銀杏葉提取物對(duì)睡眠剝奪小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制的研究

唐夢(mèng)晨　陳嬌　徐文杰　李凌

[摘要] 目的 研究銀杏葉提取物（EGB）對(duì)睡眠剝奪小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制。 方法 選取成年健康清潔級(jí)小鼠48只，雌雄各半，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為4組（n=12）：空白組，對(duì)照組，治療Ⅰ組，治療Ⅱ組，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，每組篩選出9只進(jìn)行造模。應(yīng)用72 h睡眠剝奪法制作動(dòng)物模型，用Y迷宮成績(jī)（正確反應(yīng)次數(shù)）評(píng)定學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組織化學(xué)法反映小鼠海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的蛋白表達(dá)。 結(jié)果 Y迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，給藥后，對(duì)照組與治療Ⅰ組、對(duì)照組與治療Ⅱ組的正確反應(yīng)次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組給藥前后的正確反應(yīng)次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與對(duì)照組比較，空白組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組海馬區(qū)的BDNF表達(dá)增高，其灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但空白組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組各組間的灰度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 睡眠剝奪能造成腦損傷、學(xué)習(xí)記憶能力減退以及BDNF表達(dá)減少，EGB可能是通過上調(diào)BDNF蛋白及其相關(guān)通路蛋白改善睡眠剝小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

[關(guān)鍵詞] 銀杏葉提取物；睡眠剝奪；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；學(xué)習(xí)記憶

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）02（c）-0004-04

[Abstract] Objective To study the influence extract of Ginkgo biloba （EGB） on learning and memory ability in sleep-deprivation mice and its mechanism. Methods Forty-eight healthy and clean adult mice were selected，half male and half female，and they were evenly divided into 4 groups according to the random number table method：blank group，control group，treatment groupⅠ， and treatment group Ⅱ，and they were given adaptive feeding for 3 days，9 mice were selected in each group to make model.72-hour of sleep-deprivation method model was applied.The learning and memory ability was evaluated by achievement of Y maze.The protein expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in hippocampal area in mice was reflected by immunohistochemistry. Results Test result of Y maze showed that，after administration，there was a statistical difference of right reaction times between control group and treatment groupⅠ，and between control group and treatment groupⅡ （P<0.05）；there was a statistical difference of right reaction times before and after administration in control group （P<0.05），the other three groups had no statistical difference （P>0.05）.Compared with control group，BDNF expression of hippocampal area in blank group，treatment group Ⅰ，and treatment group Ⅱ was improved，and there was a statistical difference of gray value （P<0.05），however，there was no statistical difference of gray value among all groups （blank group，treatment group Ⅰ，and treatment group Ⅱ） （P>0.05）. Conclusion Sleep-derivation can lead to cerebral damage，decreased learning and memory ability，and reduction of BDNF expression，and EGB may improve learning and memory in sleep-deprivation mice by up-regulating BDNF protein and its related pathway protein.

[Key words] Extract of Ginkgo biloba；Sleep-deprivation；Brain-derived neurotrophic factor；Learning and memory

睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）一般指在24 h中的睡眠<4 h，可以引起生理，心理甚至行為的變化[1]。機(jī)體處于正常睡眠狀態(tài)下，腦內(nèi)某些蛋白增加，對(duì)新突觸的建立及學(xué)習(xí)記憶有很大的促進(jìn)作用[2]。有研究[3]表明，中長(zhǎng)期SD大鼠前額葉皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）免疫陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)顯著減少，可造成腦損傷，影響學(xué)習(xí)記憶能力。研究[4]表明，BDNF直接參與學(xué)習(xí)的可塑性，是管理和存儲(chǔ)記憶的動(dòng)力學(xué)因素，可能是調(diào)控學(xué)習(xí)和記憶的一個(gè)重要分子標(biāo)志物。在成年中樞系統(tǒng)，BDNF的表達(dá)受很多因素的調(diào)節(jié)，同時(shí)通過調(diào)節(jié)突觸的可塑性影響學(xué)習(xí)記憶[5]。大量研究[6]表明，在正常腦中生理劑量的BDNF對(duì)學(xué)習(xí)記憶有促進(jìn)作用。

