects: 1) kinetic modeling of metabolic pathways, 2) characteristic of cell metabolism, 3) co-coupling fermentation and purification, and 4) bioreactor design. Integrating multi-scaleanalysis of fermentation process and integrating multi-scale regulation are expected as an important strategy for realizing highly efficient fermentation by industrial microorganisms.

kinetic modeling, characteristics of cell metabolism, co-coupling fermentation and purification, bioreactor design

10.13345/j.cjb.190244

堵國成 教授，博士生導(dǎo)師，教育部長江學(xué)者特聘教授、國家“萬人計(jì)劃”教學(xué)名師，長期從事工業(yè)微生物發(fā)酵領(lǐng)域的科研和教學(xué)工作。作為項(xiàng)目負(fù)責(zé)人承擔(dān)包括國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、國家863項(xiàng)目、科技部重點(diǎn)領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目和教育部長江學(xué)者創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目等在內(nèi)的國家和部省級(jí)項(xiàng)目8項(xiàng)。獲國家技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)2項(xiàng)、國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)1項(xiàng)，部省級(jí)科技成果一等獎(jiǎng)5項(xiàng)，中國專利金獎(jiǎng) 1項(xiàng)。擔(dān)任、副主編，編委。

劉延峰, 李雪良, 張曉龍, 等. 發(fā)酵過程多尺度解析與調(diào)控的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(10): 2003–2013.

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June 11, 2019;

September 23, 2019

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(本文責(zé)編 郝麗芳)