耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)及計數(shù)的研究進(jìn)展

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·綜述·

耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)及計數(shù)的研究進(jìn)展

肖茜1劉洋1閔美平1榮威林2綜述張志遠(yuǎn)1審校

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-2-116:19

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哺乳動物及人的耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(spiral ganglion cells，SGCs)位于耳蝸骨螺旋板和蝸軸基部的Rosenthal小管內(nèi)，其外周突通過骨螺旋板內(nèi)的小管進(jìn)入螺旋器分布于內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞。SGCs的主要功能是將耳蝸毛細(xì)胞機(jī)電轉(zhuǎn)換的信息向聽覺系統(tǒng)各級中樞傳遞[1]。內(nèi)耳受損后會以SGCs數(shù)目變化為特征表現(xiàn)，噪聲、年齡老化和耳毒性藥物等損傷因素均會造成SGCs突觸退化、軸索變性及胞體的損傷，從而影響聽力，造成人類不同程度的交流障礙[2]。對耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及計數(shù)能更好地研究耳蝸受損后的病理生理機(jī)制和定量反映內(nèi)耳的損傷程度，因此，本文就近年來關(guān)于耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)及計數(shù)研究進(jìn)展綜述如下。

1耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)的研究

1.1螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的正常形態(tài)及數(shù)目螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是耳蝸聽覺傳導(dǎo)通路的重要組成部分，其將毛細(xì)胞的機(jī)械振動轉(zhuǎn)換為電信號進(jìn)而傳入聽覺中樞產(chǎn)生聽覺。聽覺傳導(dǎo)通路的任何部位病變都將影響聽功能[3～5]。不同物種，如：人[4]、貓[6]、鼠[7]、猴[8]等的SGCs形態(tài)結(jié)構(gòu)是相似的，但數(shù)目卻不同，不同種屬的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目見表1[9～11]；從表中可見不同物種在不同計數(shù)方法下的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目不同。根據(jù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)及其周圍突的不同，可將SGCs分為Ⅰ型和Ⅱ型神經(jīng)元。Ⅰ型神經(jīng)元胞體較大，為雙極神經(jīng)元，占神經(jīng)節(jié)細(xì)胞總數(shù)的90%～95% , 胞體內(nèi)富含核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，胞核大而圓，顏色較暗沉，位于胞體中心，胞體及周圍突有髓鞘包繞，周圍突與內(nèi)毛細(xì)胞底部共同構(gòu)成匯聚型突觸聯(lián)系；Ⅱ型神經(jīng)元胞體較Ⅰ型細(xì)胞小，形態(tài)多變，為雙極或假單極，占總數(shù)的5%～10%，其胞質(zhì)為高度細(xì)絲狀，細(xì)胞器較少，其細(xì)胞核顏色較深，胞核可呈分葉狀，位置多變，一般無髓鞘或僅有薄層髓鞘包繞，周圍突與外毛細(xì)胞形成突觸聯(lián)系[4,12,13]。通過光鏡定位Rosenthal 小管，發(fā)現(xiàn)其中細(xì)胞核大而核仁明顯者即為SGCs[14]；如果想鑒別SGCs的兩種細(xì)胞類型，則需用電鏡觀察其形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)分[7]。

