阿尼西坦緩釋片體內代謝產物的測定及藥代動力學研究

李連坤　張蕾　王甜甜　王雪　張雯娜　蔡廣知　貢濟宇

[摘要] 目的 建立阿尼西坦緩釋片體內代謝產物N-對甲氧基苯甲酰氨基丁酸（ABA）含量的測定方法。 方法 采用反相高效液相色譜法（HPLC法）測定ABA含量，Phenomenex ΜP-ODS C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈∶0.1%醋酸=25∶75，檢測波長：250 nm，柱溫：35 ℃。 結果 以氯仿∶甲醇為2∶8，渦旋振蕩30 s，離心10 min，于40℃下氮氣吹干處理血樣。在67.5～2150 μg/L范圍內線性關系良好，回收率為86.67%～93.58%，均在85%以上，符合實驗要求。主要藥代動力學參數為：阿尼西坦緩釋片的AΜC0-t為（342.13±110.23）μg/（min·ml），Cmax為（7.41±2.05）μg/ml，Tmax為（116.53±1.17）h；阿尼西坦普通片的AΜC0-t為（434.53±102.69）μg/（min·ml），Cmax為（7.46±1.87）μg/ml，Tmax為（28.29±1.11）h。 結論 本實驗建立的HPLC法，可以準確測定阿尼西坦體內代謝產物ABA的含量，適用于阿尼西坦緩釋片在家兔體內的藥代動力學研究。

[關鍵詞] 阿尼西坦；N-對甲氧基苯甲酰氨基丁酸；反相高效液相色譜法；血藥濃度；藥代動力學

[中圖分類號] R284.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）02（c）-0008-04

[Abstract] Objective To establish the determination method of N-anisoyl-GABA （ABA） content of metabolites in vivo for aniracetam sustained release tablet. Methods The content of ABA was determined by reversed-phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC method）.Phenomenex ΜP-ODS C18 chromatographic column （250×4.6 mm，5 μm） was used and the mobile phase was set as acetonitrile∶0.1% acetic acid =25∶75，detection wavelength was set at 250 nm，and column temperature was 35℃. Results The blood sample were blow-dried by nitrogen at 40℃ （chloroform∶methyl alcohol=2∶8，vortex oscillation for 30 s and centrifugation for 10 min）.The result showed favorable linear relation in range of 67.5～2150 μg/L.The recovery rate was 86.67%-93.58%，meeting the experiment requirements of above 85%.The main pharmacokinetic parameters was as follows：the aniracetam sustained release tablet，AΜC0-t=（342.13±110.23） μg/（min·ml），Cmax=（7.41±2.05） μg/ml，and Tmax=（116.53±1.17） h；the aniracetam conventional tablet，AΜC0-t=（434.53±102.69） μg/（min·ml），Cmax=（7.46±1.87） μg/ml，and Tmax=（28.29±1.11） h. Conclusion HPLC method established in this study can accurately determine the ABA content of metabolites in vivo for aniracetam，which is applicable to pharmacokinetic study of aniracetam sustained release tablet in rabbits in vivo.

[Key words] Aniracetam；N-anisoyl-GABA；Reversed-phase high performance liquid chromatography；Blood concentration；Pharmacokinetics

阿尼西坦是1-（4-甲氧基苯甲?；?-吡咯烷酮，可用于神經保護和增強記憶。有研究證明，阿尼西坦可改善中老年人記憶力，降低阿爾茨海默病的發(fā)病率，因此備受臨床關注[1]。阿尼西坦口服吸收后，血中達峰時間為20～40 min，生物半衰期為22 min，4 h后血藥濃度已很難測出，其代謝產物以N-對甲氧基苯甲酰氨基丁酸（ABA）為主（約占70%），故采用反相HPLC法[2]，測定血液中ABA的濃度。本文旨在建立血漿中ABA血藥濃度的反相HPLC法，并應用于家兔的阿尼西坦緩釋片的藥動學研究，為阿尼西坦緩釋片的臨床研究及開發(fā)提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器，美國安捷倫公司）；AB135-S型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒一托利多公司）； DCY-12S型氮吹儀（青島?？苾x器有限責任公司）；XH-C渦旋振蕩器（金壇市精達儀器制造有限公司）；TGL-16B高速離心機（湖南星科科學儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

阿尼西坦緩釋片、ABA對照品均為實驗室自制[3]、阿尼西坦片（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司；批號：20130517；規(guī)格：100 mg/片）；氫氯噻嗪對照品（中國藥品生物制品檢定所；批號：100309-201103；含量：99.4%）；甲醇、乙腈、氯仿均為江蘇漢邦公司色譜純；水為自制超純水；其他試劑均為分析純[4]。

1.3 實驗動物

健康家兔20只，雌雄兼用，體重為（2.0±0.2）kg，由遼寧省實驗動物動物資源中心提供[5]，許可證號：SCXK（遼）2014-0002。

2 結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex ΜP-ODSC18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶0.1%醋酸=25∶75（v/v）；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl[6]；柱溫：35℃；檢測波長250 nm。

2.2 溶液配制

2.2.1 ABA儲備溶液的配制 精密稱取ABA對照品10 mg，置于50 ml容量瓶中，用乙腈定容，得到濃度為200 μg/ml的ABA標準溶液，作為儲備液[7]。

2.2.2 內標液的配制 精密稱取氫氯噻嗪對照品約2 mg于10 ml容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得到濃度為200 μg/ml的氫氯噻嗪儲備液[8]，用乙腈稀釋，最后配得濃度為20 μg/ml的氫氯噻嗪溶液，作為內標液，置于4℃冰箱保存，備用。

