單細(xì)胞分析技術(shù)研究進(jìn)展

劉 佳, 劉 震

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 生命分析化學(xué)國家重點實驗室, 江蘇 南京 210023)

?

單細(xì)胞分析技術(shù)研究進(jìn)展

劉 佳, 劉 震*

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 生命分析化學(xué)國家重點實驗室, 江蘇 南京 210023)

細(xì)胞是生命結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單位,基于單細(xì)胞的研究是生命研究的基礎(chǔ)。由于細(xì)胞體積極小、細(xì)胞微環(huán)境復(fù)雜并且起到關(guān)鍵作用的組分含量往往較低,因此在很多方面單細(xì)胞分析仍然是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。該文對現(xiàn)有的單細(xì)胞分析技術(shù)進(jìn)行歸納、總結(jié),重點介紹了不同單細(xì)胞分析技術(shù)的特點及其應(yīng)用的最新進(jìn)展。

單細(xì)胞分析;毛細(xì)管電泳;微流控芯片;質(zhì)譜;綜述

細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。為了揭示生命活動的規(guī)律,必須以研究細(xì)胞為基礎(chǔ),深入探索細(xì)胞的生長與分化、代謝與繁殖、運動與通訊、衰老與凋亡、遺傳與進(jìn)化等生命過程中的化學(xué)本質(zhì)和規(guī)律。由于研究手段在靈敏度和樣品體積等方面的限制,通常的生命科學(xué)研究主要以大量的細(xì)胞為研究對象。但是,同種細(xì)胞的不同個體間存在著顯著的微觀不均一性(異質(zhì)性),基于大量細(xì)胞的實驗結(jié)果難以反映單細(xì)胞水平上的生命活動規(guī)律。因此,基于單細(xì)胞的生命科學(xué)研究將能在更深的層次上揭示生命活動的本質(zhì)和規(guī)律,為探究重大疾病的起因、發(fā)展和治療提供更可靠的科學(xué)依據(jù)。2012年,美國《Science》雜志成功預(yù)測了單細(xì)胞研究將成為2013年6大重點研究之首[1,2]。同年,美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)發(fā)布了單細(xì)胞分析計劃,計劃5年內(nèi)投入9 000萬美元以上,用于單細(xì)胞分析工具的研發(fā)[3]。2013年,《Science》雜志展望單細(xì)胞研究將成為21世紀(jì)生命科學(xué)研究的主要突破口[4]。

盡管單細(xì)胞分析技術(shù)在很多應(yīng)用領(lǐng)域中是至關(guān)重要的,如神經(jīng)科學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、癌癥診斷和個性化藥物篩選等等,然而單細(xì)胞分析技術(shù)面臨著巨大的挑戰(zhàn)。哺乳動物細(xì)胞一般較小(直徑通常為10～30 μm),體積為10-13～10-11L,所測組分含量常在10-18～10-15mol水平,有時甚至低至10-21mol,一些對細(xì)胞起關(guān)鍵作用的生物分子的含量更低,使得檢測與分析變得非常困難。另一方面,單細(xì)胞分析要求細(xì)胞在分析后仍保持存活,目前大多數(shù)的單細(xì)胞分析技術(shù)均難以勝任。

本文針對單細(xì)胞研究難點對現(xiàn)有的單細(xì)胞分析技術(shù)進(jìn)行歸納總結(jié),旨在為單細(xì)胞分析新方法、新技術(shù)的開發(fā)和研究提供參考。

1 單細(xì)胞分析技術(shù)

1.1 微分離技術(shù)

微分離技術(shù)是最早的單細(xì)胞分析技術(shù),主要包括微柱液相色譜和毛細(xì)管電泳(CE)。微柱、毛細(xì)管的內(nèi)徑和進(jìn)樣體積與單細(xì)胞相匹配,從而促進(jìn)了單細(xì)胞分析的發(fā)展,但是除激光誘導(dǎo)熒光(LIF)外,其他檢測器的靈敏度往往不夠,檢測組分較少。