表1　不同物種的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目

1.2螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷后形態(tài)及聽功能變化聽覺系統(tǒng)老化、耳毒性藥物、強(qiáng)噪聲等因素均可導(dǎo)致內(nèi)耳組織，如：毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、支持細(xì)胞等出現(xiàn)凋亡、壞死[15]。在年齡相關(guān)性變化中，劉強(qiáng)和等[16]觀察到小鼠的SGCs胞體變小，周圍髓鞘崩解斷裂，部分細(xì)胞胞核濃縮，并且計數(shù)TUNEL染色陽性率，即凋亡細(xì)胞的比率約為11.364%±4.96%，其ABR反應(yīng)閾提高了20 dB；獼猴隨年齡增長SGCs的密度減小，并且高頻聽力逐漸下降[8]；聶深等[17]給小鼠注射卡那霉素聯(lián)合呋塞米后，在電鏡下可見典型的SGCs變性，且其ABR反應(yīng)閾較正常鼠提高40 dB左右；在卡那霉素作用下，豚鼠SGCs髓鞘逐漸退化消失，細(xì)胞數(shù)逐漸減少，尤其是底回[10]；在噪聲暴露后，在電鏡下可見SGCs胞核固縮，胞漿出現(xiàn)空泡化，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，部分細(xì)胞核結(jié)構(gòu)被吞噬細(xì)胞吞噬[18]；觀察缺血缺氧性腦病小鼠耳蝸的超微結(jié)構(gòu)，可見細(xì)胞形態(tài)異常及細(xì)胞膜不規(guī)則，部分區(qū)域的胞質(zhì)變質(zhì)及周邊衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)改變并出現(xiàn)聽力下降[19]。由此可見，不同因素導(dǎo)致的SGCs損傷有著相同的病理過程，即損傷后會出現(xiàn)相應(yīng)程度的SGCs形態(tài)變異甚至壞死，使SGCs數(shù)目減少；這種變化最早出現(xiàn)在線粒體，隨后出現(xiàn)胞核、胞質(zhì)及其他細(xì)胞器的變性，并可導(dǎo)致不同程度的聽力損傷；在光鏡下可見SGCs數(shù)目減少，胞體變小，胞核縮小，髓鞘退化；而特殊TUNEL染色能夠檢測細(xì)胞DNA的斷裂，PI細(xì)胞核染色能夠敏感的檢測出細(xì)胞凋亡，在電鏡下典型的變化是細(xì)胞器尤其是線粒體腫脹、消失，胞質(zhì)空泡化，胞核皺縮；而細(xì)胞凋亡是SGCs在損傷狀態(tài)下死亡的主要方式。

2螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)方法

2.1標(biāo)本選取觀察計數(shù)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之前，先要對耳蝸進(jìn)行取材，不同的取材方式對SGCs的計數(shù)影響不同。單純進(jìn)行螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞觀察計數(shù)，可以隨機(jī)選取耳蝸，行中軸超薄切片進(jìn)行觀察，而大部分對螺旋神經(jīng)節(jié)的研究中同時需要對毛細(xì)胞進(jìn)行觀察計數(shù)，這就涉及到是要在不同個體上，還是同一個體不同耳蝸上，或者同一個體同一耳蝸上進(jìn)行兩者的觀察；有學(xué)者[20]收集4組豚鼠耳蝸，經(jīng)脫鈣后，從各組選取3個耳蝸進(jìn)行基底膜鋪片，另選5個耳蝸行耳蝸中軸切片，發(fā)現(xiàn)該方法收集的耳蝸忽略了個體差異，所以其最終結(jié)果的可靠性會降低。Keithly[21]選用小鼠的一側(cè)耳蝸取其基底膜用于毛細(xì)胞觀察，另一側(cè)耳蝸行中軸連續(xù)半薄切片觀察計數(shù)SGCs，該方法可減少抽樣誤差，對于提高實驗可靠性及效率，不失為一種有效的變通方法。Spoendlin等[22]將貓及豚鼠的耳蝸整體包埋，在鏡下沿耳蝸中軸將耳蝸一切為二，然后從頂回至底回逐漸切下每回，獲得含完整的螺旋器、前庭膜以及螺旋神經(jīng)節(jié)組織的包埋塊，將包埋塊直接于鏡下觀察螺旋器，或?qū)⑵溥B續(xù)切片用于觀察SGCs；該方法可觀察同一耳蝸上毛細(xì)胞和SGCs的變化，有利于發(fā)現(xiàn)病變的起始部位及其發(fā)展規(guī)律，但是在切分耳蝸的同時會有SGCs的缺失，影響SGCs計數(shù)。Bohne等[23]將栗鼠耳蝸包埋之后沿平行基底膜盤旋方向從蝸頂向蝸底將基底膜切片，取下的基底膜切片鋪片行毛細(xì)胞觀察計數(shù)，保留的蝸軸制備成連續(xù)切片用于螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞觀察計數(shù)，該方法避免了大量SGCs的物理損傷，但是制備過程比較繁雜，容易損傷神經(jīng)纖維孔，且需要很精準(zhǔn)的技術(shù)。Johnsone等[24]選取小鼠的整個耳蝸作為標(biāo)本，不進(jìn)行切片處理，在三維結(jié)構(gòu)下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及計數(shù)，該方法保留了耳蝸立體結(jié)構(gòu)且可將耳蝸組織細(xì)胞損傷的幾率降到最小。可見，對標(biāo)本的選取應(yīng)依照目的要求來進(jìn)行，但是在允許的條件范圍內(nèi)應(yīng)盡可能將各種影響因素降到最低，從而使實驗結(jié)果更準(zhǔn)確。

