Twist表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征及其轉(zhuǎn)移的關(guān)系

李　艷　伊　航　李錦明　何智圣

430070 中國(guó)建筑第三工程局武漢中心醫(yī)院

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Twist表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征及其轉(zhuǎn)移的關(guān)系

李艷伊航李錦明何智圣

430070 中國(guó)建筑第三工程局武漢中心醫(yī)院

【摘要】目的探討Twist表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征及其轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法納入骨肉瘤患者100例，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法，檢測(cè)Twist在不同病理類(lèi)型骨肉瘤中的表達(dá)；并檢測(cè)骨肉瘤轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組患者Twist表達(dá)情況。結(jié)果Twist表達(dá)主要位于細(xì)胞的胞質(zhì)中，在骨肉瘤組織中其陽(yáng)性率為83%；骨肉瘤惡性程度低組與惡性程度高組其表達(dá)情況具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但不同病理類(lèi)型的骨肉瘤病理組織中其表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Twist在轉(zhuǎn)移組骨肉瘤患者中陽(yáng)性率為93.1%，在非轉(zhuǎn)移組中陽(yáng)性率為46.2%，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論Twist與骨肉瘤的發(fā)病密切相關(guān)，可作為臨床判斷骨肉瘤的輔助性指標(biāo)，對(duì)臨床的診治及預(yù)后的判斷具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】Twist；骨肉瘤；病理分型；腫瘤轉(zhuǎn)移

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:548～551)

骨肉瘤的發(fā)病率是惡性骨腫瘤中發(fā)病率的首位，其發(fā)病年齡偏低，多為10~20歲的青少年，主要好發(fā)在長(zhǎng)骨的骨干，男性患者多于女性，其主要的病理特點(diǎn)就是能產(chǎn)生大量的梭形腫瘤細(xì)胞，其惡性程度高，進(jìn)展迅速，主要的治療方法是手術(shù)配合化療，但是其復(fù)發(fā)率高，生存率低，對(duì)患者的生存質(zhì)量產(chǎn)生重大的影響[1-2]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，該病與相關(guān)基因的激活及抑癌基因的失活具有密切的相關(guān)性，近年來(lái)Twist基因不斷被人們所認(rèn)識(shí)，該基因是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，特別是對(duì)于腫瘤的轉(zhuǎn)移有著重要的影響，但是目前對(duì)于該基因在骨肉瘤的影響報(bào)道尚少[3-4]。本研究采用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)Twist基因在人類(lèi)骨肉瘤中的不同分型中的表達(dá)差異，結(jié)合病理分型和分級(jí)對(duì)表達(dá)差異情況進(jìn)行研究，并搜集所納入研究的患者術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移及非轉(zhuǎn)移情況，評(píng)價(jià)其對(duì)骨肉瘤轉(zhuǎn)移的影響，為進(jìn)一步闡明該基因在骨肉瘤的發(fā)病、預(yù)后中的作用，也為今后的基因靶向治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1一般資料

納入我院2012年1月至2013年1月確診為骨肉瘤的患者100例，其中男性69例，女性31例，平均年齡(26.25±10.23)歲，所有納入研究的骨肉瘤患者均手術(shù)后取活檢，其中在股骨38例，脛骨24例，肱骨14例，腓骨12例，上下頜骨10例，跟骨2例，在術(shù)前均未進(jìn)行化療，且未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。所有的獲取的標(biāo)本經(jīng)HE染色按組織學(xué)分型，可分為軟骨母細(xì)胞型26例、骨母細(xì)胞型24例、纖維母細(xì)胞型36例、混合型14例。根據(jù)惡性程度進(jìn)行分級(jí)分為3級(jí)：其中1級(jí)26例，2級(jí)40例，3級(jí)34例，對(duì)患者進(jìn)行隨訪(fǎng)2年，其中轉(zhuǎn)移組為2年內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或因轉(zhuǎn)移瘤而死亡的患者共58例，非轉(zhuǎn)移組為術(shù)后未發(fā)生轉(zhuǎn)移并且生存期超過(guò)2年的共26例，失訪(fǎng)患者為16例。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《骨科腫瘤學(xué)》[5]對(duì)骨肉瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行制定。

1.3納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合本病診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡3～60歲；③依從性強(qiáng)，愿意接受本臨床研究。