單細(xì)胞分析技術(shù)最早出現(xiàn)于50多年前。1965年,Matioli等[5]報道了單個血紅細(xì)胞中血紅蛋白的電泳分離,但由于分辨率和靈敏度的不足,該技術(shù)未獲得進(jìn)一步的發(fā)展。1976年,Neher和Sakaman[6]發(fā)明了膜片鉗技術(shù),可以檢測單個離子通道,為單細(xì)胞神經(jīng)生理學(xué)研究提供了強有力的研究工具,Neher和Sakaman因此獲得1992年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。1987年,Kennedy和Jorgenson等[7]報道了微柱液相色譜-電化學(xué)檢測裝置用于分析單個神經(jīng)細(xì)胞中的神經(jīng)遞質(zhì)和氨基酸等化合物。但由于該裝置比較復(fù)雜,后續(xù)報道很少。1988年,Ewing等[8]首次報道了用于分析單個蝸牛神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)的CE-電化學(xué)檢測裝置。稍后,Kennedy和Jorgenson等[9]構(gòu)建了CE-LIF裝置并用其分析了單個神經(jīng)細(xì)胞中的氨基酸和神經(jīng)遞質(zhì)。CE由于具有超低進(jìn)樣體積(nL～fL)、超高靈敏度(amol～zmol,即10-18～10-21mol)、多組分分析和分析速度快的特點,因此特別適合于單細(xì)胞分析。依阿華大學(xué)Yeung研究組[10-12]利用CE-LIF開展了單細(xì)胞分析的一系列工作,利用內(nèi)生熒光、間接熒光、細(xì)胞內(nèi)衍生、免疫計數(shù)和粒子計數(shù)等方法分析了血紅細(xì)胞中從離子到蛋白質(zhì)等物質(zhì)。程介克研究組[13]是國內(nèi)最早開展單細(xì)胞分析研究的少數(shù)研究組之一,于1996年利用CE-安培檢測聯(lián)用實現(xiàn)了單個交感神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)的分析。Sweedler研究組[14]利用CE、激光誘導(dǎo)熒光、放射化學(xué)、光譜、質(zhì)譜和核磁共振等多種方法聯(lián)用,研究了海兔單細(xì)胞中的神經(jīng)肽等物質(zhì),在單細(xì)胞水平上獲得多重信息。金文睿研究組[15]利用CE與電化學(xué)檢測結(jié)合分析了單個紅細(xì)胞中的谷胱甘肽。任吉存研究組[16]利用CE與化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用裝置分析了單個紅細(xì)胞中的血紅蛋白。2000年,Dovichi研究組[17]率先提出了“單細(xì)胞蛋白質(zhì)組”的研究方向,將超靈敏的LIF檢測與二維CE等多維分離技術(shù)聯(lián)用,分析了單個人結(jié)腸癌細(xì)胞中的30多種蛋白質(zhì),檢出限達(dá)zmol級別[18,19]。最近,Dovichi等[20]利用級聯(lián)雪崩光電二極管光子計數(shù)器為檢測器構(gòu)建了先進(jìn)的CE-LIF系統(tǒng),檢測線性濃度范圍達(dá)9個數(shù)量級(10-12～10-3mol/L),檢測限達(dá)70個分子。鄒漢法等[21,22]發(fā)展了CE-LIF與流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)用的方法,通過高通量定量檢測導(dǎo)入至單個細(xì)胞中的特定熒光分子,用于研究細(xì)胞膜的特性。劉筆鋒等[23,24]提出了一個基于微陣列-CE-LIF裝置的單細(xì)胞化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略,分析了單細(xì)胞上的低豐度膜蛋白。不過,目前已報道的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺的分離和檢測能力有限,離全蛋白質(zhì)組分析的要求仍有很大的差距。

1.2 微流控芯片

微流控芯片是推動單細(xì)胞分析的又一重要工具。微流控芯片的微結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的體積相匹配,對細(xì)胞的操控、傳輸、定位、進(jìn)樣、溶胞、反應(yīng)、分離和檢測等功能均可集成到一塊幾平方厘米大小的微流控芯片上完成,采用微泵和微閥進(jìn)行控制,可實現(xiàn)自動化分析。利用微流控芯片進(jìn)行CE分析,分析效率可提高1～2個數(shù)量級,分離過程可在數(shù)秒內(nèi)完成。

Zare研究組[25]研制出用于單細(xì)胞分析的微流控芯片,集成了對單細(xì)胞的進(jìn)樣、定位、試劑引入及檢測等功能,成功應(yīng)用于單個白血病細(xì)胞鈣離子流的監(jiān)控。Ramsey研究組[26]研制出高通量細(xì)胞微流控芯片,集成了細(xì)胞操控、快速溶胞、芯片電泳和激光誘導(dǎo)熒光檢測等功能,細(xì)胞內(nèi)容物的分離能在2.2 s內(nèi)完成,細(xì)胞分析速度達(dá)每分鐘7～12個細(xì)胞。Kennedy研究組[27]報道了基于芯片電泳的免疫分析,能連續(xù)檢測單個胰島細(xì)胞的胰島素釋放,檢測限達(dá)3 nmol/L,該微流控芯片經(jīng)改進(jìn)后還可以用于藥物的篩選[28]。程介克等[29,30]發(fā)展了集成單細(xì)胞操控、傳輸、定位和時間監(jiān)測的微流控芯片,實現(xiàn)了單個PC12神經(jīng)細(xì)胞中多巴胺量子釋放的實時檢測。方肇倫研究組[31]則將細(xì)胞注射、溶胞、分離和檢測等功能集成到微流控芯片上,用于分析單細(xì)胞內(nèi)容物。金文睿研究組[32]報道了微流控芯片與電化學(xué)檢測聯(lián)用的單細(xì)胞分析裝置。謝曉亮研究組[33]構(gòu)建了單分子激光誘導(dǎo)熒光成像微流控芯片裝置,實現(xiàn)了單細(xì)胞中隨機表達(dá)的蛋白質(zhì)單分子水平實時監(jiān)測。Zare研究組[34]報道集成了細(xì)胞注入、捕獲、清洗、溶胞、電泳分離、熒光標(biāo)記和單分子計數(shù)激光誘導(dǎo)熒光檢測的微流控芯片裝置,實現(xiàn)了單個昆蟲細(xì)胞中的β2-腎上腺素能受體以及單個藍(lán)藻細(xì)菌細(xì)胞中的藻膽蛋白的分析。方群研究組[35]發(fā)展出用于單細(xì)胞分析的多功能微流控pL級液滴操控平臺。楊朝勇研究組[36]報道了用于單細(xì)胞分析的基于微流控液滴的PCR技術(shù)。唐波研究組[37,38]研制出可高靈敏檢測單個活細(xì)胞表面膜蛋白的微流控液滴的PCR技術(shù)和分析單個神經(jīng)細(xì)胞中的超氧化物和一氧化氮的微流控芯片電泳裝置。