2.2螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)方法

2.2.1直接鏡下人工計數(shù)法早在二十世紀(jì)三十年代Howe[25]用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞輪廓直接計數(shù)SGCs，到二十世紀(jì)六七十年代后該方法應(yīng)用開始增多，并且沿用至今。直接鏡下人工計數(shù)法是對耳蝸中軸進(jìn)行連續(xù)切片，計數(shù)每個樣本中的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目；由于相鄰切片的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量變化不大，故改為間隔數(shù)張切片進(jìn)行觀察計數(shù)[26,27]；還有學(xué)者采用分別計數(shù)各回的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)以避免因細(xì)胞分布不均造成的誤差。另外，有國內(nèi)學(xué)者采用目鏡加網(wǎng)格片的方法，在40×10倍光學(xué)顯微鏡下對10 μm×10 μm小格內(nèi)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，算出8個網(wǎng)格面積范圍內(nèi)的有核神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)，然后取連續(xù)4張中軸切片的均數(shù)[28]。Schettino等[29]利用小格面積為2 500 μm2的網(wǎng)格片覆蓋在切片上，每個標(biāo)本計數(shù)9到15個小格有核細(xì)胞數(shù)然后取其均數(shù)，算出螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的密度。網(wǎng)格法能夠節(jié)約大量的時間，但因同一個中軸切面上，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分布是不均勻的，存在有效面積和無效面積(SGCs在耳蝸內(nèi)的分布并不完全均一，尤其是在細(xì)胞受到損傷的情況下，有些局部區(qū)域會出現(xiàn)只有少量或是沒有細(xì)胞的情況，和網(wǎng)格計算出來的細(xì)胞密度相差很大，在這種情況下該部位為一個無效面積)，其結(jié)果可能存在計量誤差。可見直接鏡下人工計數(shù)法既有其優(yōu)點(diǎn)，但也存在不可忽視的缺點(diǎn)。

2.2.2計算機(jī)圖像輔助計數(shù)法在二十世紀(jì)八九十年代，國內(nèi)外學(xué)者紛紛應(yīng)用電腦截取圖像的計數(shù)方法來輔助計數(shù)。方耀云等[30]在光學(xué)顯微鏡下掃描切片，將圖像傳輸至圖像監(jiān)視器上，將原始圖像經(jīng)計算機(jī)圖像處理軟件進(jìn)行增強(qiáng)處理后，使細(xì)胞輪廓更清晰，便于觀察計數(shù)，將細(xì)胞核輪廓清晰者計數(shù)，在圖像監(jiān)視器上將SGCs逐個標(biāo)記。該法聯(lián)合計算機(jī)，將已經(jīng)計數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，能夠避免重復(fù)計數(shù)或遺漏，并且可以多人同時進(jìn)行計數(shù)，但與直接鏡下計數(shù)法一樣需要耗費(fèi)較多的精力和時間。