1.4排除標(biāo)準(zhǔn)

①年齡<3歲或>60歲的患者，妊娠期、哺乳期的患者；②有嚴(yán)重其他系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤的患者；③不愿意接受本臨床研究，依從性差的患者。

1.5方法與試劑

1.5.1主要試劑、細(xì)胞與儀器試劑：免疫組化試劑盒(武漢博士德)，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(上海碧云天生物)，抗體：Twist兔單克隆IgG和β-actin小鼠多克隆IgG(美國(guó)Santa Cruz公司)。

儀器：倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，高轉(zhuǎn)速冷凍離心機(jī)(德國(guó)BiofugeStratos)，-80 ℃-4 ℃冰箱(日本松下)。

1.5.2免疫組化方法采用SP免疫組織化學(xué)方法，取二甲苯脫蠟后的骨肉瘤組織切片，無(wú)水乙醇分級(jí)水化，以0.01 mol/L PBS洗3次，40 g/L的多聚甲醛固定15 min，體積分?jǐn)?shù)3%的雙氧水消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶15 min，50 μl非免疫動(dòng)物血清封閉，加50 μl Twist一抗過(guò)夜，50 μl生物素標(biāo)記第二抗體，辣根過(guò)氧化物酶孵育，DBA顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠固封。結(jié)果判定：陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞胞質(zhì)胞膜在倒置顯微鏡下出現(xiàn)深棕黃色的染色，平均光密度應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行測(cè)量。

1.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定

陽(yáng)性結(jié)果判定：Twist染色顆粒位于胞質(zhì)之中。通過(guò)顯微鏡10×40倍視野，每張切片對(duì)應(yīng)隨機(jī)納入10個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，25%～50%為陽(yáng)性(++)，0～25%為弱陽(yáng)性(+)，未著色為陰性(-)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1Twist在骨肉瘤組織中的表達(dá)

觀(guān)察Twist在骨肉瘤中的表達(dá)，結(jié)果顯示，免疫組化陽(yáng)性染色位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也有位于細(xì)胞核內(nèi)，呈棕色或者褐色，100例骨肉瘤組織中83例陽(yáng)性染色，其中弱陽(yáng)性20例，中度陽(yáng)性28例，強(qiáng)陽(yáng)性35例，與正常人體組織Twist表達(dá)相比較具有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　Twist在骨肉瘤組織中的表達(dá)/例

注：①為與正常對(duì)照組相比，P<0.05。

2.2Twist表達(dá)與骨肉瘤病理類(lèi)型的相關(guān)性

研究結(jié)果顯示，Twist在骨肉瘤不同病理組織類(lèi)型中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2　Twist表達(dá)與骨肉瘤病理類(lèi)型的相關(guān)性(例，%)

2.3Twist 在不同惡性分級(jí)骨肉瘤的表達(dá)情況

骨肉瘤根據(jù)惡性程度分為3級(jí)，其中1級(jí)26例中有14例Twist陽(yáng)性，2級(jí)40例中有36例為陽(yáng)性，3級(jí)34例中有33例為陽(yáng)性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)3級(jí)中Twist陽(yáng)性率高于2級(jí)和1級(jí)的，2級(jí)Twist陽(yáng)性率又高于1級(jí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3　Twist在不同惡性分級(jí)骨肉瘤中的表達(dá)情況(例，%)

注：與1級(jí)相比，①為P<0.05；與2級(jí)比較，②為P<0.05。

2.4Twist 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中表達(dá)差異性情況

Twist在轉(zhuǎn)移組骨肉瘤患者中陽(yáng)性率為93.1%，在非轉(zhuǎn)移組中其陽(yáng)性率為46.2%，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4　Twist 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中表達(dá)差異性