1.3 光學(xué)成像

光學(xué)成像分析技術(shù)一直是細(xì)胞生物學(xué)研究的重要手段,也是單細(xì)胞分析的重要支撐技術(shù)之一。目前單細(xì)胞成像分析已經(jīng)研究及開發(fā)了多種方法,主要有光學(xué)顯微鏡(一般熒光顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、多光子熒光顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡、熒光相關(guān)顯微鏡、近場掃描光學(xué)顯微鏡等)、原子力顯微鏡、掃描電化學(xué)顯微鏡及其他顯微成像方法。

中國科學(xué)家曾在單細(xì)胞光學(xué)成像分析上做出了開拓性的工作。20世紀(jì)90年代,陳觀銓研究組[39-43]研制出阿達(dá)瑪變換顯微成像分析儀,成功應(yīng)用于單細(xì)胞中蛋白質(zhì)和DNA的成像分析。但該技術(shù)由于數(shù)據(jù)采集時間長,沒有得到廣泛應(yīng)用。Yeung研究組[44]利用倒置熒光顯微鏡、激光誘導(dǎo)熒光與電荷耦合元件成像結(jié)合,得到了單個活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中5-羥色胺的天然熒光圖像。該研究組發(fā)展出的單分子成像分析裝置[45,46],為單細(xì)胞成像分析提供了先進(jìn)的技術(shù)。Ewing和Cans等[47,48]將熒光成像與電化學(xué)檢測相結(jié)合,研究了人工合成細(xì)胞和囊泡胞吐釋放過程。共聚焦掃描顯微鏡可以將光束聚焦為直徑1 μm,探測體積可低達(dá)1 fL,適合探測化合物在細(xì)胞內(nèi)的空間分布。Kennedy等[49]利用共聚焦熒光掃描顯微鏡獲得了單個鼠胰腺β-細(xì)胞Zn2+釋放的圖像。但是共聚焦熒光顯微鏡對細(xì)胞的光損傷較大,熒光染料易產(chǎn)生光漂白作用,光散射穿透樣品深度不夠。多光子熒光顯微鏡能有效克服以上問題。Bousso等[50]使用雙光子熒光顯微鏡研究了胸腺細(xì)胞間反應(yīng)動力學(xué)。Miller等[51]利用雙光子熒光顯微鏡觀察了T細(xì)胞在活體脈管中的快速移動。Zhang等[52]用量子點標(biāo)記天花蛋白,利用雙光子熒光顯微鏡研究了人絨癌細(xì)胞內(nèi)天花蛋白的分布。Webb等[53]利用三光子熒光顯微鏡實時檢測鼠白血病細(xì)胞中5-羥色胺囊泡圖像。全內(nèi)反射熒光顯微鏡的激發(fā)光僅深入到距離細(xì)胞表面100 nm處,特別適合觀察細(xì)胞膜上的分子熒光圖像和相關(guān)動力學(xué)過程[54]。熒光相關(guān)顯微鏡(FCM)可通過很小體積測量細(xì)胞內(nèi)局部濃度、分子擴散、分子間反應(yīng)過程圖像,以用于活細(xì)胞研究[55,56]。熒光壽命顯微鏡可以根據(jù)熒光壽命的差異有效避開干擾,已經(jīng)成功應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的pH成像分析[57]和酶活性成像分析[58],但由于分辨率有限且需要復(fù)雜的數(shù)學(xué)處理,應(yīng)用前景有限。近場掃描光學(xué)顯微鏡(NSOM)[59]、受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)[60]、光敏定位顯微鏡(PALM)[61]、熒光光敏定位顯微鏡(FPALM)[62]、隨機光學(xué)重建顯微鏡(STORM)[63-65]等超分辨成像技術(shù)突破了光衍射的光學(xué)極限,空間分辨率可達(dá)20 nm甚至更低,是探測細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的重要研究手段。雖然這些超分辨成像技術(shù)需要較長的成像時間和復(fù)雜的數(shù)學(xué)處理,目前在單細(xì)胞的化學(xué)成分及動態(tài)過程檢測方面應(yīng)用有限,但隨著技術(shù)的進(jìn)步,預(yù)期今后的發(fā)展?jié)摿薮蟆３龖?yīng)用廣泛的光學(xué)顯微鏡外,原子力顯微鏡、同步加速器X射線顯微鏡等儀器與裝置在單細(xì)胞分析中有一定的應(yīng)用,而掃描電化學(xué)顯微鏡(SECM)則具有更廣泛的應(yīng)用。SECM不僅可以進(jìn)行單細(xì)胞成像分析,而且可以測定電活性物質(zhì)跨細(xì)胞膜的傳遞與轉(zhuǎn)移[66-72]。