銀杏葉提取物（extract of Ginkgo biloba，EGB）已被國(guó)內(nèi)外用于改善腦功能不全患者的學(xué)習(xí)記憶能力， 是一種 “認(rèn)知增強(qiáng)劑”[7]。 據(jù)報(bào)道[8]，EGB具有提高內(nèi)源性BDNF表達(dá)水平的作用，作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。那么，EGB能否改善SD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，目前尚無(wú)報(bào)道。

本研究擬采用行為學(xué)、免疫組織化學(xué)法等，一方面研究EGB對(duì)SD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，另一方面研究EGB對(duì)SD小鼠海馬BDNF的影響，進(jìn)而揭示其可能的作用機(jī)制，為尋找能改善SD對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力影響的方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取成年健康清潔級(jí)小鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量為（23±2）g，由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于相對(duì)濕度在30%～40%的動(dòng)物房，光照節(jié)律為12L∶12D（8：00～20：00），溫度為（25±1）℃。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，分別為空白組，對(duì)照組，治療Ⅰ組，治療Ⅱ組。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，期間進(jìn)行站臺(tái)訓(xùn)練，每天訓(xùn)練30 min，可自由飲水及進(jìn)食，避免噪聲。每組篩選出9只訓(xùn)練合格的小鼠進(jìn)行造模。

1.2 迷宮訓(xùn)練

實(shí)驗(yàn)時(shí)先將小鼠放入迷宮適應(yīng)3 min，燈亮?xí)r該臂有電，小鼠受電擊后逃到安全區(qū)，此區(qū)內(nèi)無(wú)燈光。燈光持續(xù)10 s后，隨機(jī)變化電擊區(qū)，進(jìn)行下一次測(cè)試。每個(gè)實(shí)驗(yàn)日連續(xù)測(cè)試20次，記錄正確反應(yīng)次數(shù)，所用參數(shù)：電壓為50～70 V，延時(shí)5 s。各組造模前3天進(jìn)行每天20次的訓(xùn)練，取第3天成績(jī)作為造模前成績(jī)（正確反應(yīng)次數(shù)）；給藥后再進(jìn)行測(cè)試。

1.3 動(dòng)物模型制備

應(yīng)用改良多平臺(tái)睡眠剝奪法（modified multiple platform method，MMPM）（72 h睡眠剝奪法）制作動(dòng)物模型：各組從造模第1天，8：00 開始放入睡眠剝奪箱，連續(xù)3 d，至第4天早8：00結(jié)束。用大鼠籠[規(guī)格：48 cm（長(zhǎng)）×40 cm（寬）×34 cm（高）]自制簡(jiǎn)易睡眠剝奪箱，其底面均勻固定9個(gè)上表面積2.5 cm×2.5 cm的木平臺(tái)。箱內(nèi)注水，平臺(tái)高出水面0.5 cm，水溫保持在室溫24～26℃。箱頂置鐵絲網(wǎng)。每天更換箱中的水。

1.4 主要藥品與試劑

銀杏葉片（每片含總黃酮醇苷19.2 mg，萜類內(nèi)酯4.8 rag，批號(hào)：20070403）：貴州信邦制藥股份有限公司；BDNF試劑盒：武漢博士德；SABC（兔IgG）：武漢博士德；PBS液：北京中杉金橋；DAB顯色劑：武漢博士德。

1.5 實(shí)驗(yàn)處理

空白組：正常睡眠，等量去離子水灌胃5 d；對(duì)照組：睡眠剝奪，等量去離子水胃5 d；治療Ⅰ組：睡眠剝奪，EGB 9 ml/10 g灌胃5 d；治療Ⅱ組：睡眠剝奪，EGB 18 ml/10 g灌胃5 d。給藥后第6天開始再次分別對(duì)4組小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)法