2.2.3 空白血漿的制備 于家兔耳緣靜脈采血1 ml，置于含0.1 ml肝素鈉的離心管中，4000 r/min，離心10 min，將血漿取出，于-20℃冷凍層保存待測[9]。

2.3 血漿樣品的處理方法

取200 μl的空白血漿于1.5 ml的EP管中，依次加入200 μl的氫氯噻嗪內標液（20 μg/ml）以及200 μl ABA標準溶液，渦旋30 s后，再依次加入 200 μl氯仿[10]，800 μl甲醇后，渦旋振蕩2 min，13 000 r/min，離心20 min，吸取1.0 ml的上清液于另一干凈EP管中，40℃氮氣儀下吹干，殘渣用200 μl流動相溶解，精密進樣10 μl后分析，記錄色譜圖。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性考察 空白血漿，空白血漿添加ABA，空白血漿添加ABA、氫氯噻嗪，經處理后，進樣分析；ABA、氫氯噻嗪的保留時間分別為10.463、5.510 min，內源性物質對ABA、氫氯噻嗪無干擾，結果見圖1。

2.4.2 線性范圍 用空白血漿稀釋ABA儲備液，得到67.5、134.5、269、537.5、1075、2150 μg/L ABA系列標準血漿樣品。取各濃度標準血漿樣品200 μl，按2.3項下進行操作[11]，取10 μl進行反相HPLC分析，記錄色譜圖，ABA在67.5～2150 μg/L濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系?；貧w方程為Y=222.09X+85.664，r2=0.999。

2.4.3 回收率與精密度 配制低、中、高濃度分別為67.5、134.5、269、537.5、1075、2150 μg/L的ABA質控樣品各5份，按照2.3項方法進行操作，得低、中、高濃度的日內RSD為3.01%～6.93%；日間RSD為3.27%～10.08%；相對回收率為86.67%～93.58%。

2.4.4 樣品穩(wěn)定性考察 取空白血漿，加入ABA對照品溶液，按2.3項下方法處理，將血樣于4℃放置0、1、2、4、24 h，然后按反相HPLC條件測定，得到該濃度下ABA含量的RSD值為3.09%～10.75%。結果表明，兔子的血漿樣品在24 h內基本穩(wěn)定。

2.4.5 凍融穩(wěn)定性考察 根據采集樣品以及分析過程，同時考察低、中、高濃度（ABA血漿濃度分別為67.5、537.5、2150 μg/L的樣品，各制備5份。按2.3項下方法處理后，反復凍融3次，然后按反相HPLC條件測定[12]，得到該濃度下ABA含量的RSD值為3.14%～11.62%。結果表明在各種條件下樣品穩(wěn)定性良好。

2.5 藥代動力學研究

2.5.1 實驗動物 20只家兔（吉大實驗動物中心），雌雄兼用，體重為（2.5±0.5）kg。將家兔置于清潔實驗室中，給予標準飼料和飲用水，且控制室內溫度為（22±1）℃，相對濕度為40%～50%。

2.5.2 給藥方案與血樣采集 將20只家兔分為兩組，一組給予阿尼西坦普通片，一組給予阿尼西坦緩釋片，禁食10 h后灌服2片阿尼西坦片[13]（約相當于阿尼西坦主藥200 mg），適量水沖服。4 h后統(tǒng)一進行喂食、飲水，此實驗重復2個周期，每個周期中間間隔1周。普通片于及緩釋片均于服藥后10、20、30、40、120、160、240、360、540、720 min取血，每個時間點分別耳緣靜脈取血1.5 ml，放于含0.1 ml肝素的離心管中，3000 r/min，離心10 min，將血漿取出放于-20℃冷凍層保存待測。

2.5.3 平均血藥濃度-時間曲線 將凍存后的樣品取出，按照2.3項下進行操作。分別測得普通片和緩釋片的血藥濃度，繪制兩者的藥-時曲線，結果見圖2。

2.5.4 藥代動力學參數 分別記錄20只健康家兔單劑量口服阿尼西坦緩釋片200 mg及普通片200 mg后ABA血藥濃度值，采用3P97軟件處理，其主要藥代動力學參數見表1。

3 討論

阿尼西坦口服進入人體后，很快代謝為主要代謝產物ABA，因此，阿尼西坦的血藥濃度很低，難以準確測定[14]，而ABA的血藥濃度較高，穩(wěn)定性好，便于測定。目前國外已有文獻報道[15]，采用反相HPLC法測定阿尼西坦及其代謝產物ABA含量，但樣品預處理過程較復雜。本研究在此基礎上，采用反相HPLC法對阿尼西坦緩釋片活性代謝產物ABA的血藥濃度進行測定，對實驗條件及方法進行了改進和創(chuàng)新，直接采用甲醇∶氯仿（2∶8）兩項配比的方法對血樣進行一次性液液萃取，結果表明此種萃取方法的效果明顯高于常規(guī)的單溶劑萃取法，大大提高了提取率，優(yōu)化了提取方法。此外，本實驗對不同內標物的選擇進行了考察比對，結果發(fā)現(xiàn)以氫氯噻嗪作為內標，保留時間為5.510 min，與非那西丁、對羥甲基苯甲酸甲酯（JNB）等（保留時間均為9 min左右）比較，可有效縮短進樣分析時間，利于大樣本量待測物的分析，且可保證血中內源性雜質與ABA均可達到基線分離，互不影響[16]。

綜上所述，本文建立的反相HPLC法操作簡單，精密度高、重現(xiàn)性好，符合人體生物利用度實驗要求，已成功應用于阿尼西坦的生物等效性研究，為進一步研究阿尼西坦在人體內的藥代動學過程奠定了基礎，具有可行性和可推廣性。

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（收稿日期：2015-09-07 本文編輯：許俊琴）