1.4 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜分析能提供可靠的化合物結(jié)構(gòu)信息,是單細(xì)胞分析中極具潛力的技術(shù)之一。一方面,單細(xì)胞內(nèi)容物可以通過溶胞或通過微萃取后與質(zhì)譜儀聯(lián)用進(jìn)行分析;另一方面,質(zhì)譜還可以對單細(xì)胞進(jìn)行成像分析,以揭示單細(xì)胞化學(xué)組成的空間分布。

Sweedler研究組[73-75]在單細(xì)胞質(zhì)譜分析方面做了大量深入的研究工作,利用基體輔助激光解析電離質(zhì)譜(MALDI MS)建立了單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法,分析了海洋軟體動物及昆蟲神經(jīng)細(xì)胞中的神經(jīng)肽[76-78]、連接神經(jīng)中神經(jīng)肽的分布[79]以及單個神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)肽的空間分布[80]。基于MALDI MS的成像分析分辨率較低(通常為10～50 μm),只適用于尺寸較大的細(xì)胞。最近,Dreisewerd研究組[81]利用激光誘導(dǎo)定位技術(shù)實現(xiàn)了5 μm分辨率的MALDI MS成像。在單細(xì)胞成像方面,二級離子質(zhì)譜(SIMS)[82,83]是非常有前途的質(zhì)譜技術(shù),空間分辨率約為50 nm,可以對元素和生物分子的空間分布進(jìn)行分析。Ewing等[84,85]發(fā)展出基于飛行時間質(zhì)譜(TOF MS)的SIMS成像技術(shù),獲得了細(xì)胞表面的分子形態(tài)圖像,得到了鼠PC12細(xì)胞膜上的脂質(zhì)圖像并鑒定了部分細(xì)胞質(zhì)的化學(xué)組成。Passarelli研究組[86]利用SIMS技術(shù)研究了加州海兔神經(jīng)細(xì)胞上的脂質(zhì)分布。Ewing等[87]利用SIMS成像技術(shù)揭示了單細(xì)胞生物嗜熱四膜蟲在交配中脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的形成過程。張新榮研究組[88]發(fā)明了梯度電壓納噴霧離子化質(zhì)譜接口,可以便捷有效地消除萃取探針上的樣品基體效應(yīng)。以微米級的鎢絲探針插入單細(xì)胞萃取細(xì)胞中的代謝產(chǎn)物,萃取后探針直接與電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用,檢測到單個洋蔥細(xì)胞中的果聚糖、脂類和黃酮等的多種衍生物[89]。Dovichi研究組[90]研制出毛細(xì)管區(qū)帶電泳-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),從HeLa細(xì)胞蛋白質(zhì)組酶解產(chǎn)物中鑒定出10 000個肽段和2 100個蛋白質(zhì)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是支撐單細(xì)胞分析的重要技術(shù)之一[91-93]。流式細(xì)胞儀不僅可以對細(xì)胞進(jìn)行分選,還可以對單個細(xì)胞進(jìn)行分析,尤其在不均勻的細(xì)胞群體中,可快速探測單細(xì)胞的物理及化學(xué)參數(shù),比如細(xì)胞大小、細(xì)胞體積、細(xì)胞計數(shù)、蛋白質(zhì)或者核酸的全部含量。流式細(xì)胞術(shù)的另一個重要優(yōu)勢是分析通量大(每秒104個細(xì)胞)。

早在20世紀(jì)70年代末,Dolbeare[94]就利用流式細(xì)胞儀對單細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)酶活分析。流式細(xì)胞儀通常采用熒光檢測,利用多色熒光技術(shù),可實現(xiàn)高內(nèi)涵檢測。采用雙熒光流式細(xì)胞儀,Murphy等[95]對單細(xì)胞的內(nèi)生pH進(jìn)行了檢測。采用多色熒光流式細(xì)胞儀,Nebe-von-Caron等[96]實現(xiàn)了細(xì)菌單細(xì)胞水平的細(xì)胞功能分析。Krutzik等[97]利用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展了高內(nèi)涵單細(xì)胞藥物篩選技術(shù)。目前,基于流式細(xì)胞術(shù)的單細(xì)胞分析技術(shù)已經(jīng)獲得廣泛的應(yīng)用,例如,急性髓樣白血病單細(xì)胞水平的磷酸-蛋白信號通路的繪制[98]和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析[99]。但是,空間分辨率和檢測靈敏度的不足是流式單細(xì)胞分析技術(shù)的明顯局限。

1.6 單細(xì)胞測序

在各種各樣的單細(xì)胞操控和分析技術(shù)不斷發(fā)展和進(jìn)步的同時,核酸擴增技術(shù)和測序技術(shù)取得了顯著的進(jìn)步?；诤怂釘U增及測序技術(shù)的單細(xì)胞分析技術(shù)是目前最為成熟和應(yīng)用最廣的技術(shù)。