3討論

骨肉瘤是起源于間葉組織，為青少年最常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨瘤，大多數(shù)情況下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不成熟的骨質(zhì)或骨，其發(fā)展迅速，主要病變部位位于長(zhǎng)骨干骷端，侵襲性強(qiáng)，可出現(xiàn)全部組織器官的轉(zhuǎn)移，肺部轉(zhuǎn)移較為常見(jiàn)，該病預(yù)后較差，經(jīng)積極治療后5年的存活率僅為70%[6-7]。目前主要的治療方法是手術(shù)及全身化療的綜合治療方法，但是還是存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能，給患者造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，由于疾病發(fā)病隱匿，進(jìn)展很快，很多患者就診時(shí)已到達(dá)晚期，同時(shí)目前還缺乏骨肉瘤的診斷和治療靶標(biāo)，因此尋找生物學(xué)靶標(biāo)對(duì)于疾病的診治至關(guān)重要，本研究為探求該病的侵襲機(jī)制，尋找靶點(diǎn)基因與疾病的相關(guān)性，對(duì)該病的治療和預(yù)后判斷提供一定的指導(dǎo)價(jià)值[8]。目前，僅少量報(bào)道關(guān)于骨肉瘤中Twist 的表達(dá)情況，但缺乏對(duì)Twist 與骨肉瘤關(guān)系的更深入研究和病例報(bào)道，本研究對(duì)骨肉瘤的深入研究具有重要的研究意義[9-10]。

目前研究顯示， Twist基因?qū)儆?種高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，已被發(fā)現(xiàn)其該基因存在于鼠類(lèi)、果蠅、魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物等多種動(dòng)物體內(nèi)[11]。最新的幾年研究發(fā)現(xiàn)Twist可作為1種癌基因，不僅是是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變過(guò)程中的關(guān)鍵因子，且Twist與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡，其高表達(dá)可能促進(jìn)癌細(xì)胞的惡化，可以視為1種癌基因和凋亡抑制蛋白，表達(dá)水平與腫瘤各亞型的惡性程度也密切相關(guān)，可抑制凋亡呈現(xiàn)出抗凋亡的激活，增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡能力[12-14]。有研究表明該基因可以通過(guò)多條通路抑制癌基因的正常表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抑制癌細(xì)胞凋亡的作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。已有的研究包括前列腺癌、胃癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌、食管癌等，但是在骨肉瘤中的研究尚少[15]。研究還證實(shí)了該基因及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)，通過(guò)降低黏附蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平，從而有助于腫瘤的侵襲，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成[16-17]。因此，Twist不僅與腫瘤形成有關(guān)，還與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，Twist表達(dá)主要位于細(xì)胞的胞質(zhì)中，在骨肉瘤患者的組織中陽(yáng)性率為83%，這說(shuō)明該基因在骨肉瘤中具有高表達(dá)的表現(xiàn)，其可能的機(jī)制是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)；骨肉瘤低級(jí)與高級(jí)組的表達(dá)情況之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明該基因在病理分型表達(dá)沒(méi)有差別，但不同分型的骨肉瘤病理組織的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Twist在轉(zhuǎn)移組的骨肉瘤患者中陽(yáng)性率為93.1%，在非轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性率為46.2%，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這也提示了該基因可能參與了骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程。

綜上所述，我們推測(cè)，Twist可能通過(guò)其抑制細(xì)胞凋亡和促侵襲的作用對(duì)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮調(diào)控作用。本研究闡明了骨肉瘤的分子相關(guān)性，但是其主要的發(fā)病機(jī)制有待于深入的研究，同時(shí)通過(guò)本研究也為骨肉瘤的臨床診斷和預(yù)后判斷提供了新的策略方法，確定了Twist與骨肉瘤的相關(guān)性，研究了不同病理分型和分級(jí)對(duì)其表達(dá)的差異，探討了該基因?qū)侨饬龅纳飳W(xué)相關(guān)性，也為今后進(jìn)一步對(duì)骨肉瘤的診治提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Maestro R,Salerno P,Garcia-Rostan G,et al.TWIST1 plays a pleiotropic role in determining the anaplastic thyroid cancer phenotype〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2011,96(5):772-781.

[2]Shi J,Severson C,Yang J,et al.Snail2 controls mesodermal BMP/Wnt induction of neural crest〔J〕.Development,2011,138(15):3135-3145.

[3]Nowak SJ,Aihara H,Gonzalez K,et al.Akirin Links Twist-Regulated Transcription with the Brahma Chromatin Remodeling Complex during Embryogenesis〔J〕.PLoS Genetics,2012,8(3):1-16.

[4]Danciu TE,Li Y,Koh A,et al.The basic helix loop helix transcription factor Twist1 is a novel regulator of ATF4 in osteoblasts〔J〕.J Cell Biochem,2012,113(1):70-79.