2.2.3計算機(jī)軟件自動分析計數(shù)法從二十世紀(jì)九十年代開始出現(xiàn)應(yīng)用軟件自動計數(shù)的方法，該方法首先對耳蝸行間隔取片處理，染色，鏡下觀察，用連接顯微鏡上的攝像機(jī)攝取圖像，先用選定的細(xì)胞作為模型，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，然后直接應(yīng)用圖像處理軟件對視野范圍內(nèi)符合條件的細(xì)胞自動計數(shù)[31,32]；Nie等[33]對耳蝸中軸連續(xù)切片，每5張切片中挑出一張進(jìn)行計數(shù)，分別計算耳蝸各回的螺旋神經(jīng)節(jié)數(shù)目，測量Rosenthal小管的面積，測量該小管內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，求其密度，取均值。該方法與之前測量整個中軸的螺旋神經(jīng)節(jié)數(shù)目相比，能夠更準(zhǔn)確的反映SGCs數(shù)目的變化，消除了耳蝸不同部位SGCs數(shù)量不同的影響，能夠精準(zhǔn)的反映有效面積下SGCs的分布。然而，圖像處理軟件往往很難區(qū)分染色效果欠佳的細(xì)胞或因病變而形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小及著色異常的受損細(xì)胞，尤其是在混有不同的組織細(xì)胞部位，所以在軟件自動計數(shù)的時候往往需要人工隨時糾正其識別誤差以增加結(jié)果的準(zhǔn)確率及可信度。目前該法是研究SGCs應(yīng)用最廣的計數(shù)方法。

2.2.4連續(xù)切片三維結(jié)構(gòu)重建法二十一世紀(jì)初期以來，有部分學(xué)者利用三維重建法對SGCs進(jìn)行計數(shù)。該法對所獲得的耳蝸組織連續(xù)圖像通過計算機(jī)進(jìn)行提取輪廓及分割處理，構(gòu)建其三維立體圖形并進(jìn)行細(xì)胞定量。Schettino等[29]應(yīng)用數(shù)學(xué)關(guān)系的體視學(xué)法(design-based stereology)將耳蝸立體結(jié)構(gòu)重建并觀察和計量螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)和密度，其方法是取下耳蝸，經(jīng)固定、脫鈣、梯度脫水及包埋后，以40 μm的厚度沿平行中軸方向切片，逐一拍攝，重建時通過SI軟件的輔助下對中軸連續(xù)切片進(jìn)行重建，得到重建的三維模型，計數(shù)出小鼠的SGN細(xì)胞數(shù)和密度，并與以往的其他計數(shù)方式結(jié)果進(jìn)行對比研究，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。Richter等[9]將耳蝸沿蝸軸水平切片，將切片染色后按順序拍照，將一系列切片進(jìn)行重建，應(yīng)用數(shù)字化成像聯(lián)合Adobe Photoshop處理軟件進(jìn)行計數(shù)，首先標(biāo)示出第一張切片上所有SGCs及該切面標(biāo)示性的輪廓，計數(shù)SGCs數(shù)目，然后將標(biāo)示出的簡易圖與第二張切片圖進(jìn)行整合，再對該圖中沒有標(biāo)示的所有SGCs進(jìn)行標(biāo)記，將標(biāo)示簡易圖整合至下一張切片，以此類推，將得到的所有SGCs數(shù)目累積相加。利用數(shù)字化成像及軟件輔助三維成像的方法能夠比較精確的計量細(xì)胞數(shù)，減少計量誤差，不僅能夠獲取二維切片的圖像而且能夠?qū)⒍伣M織結(jié)構(gòu)立體化，能夠更加直觀的對其觀察。