1.6.1 單細(xì)胞基因組分析

Wigler等[100]報道了一種新穎的腫瘤單細(xì)胞測序技術(shù),對分別來自兩個人類乳腺癌病例的100個單細(xì)胞進(jìn)行了拷貝數(shù)變異檢測,證實其中一種腫瘤包含3種不同的細(xì)胞亞群,而另一種是由遺傳上相同的細(xì)胞群構(gòu)成。Sandberg等[101]發(fā)明了一種稱為Smart-Seq的基因組測序新方法,可以深入分析臨床相關(guān)的單細(xì)胞,為了解腫瘤形成的復(fù)雜性提供可靠信息。Quake研究組[102]公布了來自一個成人男子91個精子的全部基因組序列,首次繪制了個體基因重組圖譜,也首次發(fā)現(xiàn)了來自同一個人的不同精子的不同突變率。深圳華大基因組學(xué)中心等單位[103,104]報道了單個癌細(xì)胞全外顯子測序技術(shù),能實現(xiàn)單個癌細(xì)胞的單核苷酸水平的序列解析能力,揭示了特發(fā)性血小板增多癥病人在腫瘤發(fā)生中遵循單克隆演化模型和腎癌與常見突變基因VHL和PBRM1間的關(guān)系。

1.6.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)分析已經(jīng)逐漸成為一種常用的單細(xì)胞分析手段。然而,在過去的20多年中,人們對轉(zhuǎn)錄組的認(rèn)識仍然局限在細(xì)胞群體水平,但是,這種常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組分析方法忽視了生物系統(tǒng)和生物組織最普遍的特征——細(xì)胞異質(zhì)性。為了剖析細(xì)胞異質(zhì)性,就有必要在單細(xì)胞水平進(jìn)行基因表達(dá)分析。單細(xì)胞RNA-Seq技術(shù)能獲得單個細(xì)胞內(nèi)近萬個基因的表達(dá)信息,為辨別生物組織中各種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄特征和全面揭示細(xì)胞之間的基因表達(dá)差異提供了有力的工具。從1990年Brady等[105]報道了單細(xì)胞cDNA擴增方法開始,對單個細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析已有20多年歷史。2009年Tang等[106]首次報道了基于高通量測序的單細(xì)胞RNA-Seq技術(shù)。隨著高通量測序的推廣和發(fā)展,單細(xì)胞RNA-Seq技術(shù)近幾年發(fā)展迅速。2015年,微流控芯片液滴編碼技術(shù)的發(fā)展真正實現(xiàn)了高通量單細(xì)胞分析[107]。

1.7 光譜分析

激光誘導(dǎo)熒光[108,109]和表面增強拉曼散射[110,111]等光譜技術(shù)能提供單分子水平的檢測靈敏度,這為單細(xì)胞內(nèi)低拷貝數(shù)生物分子的檢測提供了強有力的檢測手段。Xie等[112,113]利用單分子熒光檢測手段系統(tǒng)分析了單個細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的隨機性以及單個細(xì)胞中低拷貝數(shù)生物分子(蛋白質(zhì)、信使RNA)的表達(dá)水平差異。Nie等[114,115]利用表面增強拉曼散射光譜技術(shù),實現(xiàn)了對單個羅丹明分子的實時檢測,還將該技術(shù)用于單個活細(xì)胞內(nèi)的單分子檢測。本課題組[116]提出了基于活體微萃取和表面等離激元光學(xué)檢測相結(jié)合的稱為“表面等離激元免疫夾心法(PISA)”的新穎方法,可以檢測單個活細(xì)胞和活體動物中低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。該方法的原理為,將表面修飾了單克隆抗體或分子印跡聚合物的金基微萃取探針在顯微操作平臺的輔助下插入到單細(xì)胞中,在很短的時間內(nèi)將特定的目標(biāo)蛋白質(zhì)專一高效地萃取到探針表面,微萃取探針拔出并經(jīng)清洗后用修飾了能識別目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體或硼親和配基的銀基納米拉曼探針標(biāo)記,從而形成萃取探針-目標(biāo)蛋白質(zhì)-拉曼標(biāo)簽三明治型復(fù)合物結(jié)構(gòu),當(dāng)用激光束照射以上三明治型復(fù)合物表面時發(fā)生表面等離激元光學(xué)效應(yīng),銀基拉曼標(biāo)簽產(chǎn)生表面增強拉曼散射,金基微萃取探針產(chǎn)生表面等離子波,進(jìn)一步增強銀基拉曼標(biāo)簽的表面增強拉曼散射信號,從而大大增強了檢測靈敏度,檢測限可達(dá)單分子水平。本課題組制備的一系列分子印跡聚合物已經(jīng)成功用于多種復(fù)雜體系中痕量目標(biāo)化合物的分析[117-121],充分體現(xiàn)了分子印跡聚合物具有超高的專一性識別性能。除此之外,本課題組還將該分析技術(shù)賦予了中國文化元素,利用針灸針制備出微萃取探針,用于活體動物組織內(nèi)的低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)的測定。該單細(xì)胞分析技術(shù)在癌癥診斷與預(yù)后、細(xì)胞質(zhì)量控制、發(fā)育生物學(xué)、干細(xì)胞研究及腦科學(xué)等多個領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用前景。

