二氧化碳厭氧處理對藤茶GABA含量的影響

范 霞，孫鈺椋，朱 川，周防震

（湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施445000）

二氧化碳厭氧處理對藤茶GABA含量的影響

范 霞，孫鈺椋，朱 川，周防震＊

（湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施445000）

為制備富含γ－氨基丁酸（GABA）藤茶（Ampelopsis grossedentata），采用二氧化碳（CO2）厭氧處理野生藤茶和人工栽培藤茶鮮葉，經(jīng)殺青、烘干和粉碎后，利用丙酮和AlCl3去除色素，分光光度法測定藤茶中GABA的含量。結(jié)果表明：未厭氧處理時，藤茶中GABA含量為0.874 9～1.270 7mg／g；而CO2厭氧處理4h，野生藤茶和人工藤茶中GABA含量均達(dá)最高值，分別為1.751 8mg／g和2.509 3mg／g；CO2厭氧處理4h能顯著提高野生藤茶和人工藤茶GABA的含量。

藤茶；γ－氨基丁酸；厭氧處理

γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［1］，廣泛存在于動植物體內(nèi)，具有降血壓、保持神經(jīng)安定，改善大腦機(jī)能和增強(qiáng)記憶等多種藥理作用［2］，具有較大的開發(fā)和利用價值。高等植物中GABA的合成主要由L－谷氨酸脫羧而來，這一反應(yīng)由L－谷氨酸脫羧酶催化。研究表明，厭氧處理可激活L－谷氨酸脫羧酶的活性［3］，進(jìn)而可間接增加植物中GABA的含量。將普通的鮮茶葉經(jīng)過一定時間的厭氧處理使谷氨酸在谷氨酸脫羧酶作用下脫去羧基，生成GABA，國內(nèi)外已有報道，并已有產(chǎn)品銷售。如日本學(xué)者通過厭氧和應(yīng)激處理，使普通春茶GABA的含量達(dá)2.02mg／g（干重），夏茶GABA的含量達(dá)0.86～1.14mg／g［4］，而普通加工茶葉雖然谷氨酸的含量豐富，達(dá)1.78～4.95mg／g，但GABA僅有0.02～0.22mg／g［5］。

藤茶（Ampelopsis grossedentata）是一種古老的藥食兩用植物，長期作為類茶植物和中草藥在民間廣泛使用，近年來逐漸成為研究熱點(diǎn)［6－7］。有研究表明，藤茶主要活性成分為二氫楊梅素，具有抗氧化、保肝護(hù)肝和抗腫瘤等多種藥理活性［8］，其鮮葉中谷氨酸含量達(dá)3.25mg／g［8］，遠(yuǎn)高于普通茶葉中谷氨酸含量，具有制備富含GABA功能藤茶的巨大潛力。但迄今為止，國內(nèi)外尚無利用富含谷氨酸藤茶為材料生產(chǎn)富含GABA藤茶的報道。為制備富含GABA的藤茶，試驗(yàn)以藤茶鮮葉為材料，探討CO2厭氧處理對藤茶中GABA含量的影響，以期為制備GABA功能藤茶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生藤茶和人工栽培藤茶鮮葉：于2015年5月1日采自湖北省恩施土家族苗族自治州來鳳縣大河鎮(zhèn)兩河口集鎮(zhèn)。

試劑：丙酮、無水三氯化鋁和氫氧化鉀（天津市福晨化學(xué)試劑廠），無水乙醇、次氯酸鈉和γ－氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），重蒸酚（北京索萊寶科技有限公司），四硼酸鈉（天津市天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠），以上試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：小型高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），精密pH計（PHS－4C型，成都方舟科技開發(fā)公司），恒溫水浴鍋（HH－4，金壇市科興儀器廠），粉碎機(jī)（廣東天際電器有限公司），電子天平（上海精天電子儀器有限公司），Infinite M200PRO全波段多功能酶標(biāo)儀（TECAN公司），電熱恒溫干燥箱（上海一恒科技有限公司），移液槍（Eppendorf公司），PET／PE透明真空包裝袋（河北東光縣立新塑料包裝有限公司），DZ－280／DZ－300A小型真空包裝機(jī)（溫州卓越機(jī)電有限公司），CO2厭氧產(chǎn)氣袋及2.5L密封罐（日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社）。