2.2.5耳蝸整體三維成像法近年有部分學(xué)者應(yīng)用共聚焦顯微鏡聯(lián)合電腦輔助軟件，制作完整耳蝸的三維立體結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行內(nèi)耳相關(guān)研究。Wrzeszcz等[34]將整個豚鼠耳蝸經(jīng)固定，漂洗，脫鈣，梯度酒精脫水，MSBB浸泡過夜處理之后，利用激光共聚焦顯微鏡(laser imaging microscopy，CLSM，LSCM)對標(biāo)本進(jìn)行掃描攝片，由頂回至底回逐層掃描，整個過程需耗時3～4個小時，將拍攝圖像傳入與之相連的計算機(jī)，利用XuvTool軟件對重疊部位進(jìn)行處理，將其處理為一個完整的三維中軸圖像，可以將蝸軸進(jìn)行360°旋轉(zhuǎn)觀察，制成的圖像以圖片或視頻方式輸出保存，利用專門計數(shù)胞核的ITCNplug-in軟件對SGCs計數(shù)。Johnson等[24]將整個貓的耳蝸進(jìn)行熒光染色，利用薄層激光成像顯微鏡(thin layer of laser imaging microscopy，TSLIM)拍攝從頂回至底回的耳蝸圖片，再利用專門的軟件分析整合為一個立體的耳蝸圖，可以計數(shù)總的SGCs，并可對每個距離長度的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，可以更加詳細(xì)的了解耳蝸每個部位SGCs具體數(shù)目并進(jìn)行比較分析。Schmitz等[11]利用TSLIM觀察藥物性聾小鼠的耳蝸結(jié)構(gòu)，在1.5 μm×1.5 μm×1.5 μm的像素下，按B樣曲線模式(電腦輔助設(shè)計軟件中用于決定幾個點(diǎn)之間的曲線走行及曲線弧度的一種數(shù)學(xué)表示法)沿基底膜從底部到頂部掃描2次，一次是myosin VIIa染色后，一次是異硫氰酸羅丹明B染色之后；圖像經(jīng)Amira軟件處理將耳蝸整體結(jié)構(gòu)重建之后，觀察毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)、大小、損傷的具體部位以及整個耳蝸組織細(xì)胞的三維形態(tài)。該法能夠使細(xì)胞更形象，更易辨認(rèn)，計數(shù)更精確，尤其是將細(xì)胞適當(dāng)?shù)娜旧?，能夠在幾乎不損傷組織結(jié)構(gòu)的情況下對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察及計數(shù)，形象的展示耳蝸組織細(xì)胞的空間位置及形態(tài)特征，增加人們對耳蝸的立體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，是一種比較理想的計數(shù)方法。

在各類理化因素的影響下，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可出現(xiàn)不同程度的退行性變，觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)變化及計數(shù)能夠?qū)ζ鋼p傷定性及定量。目前，單純鏡下計數(shù)法已較少應(yīng)用；對耳蝸超薄切片進(jìn)行圖片分析聯(lián)合相關(guān)的細(xì)胞計數(shù)軟件進(jìn)行計數(shù)的方法因其簡單、省時，目前應(yīng)用較廣；三維立體重建法能夠清楚地呈現(xiàn)耳蝸立體空間結(jié)構(gòu)及局部組織細(xì)胞的形態(tài)特征，并且可以精確的定量分析，但因其對相關(guān)實驗條件，如：儀器設(shè)備以及輔助軟件的要求較高，目前應(yīng)用還比較少。因此，綜合分析這些實驗技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，從中選擇一個簡單而又精確的方法觀察并計數(shù)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，將為以后實驗及臨床研究提供參考依據(jù)。

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(2015-04-07收稿)

(本文編輯雷培香)

【中圖分類號】R322.9+23

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1006-7299(2016)02-0203-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.02.023

通訊作者：張志遠(yuǎn)(Email：zzyent@126.com)

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科(南昌330006)；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科