2 展望

單細(xì)胞分析已經(jīng)成為21世紀(jì)分析化學(xué)前沿?zé)狳c之一。近年來,微流控芯片、光學(xué)成像、質(zhì)譜、流式細(xì)胞術(shù)以及單細(xì)胞測序技術(shù)的迅速增長,使單細(xì)胞分析技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣,如神經(jīng)科學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等。而一些新的領(lǐng)域也將為單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展提出更多的挑戰(zhàn),例如在人工授精、干細(xì)胞移植等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,如何對細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量分析并且保證分析后的細(xì)胞仍然存活且最大程度保持原有內(nèi)部化學(xué)組成至關(guān)重要。然而,絕大部分現(xiàn)有技術(shù)對單細(xì)胞進(jìn)行分析后,細(xì)胞要么已經(jīng)死亡,要么細(xì)胞內(nèi)化學(xué)組成因引入某些檢測試劑而發(fā)生改變,因此,微創(chuàng)并且能夠活體檢測的單細(xì)胞分析技術(shù)是未來單細(xì)胞分析領(lǐng)域的一項巨大挑戰(zhàn)。此外,基于光譜分析的超靈敏檢測技術(shù)的使用也將為單細(xì)胞分析技術(shù)的研究提供更多新穎的平臺,因此基于多種光譜技術(shù)聯(lián)用的新型超靈敏檢測手段的發(fā)展是未來單細(xì)胞分析領(lǐng)域應(yīng)該努力的目標(biāo)之一。近年來,癌癥和干細(xì)胞領(lǐng)域的重大突破揭示了群體細(xì)胞中某些個體細(xì)胞在功能上表現(xiàn)出的異質(zhì)性,對今后各種“組學(xué)”研究向單細(xì)胞水平延伸提出了更高的要求,例如,為了滿足單細(xì)胞基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)的深入研究,高效、新穎的單細(xì)胞分離技術(shù)有待開發(fā),只有結(jié)合細(xì)胞生態(tài)學(xué)信息,在保持細(xì)胞原有活性的前提下,實現(xiàn)單個細(xì)胞的捕獲、操控和回收,這樣獲得的單細(xì)胞才可以繼續(xù)培養(yǎng)或者應(yīng)用于表達(dá)譜、測序、拷貝數(shù)變異等分析工作。同時,為了實現(xiàn)真正意義上的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)分析,高通量的單細(xì)胞分析技術(shù)也是未來的一項重大挑戰(zhàn)。

[1] Editor. Science, 2012, 338: 1528

[2] Editor. Science, 2013, 342: 1442

[3] National Institute of Mental Health (NIH). NIH Common Fund Announces Awards for Single Cell Analysis Program. (2012-10-15) [2016-09-02]. https://www.eurekalert.org/pub_releases/2012-10/niom-ncf101512.php