[5]徐萬(wàn)鵬,馮傳漢.骨科腫瘤學(xué)〔M〕.第2版.北京:人民軍醫(yī)出版社,2008:211.

[6]Franco HL,Casasnovas J,Rodríguez-Medina JR,et al.Redundant or separate entities roles of Twist1 and Twist2 as molecular switches during gene trans-cription〔J〕.Nucleic Acids Res,2011,39(4):1177-1186.

[7]張永亮,何濤.Twist-腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥的新因子〔J〕.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,33(4):462-464.

[8]De Marco P,Raso A,Beri S,et al.A de novo balanced translocation t(7;12)(p21.2;p12.3)in a patient with Saethre-Chotzen-like phenotype downregulates TWIST and an osteoclastic protein-tyrosine phosphatase,PTP-oc〔J〕.Eur J Med Genet,2011,54(5):478-483.

[9]Warren C,Wallace W,Campbell WJ.Splenic laceration wi-

th a twist:a lesson learnt from gastric volvulus〔J〕.Ann R Coll Surg Engl,2012,94(2):88-89.

[10]Jerónimo C,Esteller M.DNA methylation markers for prostate cancer with a stem cell twist〔J〕.Cancer Prev Res(Phila),2010,3(9):1053-1055.

[11]Fu J,Zhang L,He T,et al.TWIST represses estrogen receptor-alpha expression by recruiting the NuRD protein complex in breast cancer cells〔J〕.Int J Biol Sci,2012,8(4):522-532.

[12]Gao Y,Xuan XY,Zhang HY,et al.Relationship between TWIST expressions and epithelial-mesenchymal transition of esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Cell Biol Int,2012,23(6):488-496.

[13]Yang J,Eckert MA.Targeting invadopodia to block breast cancer metastasis 〔J〕.Oncotarget,2011,2(7):562-568.

[14]Pinho AV,Rooman I,Real FX.p53-dependent regulation of growth,epithelial mesenchymal transition and stemness in normal pancreatic epithelial cells〔J〕.Cell Cycle,2011,10(8):1312-1321.

[15]Wallerand H,Robert G,Pasticier G,et al.The epithelial-mesenchymal transition inducing factor TWIST is an attractive target in advanced and/or metastatic bladder and prostate cancers〔J〕.Urol Oncol,2010,28(5):473-479.

[16]Chang LH,Chen CH,Huang DY,et al.Thrombin induces -

expression of twist and cell motility via the hypoxia-inducible factor-1αtranslational pathwa yin colorectal cancer cells〔J〕.J Cell Physiol,2011,226(4):1060-1068.

[17]Yin G,Alvero AB,Craveiro V,et al.Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial-ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential〔J〕.Oncogene,2012,32(1):39-49.

(編輯：吳小紅)

Relation between Twist Expression and Clinicopathological Features and Metastasis of Osteosarcoma

LIYan,YINHang,LIJinming,etal.ChinaConstructionThirdEngineeringBureauWuhanCentralHospital,Wuhan,430070

【Abstract】ObjectiveTo study the relation between Twist expression and clinicopathological features and metastasis of osteosarcoma.Methods100 patients with osteosarcoma were collected,immunohistochemical staining method was used to detect Twist expression in different pathological types of osteosarcoma;and Twist expression of osteosarcoma metastasis patients and non-metastasis patients were detected.ResultsTwist expression was mainly located in the cytoplasm,its positive rate was 83% in osteosarcoma;Twist expression between osteosarcoma low malignancy group and high malignancy group had significant difference (P<0.05),but Twist expression in different pathological types of osteosarcoma had no significant difference (P>0.05);Twist positive rate in patients with osteosarcoma metastasis was 93.1%,in the non-metastasis group was 46.2%,there had statistical difference (P<0.05).ConclusionTwist is closely associated with the incidence of osteosarcoma,it can be secondary indicators for clinical judgment of osteosarcoma,and it has guiding value for the diagnosis and prognosis of clinical significance.

【Key words】Twist;Osteosarcoma;Pathological classification;Tumor metastasis

(收稿日期2015-07-17修回日期 2016-03-04)

中圖分類(lèi)號(hào)：R738.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)04-0548-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.008

通訊作者：何智圣