1.2 藤茶鮮葉的處理

取藤茶鮮葉100g多份，分別置于密封罐室溫、CO2厭氧條件下（密封罐內(nèi)放置CO2厭氧產(chǎn)氣袋）處理0h、4h、8h和12h。然后微波（110～115oC）殺青1～2min，每30s拌勻1次。然后80℃干燥至恒重，粉碎后過40目篩，置干燥器備用。各處理4次重復(fù)。

1.3 藤茶中GABA的提取

稱取0.4g藤茶葉干樣，加入裝有7mL丙酮的離心管中，室溫振蕩15min，8 000r／min離心15min，棄上清。分別再加7mL和5mL丙酮，重復(fù)上述過程，沉淀靜置干燥。待完全干燥后，加水4mL，50℃水浴中振蕩提取2h，8 000r／min離心15min，取上清液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藤茶中GABA的含量測定

分別取1mL樣品提取液，加入2mol／L的AlCl3溶液50μL，混勻后室溫振蕩15min，12 000r／min離心5min，取上清液0.5mL加入1mol／L的KOH溶液300μL，室溫振蕩5min，12 000r／min離心5min。分別取上清液300μL，加0.1mol／L的四硼酸鈉緩沖溶液500μL（pH 10.0），6%的重蒸酚400μL，混勻后再加入5%的NaClO溶液600μL，充分混勻。于沸水浴中加熱10min，立即置于冰浴中5min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入60%乙醇2.0mL，取200μL于96孔板中，于645nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光值。藤茶GABA的含量按下式計算

GABA質(zhì)量比（mg／g）＝C×V／m

式中，C為直線方程計算的值（mg／mL），V為樣品提取液的總體積（mL），m為樣品質(zhì)量（g）。

1.5 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取GABA標(biāo)準(zhǔn)品0.010g，用蒸餾水溶解并定容至10mL，等量稀釋，依次配成濃度為1mg／mL、0.5mg／mL、0.25mg／mL、0.125mg／mL和0.062 5mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取1mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，同1.4處理。以吸光值為縱坐標(biāo)，GABA的濃度（mg／mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可見，在0.062 5～1.0mg／mL，GABA濃度與645nm波長吸光值之間具有良好的線性關(guān)系，其線性方程為y＝0.343 54x＋0.102 59，決定系數(shù)R2＝0.991 07。

2.2 CO2厭氧處理對藤茶GABA含量的影響

由圖2可知，CO2厭氧處理0～12h，人工藤茶和野生藤茶GABA含量均顯著增加，且呈先增加后減少趨勢，其中處理4h的GABA含量最高，分別為2.509 3mg／g和1.751 8mg／g，人工藤茶中的GABA含量顯著高于野生藤茶。CO2厭氧處理8h和12h人工藤茶GABA含量均顯著低于厭氧處理4h組（P＜0.05）；CO2厭氧處理8h和12h，野生藤茶的GABA含量與厭氧處理4h無顯著差異。未厭氧處理時，野生藤茶中GABA的含量為1.2707mg／g，顯著高于人工栽培藤茶（0.874 9mg／g）。

圖1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of GABA

圖2 CO2厭氧處理人工和野生藤茶的GABA含量Fig.2 Effect of CO2anaerobic treatment on GABA content in wild and home planted Ampelosis grossedentata leaves

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，藤茶中GABA的含量為0.874 9～1.270 7mg／g；CO2厭氧處理4h，藤茶GABA的含量達(dá)1.751 8～2.509 3mg／g，即厭氧處理可以顯著增加藤茶中的GABA含量。普通茶中GAGA的含量為0.02～0.22mg／g，厭氧處理?xiàng)l件下，其GABA的含量為0.86～2.02mg／g［45］。可見，藤茶中GABA的含量明顯高于普通茶（山茶科）。

有研究指出，當(dāng)植物受到厭氧、冷激和機(jī)械傷害等逆境條件時，體內(nèi)GABA含量將顯著增加，其中以低氧厭氧逆境效果最佳［9］。試驗(yàn)中，CO2厭氧條件下，藤茶中GABA含量先增加后減小，可能與在CO2厭氧產(chǎn)氣袋吸收密封罐中O2，釋放CO2過程中，早期尚有低濃度O2有關(guān)。低氧脅迫條件下，植物通過磷酸戊糖途經(jīng)減少有毒物質(zhì)的積累，生成谷氨酸和GABA以抵御逆境脅迫，調(diào)節(jié)細(xì)胞酸度，在此條件下，谷氨酸脫羧酶活性得到激活，促使谷氨酸向GABA的轉(zhuǎn)化［10］。而長時間的處理（8h和12h），導(dǎo)致GABA的含量出現(xiàn)下降，與林智等［11］的研究結(jié)果一致，可能與GABA的穩(wěn)定性有關(guān)。