[4] Ray L B, Science, 2013, 342: 1187

[5] Matioli G T, Niewisch H B. Science, 1965, 150: 1824

[6] Neher E, Sakmann B. Nature, 1976, 260: 799

[7] Kennedy R T, Stclaire R L, White G J, et al. Mikrochim Acta, 1987, 2: 37

[8] Wallingford R A, Ewing A G. Anal Chem, 1988, 60: 1972

[9] Kennedy R T, Oates M D, Cooper B R, et al. Science, 1989, 246: 57

[10] Lee T T, Yeung E S. Anal Chem, 1992, 64: 3045

[11] Xue Q F, Yeung E S. Anal Chem, 1994, 66: 1175

[12] Yeung E S. Acc Chem Res, 1994, 27: 409

[13] Hu S, Pang D W, Wang Z L, et al. Chem J Chin Univ, 1996, 17: 1207

[14] Dahlgren R L, Page J S, Sweedler J V. Anal Chim Acta, 1999, 400: 13

[15] Jin W R, Li W, Xu Q. Electrophoresis, 2000, 21: 774

[16] Zhi Q, Xie C, Huang X Y, et al. Anal Chim Acta, 2007, 583: 217

[17] Zhang Z R, Krylov S, Arriaga E A, et al. Anal Chem, 2000, 72: 318

[18] Hu S, Zhang L, Krylov S, et al. Anal Chem, 2003, 75: 3495

[19] Hu S, Zhang L, Newitt R, et al. Anal Chem, 2003, 75: 3502

[20] Dada O O, Essaka D C, Hindsgaul O, et al. Anal Chem, 2011, 83: 2748

[21] Xiao H, Li X, Zou H F, et al. Electrophoresis, 2006, 27: 3452

[22] Xiao H, Yang L S, Zou H F. Anal Bioanal Chem, 2007, 387: 119

[23] Xu F, Zhao H, Feng X J, et al. Angew Chem Int Ed, 2014, 53: 6730

[24] Chen D J, Fan F K, Zhao X F, et al. Anal Chem, 2016, 88: 2466

[25] Wheeler A R, Throndset W R, Whelan R J, et al. Anal Chem, 2003, 75: 3581

[26] McClain M A, Culbertson C T, Jacobson S C, et al. Anal Chem, 2003, 75: 5646

[27] Roper M G, Shackman J G, Dahlgren G M, et al. Anal Chem, 2003, 75: 4711

[28] Shackman J G, Dahlgren G M, Peters J L, et al. Lab Chip, 2005, 5: 56

[29] Huang W H, Pang D W, Wang Z L, et al. Anal Chem, 2001, 73: 1048

[30] Huang W H, Chen W, Pang D W, et al. Anal Chem, 2004, 76: 483

[31] Gao J, Yin X F, Fang Z L. Lab Chip, 2004, 4: 47

[32] Xia F Q, Jin W R, Yin X F, et al. J Chromatogr A, 2005, 1063: 227

[33] Cai L, Firedman N, Xie X S. Nature, 2006, 440: 358

[34] Huang B, Wu H K, Bhaya D, et al. Science, 2007, 315: 81

[35] Gu S Q, Zhang Y X, Zhu Y, et al. Anal Chem, 2011, 83: 7570

[36] Zhu Z, Zhang W H, Leng X F, et al. Lab chip, 2012, 12: 3907

[37] Li L, Wang Q, Feng J, et al. Anal Chem, 2014, 86: 5101

[38] Li L, Li Q L, Chen P L, et al. Anal Chem, 2016, 88: 930

[39] Zhou J S, Tang H W, Wu Q S, et al. Journal of Analytical Science, 2003, 19 (1): 17

周錦松, 唐宏武, 吳瓊水, 等. 分析科學(xué)學(xué)報, 2003, 19 (1): 17

[40] Mei E W, Chen G Q, Gu W F, et al. Science in China (Series B), 1995, 25 (1): 7

梅二文, 陳觀銓, 顧文芳, 等. 中國科學(xué)(B輯), 1995, 25 (1): 7

[41] Mei E W, Gu W F, Chen G Q, et al. Anal Chem, 1996, 354: 250

[42] Chen G Q, Mei E W, Gu W F, et al. Anal Chim Acta, 1995, 300: 261

[43] Mei E W, Gu W F, Chen G Q, et al. Acta Chim Sinica, 1997, 55: 585

[44] Tan W H, Parpura V, Haydon P G, et al. Anal Chem, 1995, 67: 2575

[45] Xu X H, Yeung E S. Science, 1997, 275: 1106

[46] Xu X H, Yeung E S. Science, 1998, 281: 1650

[47] Cans A S, Wittenberg N, Karlsson R, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100: 400

[48] Cans A S, Wittenberg N, Even D, et al. Anal Chem, 2003, 75: 4168

[49] Qian W Q, Gee K R, Kennedy R T. Anal Chem, 2003, 75: 3468

[50] Bousso P, Bhakta N R, Lewis R S, et al. Science, 2002, 296: 1876

[51] Miller M J, Wei S H, Cahalain M D, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100: 2605

[52] Zhang C Y, Ma H, Nie S M, et al. Analyst, 2000, 12: 1029

[53] Maiti S, Shear J B, Williams R M, et al. Science, 1997, 275: 530

[54] Seisenberger G, Ried M U, Endress T, et al. Science, 2001, 294: 1929

[55] Bacia K, Kim S A, Schwille P. Nat Methods, 2006, 3: 83

[56] Bag N, Wohland T. Annu Rev Phys Chem, 2014, 65: 225

[57] Levine Y K. Anal Biochem, 1995, 227: 302

[58] Ng T, Squire A, Hansra G, et al. Science, 1999, 283: 2085

[59] Harris C M. Anal Chem, 2003, 75: 222

[60] Klar T A, Jakobs S, Dyba M, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97: 8206

[61] Betzig E, Patterson G H, Sougrat R, et al. Science, 2006, 313: 1642

[62] Hess S T, Girirajan T P K, Mason M D. Biophy J, 2006, 91: 4258

[63] Rust M J, Bates M, Zhuang X W. Nat Methods, 2006, 3: 793

[64] Huang B, Wang W Q, Bates M, et al. Science, 2008, 319: 810

[65] Huang B, Jones S A, Brandenburg B, et al. Nat Methods, 2008, 5: 1047

[66] Tsionsky M, Cardon Z G, Bard A J, et al. Plant Physiol, 1997, 113: 895

[67] Yasukawa T, Kondo Y, Uchida I, et al. Chem Lett, 1998, 8: 767

[68] Yasukawa T, Kaya T, Matsue T. Anal Chem, 1999, 71: 4637

[69] Feng W J, Rotenberg S A, Mirkin M V. Anal Chem, 2003, 75: 4148

[70] Isik S, Schuhmann W. Angew Chem Int Ed, 2006, 45: 7451

[71] Zhan D P, Fan F R F, Bard A J. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105: 12118

[72] Zhao X C, Zhang M N, Long Y T, et al. Can J Chem, 2010, 88: 569

[73] Li L J, Garden R W, Sweedler J V. Trends Biotechnol, 2000, 18: 151

[74] Rubakhin S S, Sweedler J V. Nat Protoc, 2007, 2: 1987

[75] Rubakhin S S, Romanova E V, Nemes P, et al. Nat Methods, 2011, 8: S20

[76] Garden R W, Shippy S A, Li L J, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95: 3972