造模結(jié)束，經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)，麻醉成功后，將小鼠仰臥固定于手術(shù)板上，剪開前胸壁肋骨，暴露心臟，小心分離出升主動(dòng)脈并在其下穿1根1號(hào)手術(shù)線備用，將灌注針從心尖插入升主動(dòng)脈，用準(zhǔn)備好的手術(shù)線將灌注針固定于升主動(dòng)脈，在左心耳剪1個(gè)小口，輸液器接于灌注針尾部，止血鉗夾閉腹主動(dòng)脈，小鼠頭低腳高位，快速灌注生理鹽水直至流出液變清，再以4℃的4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，直至小鼠頭頸變硬，快速斷頭取腦，取海馬，連續(xù)冠狀切片，PBS漂洗3次，3 min/次，去離子水沖洗；以3%過氧化氫溶液孵育20 min，PBS漂洗3次，3 min/次；正常羊血清封閉（3∶200，37℃，15 min）；傾去血清，勿洗，滴加一抗（BDNF兔來(lái)源）（1∶60，4℃過夜），PBS漂洗3次，3 min/次；滴加二抗（1∶200，37℃），孵育10 min，PBS漂洗3次，3 min/次；滴加AB液（1∶100， 37℃，40 min），PBS漂洗3次，3 min/次；DAB顯色（1∶20）；最后進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，晾干后進(jìn)行鏡下觀察、拍照。蛋白表達(dá)相對(duì)量以灰度值表示。各組隨機(jī)選取3只小鼠，每只小鼠隨機(jī)選取3個(gè)部位，每個(gè)部位9個(gè)視野，應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件分析，Y迷宮成績(jī)、海馬內(nèi)BDNF蛋白含量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One Way-ANOVA）檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠給藥前后正確反應(yīng)次數(shù)的比較

Y迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，對(duì)照組給藥前后的正確反應(yīng)次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；給藥后，對(duì)照組與治療Ⅰ組、對(duì)照組與治療Ⅱ組的正確反應(yīng)次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2 4組小鼠BDNF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，BDNF主要表達(dá)于海馬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色的為陽(yáng)性。對(duì)照組與空白組比較，BDNF蛋白表達(dá)明顯減少（圖1A、圖1B）。與對(duì)照組比較，空白組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組海馬區(qū)的BDNF表達(dá)增高（圖1A～圖1D），其灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但空白組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組各組間灰度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖1A、圖1C、圖1D）（表2）。

2.3 SD開始前后4組小鼠精神狀況與活動(dòng)能力的比較

SD開始前，4組小鼠飼養(yǎng)條件一致，精神狀況與活動(dòng)能力基本一致，體重持續(xù)增長(zhǎng)。SD開始后，對(duì)照組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組精神萎靡、活動(dòng)減少，且情況持續(xù)加重。SD 72 h，36只小鼠均存活。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，Y迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，對(duì)照組給藥前后的正確反應(yīng)次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明SD會(huì)造成小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[9]。給藥后，對(duì)照組與治療Ⅰ組、對(duì)照組與治療Ⅱ組的正確反應(yīng)次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明EGB對(duì)SD小鼠學(xué)習(xí)記憶有改善作用。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，EGB可能促進(jìn)海馬BDNF的表達(dá)。小鼠海馬BDNF的表達(dá)增高，對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶有保護(hù)作用；EGB可改善SD小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，可能是通過上調(diào)海馬BDNF表達(dá)引起的。由此可推測(cè)，EGB對(duì)改善SD患者的學(xué)習(xí)記憶障礙有一定作用[10]。目前的研究證實(shí)，一定劑量的EGB對(duì)認(rèn)知功能具有改善作用[11-12]。

德國(guó)神經(jīng)生物學(xué)家Barde等[13]于1982年首次從豬腦中發(fā)現(xiàn)BDNF，目前研究發(fā)現(xiàn)，BDNF廣泛存在于腦內(nèi)各個(gè)區(qū)域，以海馬和皮質(zhì)居多，與疼痛[14]、抑郁[15]、學(xué)習(xí)記憶[16]等相關(guān)，而越來(lái)越多的研究[17-19]證實(shí)，BDNF在學(xué)習(xí)記憶中占至關(guān)重要的地位，可能與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，SD小鼠雖精神萎靡，但攻擊性增強(qiáng)，可能處于應(yīng)激狀態(tài)。有研究表明[20]，長(zhǎng)期應(yīng)激可使下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）高激活，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)糖皮質(zhì)激素異常增高，與海馬內(nèi)存在的大量糖皮質(zhì)激素受體選擇性結(jié)合，從而導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)異常。

綜上所述，EGB可以保護(hù)SD小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，上調(diào)海馬區(qū)BDNF的表達(dá)，提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，且EGB安全性好，無(wú)明顯毒副作用，來(lái)源充足，價(jià)格低廉，因此，EGB可以作為改善SD學(xué)習(xí)記憶能力的藥物，值得進(jìn)一步臨床研究。不同劑量EGB對(duì)改善SD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的效果也可作相關(guān)研究。

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（收稿日期：2015-09-18 本文編輯：許俊琴）