藤茶中GABA的含量明顯高于普通茶，與藤茶中谷氨酸的含量明顯高于普通茶中的谷氨酸含量趨勢一致；暗示較高的谷氨酸含量可能有利于谷氨酸脫羧酶活性的提高，進(jìn)而促進(jìn)GABA的積累。試驗(yàn)野生藤茶中GABA含量高于人工藤茶，但厭氧處理4h條件下，人工藤茶的GABA含量顯著高于野生藤茶，是否意味著野生藤茶的谷氨酸含量更低，還是存在其他機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

［1］夏玉玲，徐立，楊翠鳳.桑葉中γ－氨基丁酸含量的測定［J］.中國農(nóng)學(xué)通訊，2009，25（20）：209－212.

［2］張輝，徐滿英.γ－氨基丁酸作用的研究進(jìn)展［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，6（3）：267－269.

［3］DENNISON K L，SPALDING E P.Glutamate－gated calcium fluxes in Arabidopsis［J］.Plant Physiology， 2000，124（4）：1511－1514.

［4］SAWAI Y，YAMAGUCHI Y，MIYAMA D，et al.Cycling treatment of anaerobic and aerobic incubation increase the content ofγ－aminobutyric acid in tea shoots［J］.Amino acids，2001，20：331－334.

［5］廖明星.茶葉中γ－氨基丁酸（GABA）富集技術(shù)研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［6］晏和娟，伍莉娟，鄭小江，等.藤茶活性成分二氫楊梅素對明膠酶的影響［J］.中國釀造，2014，33（10）：81－83.

［7］賽娜，周防震.二氫楊梅素對MDA－MB－231人乳腺癌細(xì)胞端粒酶活性的影響［J］.湖北民族學(xué)院學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2013，30（4）：19－21，25.

［8］周防震，鄭小江.中國良種－藤茶［M］.湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2016.

［9］REGGIANI R，CABTU C A，BRAMBILLA I，et al.Accumulation and interconversion of amino acids in rice roots under anoxia［J］.Plant cell physiol，1988，29（6）：981－987.

［10］CRAWFORD L A，BOWN A W，BREITKREUZ K E，et al.The synthesis ofγ–aminobutryric acid in response to treatments reducing cytosolic pH［J］.Plant physiology，1994，104（3）：865－871.

［11］林智，林鐘鳴，尹軍峰，等.厭氧處理對茶葉中γ－氨基丁酸含量及其品質(zhì)的影響［J］.食品科學(xué)，2004，25（2）：35－39.

（責(zé)任編輯：孫小嵐）

Effect of CO2Anaerobic Treatment onγ－aminobutyric acid（GABA）Content in Ampelosis grossedentata

FAN Xia，SUN Yuliang，ZHU Chuan，ZHOU Fangzhen＊
（School of biological science anDTechnology，Hubei University for Nationalities，Enshi，Hubei 445000，China）

The GABA content in wild and home planted A.grossedentata flesh leaves treated with CO2，was determined by spectrophotometry after fixation，drying，smash and pigment removal processing technology to produce A.grossedentata with high GABA content.Results：The GABA content in untreated wild and home planted A.grossedentataflesh leaves is 0.874 9～1.270 7mg／g but the GABA content in wild and home planted A.grossedentataflesh leaves treated with CO2for 4hreaches 1.751 8mg／g and 2.509 3mg／g respectively，which indicates CO2treatment for 4hcan improve GABA content in wild and home planted Ampelosis grossedentata significantly.

Ampelosis grossedentata；γ－aminobutyric acid（GABA）；anaerobic treatment

S888.2

A

1001－3601（2016）10－0442－0132－03

2016－06－04；2016－09－28修回

高校青年教師服務(wù)企業(yè)行動項(xiàng)目“來鳳縣向班貴藤茶有限公司”（XD2014209）；大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項(xiàng)目“厭氧處理對藤茶中GABA含量的影響”（201310517007）

范 霞（1992－），女，在讀碩士，研究方向：生物工程。E－mail：1299841016＠qq.com

＊通訊作者：周防震（1976－），男，副教授，博士，從事天然產(chǎn)物開發(fā)研究。E－mail：tentzf.student＠sina.com