[77] Li L J, Garden R W, Romanova E V, et al. Anal Chem, 1999, 71: 5451

[78] Li L J, Romanova E V, Rubakhin S S, et al. Anal Chem, 2000, 72: 3867

[79] Li L J, Moroz T P, Garden R W, et al. Peptides, 1998, 19: 1425

[80] Rubakhin S S, Greenough W T, Sweedler J V. Anal Chem, 2003, 75: 5374

[81] Soltwisch J, Kettling H, Vens-Cappell S, et al. Science, 2015, 348: 211

[82] Chandra S, Smith D R, Morrison G H. Anal Chem, 2000, 72: 104A

[83] Passarelli M K, Ewing A G. Curr Opin Chem Biol, 2013, 17: 854

[84] Colliver T L, Brummel C L, Pacholski M L, et al. Anal Chem, 1997, 69: 2225

[85] Roddy T P, Cannon D M, Meserole C A, et al. Anal Chem, 2002, 74: 4011

[86] Passarelli M K, Ewing A G, Winograd N. Anal Chem, 2013, 85: 2231

[87] Kurczy M E, Piehowski P D, Van Bell C T, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107: 2751

[88] Wei Z W, Han S, Gong X Y, et al. Angew Chem Int Ed, 2013, 52: 11025

[89] Gong X Y, Zhao Y Y, Cai S Q, et al. Anal Chem, 2014, 86: 3809

[90] Sun L L, Hebert A S, Yan X J, et al. Angew Chem Int Ed, 2014, 53: 13931

[91] Kruth H S. Anal Biochem, 1982, 125: 225

[92] Davey H M, Kell D B. Fems Microbiol Rev, 1996, 60: 641

[93] Mueller S, Nebe-von-Caron G. Fems Microbiol Rev, 2010, 34: 554

[94] Dolbeare F. J Histochem Cytochem, 1979, 27: 1644

[95] Murphy R F, Powers S, Cantor C R. J Cell Biol, 1984, 98: 1757

[96] Nebe-von-Caron G, Stephens P J, Hewitt C J, et al. J Microbiol Meth, 2000, 42: 97

[97] Krutzik P O, Crane J M, Clutter M R, et al. Nat Chem Biol, 2008, 4: 132

[98] Irish J M, Hovland R, Krutzik P O, et al. Cell, 2004, 118: 217

[99] Newman J R, Ghaemmaghami S, Ihmels J, et al. Nature, 2006, 441: 840

[100] Navin N, Kendall J, Troge J. Nature, 2011, 472: 90

[101] Ramskold D, Luo S J, Wang Y C, et al. Nat Biotech, 2012, 30: 777

[102] Wang J B, Fan H C, Behr B, et al. Cell, 2012, 150: 402

[103] Hou Y, Song L T, Zhu P, et al. Cell, 2012, 148: 873

[104] Xu X, Hou Y, Yin X Y, et al. Cell, 2012, 148: 886

[105] Brady G, Barbara M, Iscove N N. Methods Mol Cell Bio, 1990, 2: 17

[106] Tang F C, Barbacioru C, Wang Y Z, et al. Nat Methods, 2009, 6: 377

[107] Macosko E Z, Basu A, Satija R, et al. Cell, 2015, 161: 1202

[108] Yu J, Xiao J, Ren X J, et al. Science, 2006, 311: 1600

[109] Dada O O, Essaka D C, Hindsgaul O, et al. Anal Chem, 2011, 83: 2748

[110] Kneipp K, Wang Y, Kneipp H, et al. Phy Rev Let, 1997, 78: 1667

[111] Kneipp J, Kneipp H, Kneipp K. Chem Soc Res, 2008, 37: 1052

[112] Cai L, Friedman N, Xie X S. Science, 2006, 440: 7082

[113] Taniguchi Y, Choi P J, Li G W, et al. Science, 2010, 329: 5991

[114] Nie S M, Emer S R. Science, 1997, 275: 1102

[115] Byassee T A, Chan W C W, Nie S M. Anal Chem, 2000, 72: 5606

[116] Liu J, Yin D Y, Wang S S, et al. Angew Chem Int Ed, 2016, 55, 13215

[117] Li L, Lu Y, Bie Z J, et al. Angew Chem Int Ed, 2013, 52: 7451

[118] Wang S S, Ye J, Bie Z J, et al. Chem Sci, 2014, 5: 1135

[119] Bi X D, Liu Z. Anal Chem, 2014, 86: 959

[120] Ye J, Chen Y, Liu Z. Angew Chem Int Ed, 2014, 53: 10386

[121] Bie Z J, Chen Y, Ye J, et al. Angew Chem Int Ed, 2015, 54: 10211

Recent advances in single cell analysis technologies

LIU Jia, LIU Zhen*

(SchoolofChemistryandChemicalEngineeringofNanjingUniversity,StateKeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforLifeScience,Nanjing210023,China)

Cells are the basic units of the structure and activities of living species, and single cell-based research is the foundation of life science researches. Because of the tiny volume of cells, complex microenvironment within cells and the low concentrations of their components, single cell analysis is still a challenging task in many aspects. In this review, we summarize and discuss the recent advances in single cell analysis technologies, and emphasize the characteristics and the state of the applications of different techniques.

single cell analysis; capillary electrophoresis (CE); microfluidic chip; mass spectrometry (MS); review

10.3724/SP.J.1123.2016.08041

2016-08-31

國家杰出青年科學(xué)基金項目(21425520);國家重大科研儀器研制項目(21627810).

Foundation item: National Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 21425520); Key Grant from the National Natural Science Foundation of China (No. 21627810).

O658

A

1000-8713(2016)12-1154-07

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(上)·專論與綜述

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(025)9685639,E-mail:zhenliu@nju.edu.cn.