布渣葉超高效液相指紋圖譜研究

陳偉韜梁之桃周立敏周勁松趙中振

（1廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州，510095；2香港浸會(huì)大學(xué)，香港；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州，510405）

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布渣葉超高效液相指紋圖譜研究

陳偉韜1，2梁之桃2周立敏2周勁松3趙中振2

（1廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州，510095；2香港浸會(huì)大學(xué)，香港；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州，510405）

摘要目的：建立布渣葉超高效液相指紋圖譜，為快速有效對(duì)布渣葉進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，改進(jìn)其質(zhì)量控制方法提供理論依據(jù)。方法：采用Waters Acquity BEH UPLC C18色譜柱（2. 1 mm×100 mm，1. 7 μm），以乙腈-0. 1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，檢測(cè)波長為278 nm，流速為0. 3 mL／min，柱溫為20℃；對(duì)建立的布渣葉指紋譜圖進(jìn)行相似度計(jì)算，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。結(jié)果：方法學(xué)考察結(jié)果良好，確立了11個(gè)共有峰，布渣葉指紋圖譜的相似度明顯高于偽品；主成分分析結(jié)果顯示布渣葉密集分布在一個(gè)區(qū)域內(nèi)，偽品分布在該區(qū)域外。結(jié)論：該方法穩(wěn)定可靠，能對(duì)布渣葉藥材作出真?zhèn)蝺?yōu)劣評(píng)價(jià)，為建立布渣葉超高效液相指紋圖譜提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞布渣葉；指紋圖譜；超高效液相色譜。

Study on Chemlcal Flngerprlnt of Mlcroctls Follum by Ultra Performance Llquld Chromatography

Chen Weitao1，2，Liang Zhitao2，Zhou Limin2，Zhou Jinsong3，Zhao Zhongzhen2
（1 Guangdong Province Engineering Technology Research Institude of T. C. M.，Guangzhou China；2 Hong Kong Baptist University，Hong Kong China；3 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou China）

Abstract Objectlve：To establish the chemical fingerprint of Microctis Folium by ultra performance liquid chromatography（UPLC）. Methods：The separation was developed on ACQUITY UPLC BEH C18column（2. 1 mm×100 mm，1. 7 μm）by gradient elution with acetonitrile-water containing 0. 1%formic acid as mobile phase at a flow rate of 0. 3 mL／min，the detection wavelength at 278 nm and column temperature at 20℃. The fingerprint was evaluated by similarity assay and principal component analysis （PCA）. Results：Eleven characteristic peaks were established in the fingerprint，and two peaks were identified. The similarities of Microctis Folium was calculated and used for differentiating its adulterant. PCA showed that Microctis Folium and its adulterant were distinctly separated by the three most important principal components. Concluslon：The method is stable and reliable which could be applied to the authentication and quality control of Microctis folium.

Key Words Microctis Folium；Fingerprint；UPLC

布渣葉（Microctis Folium）來源于椴樹科（Tiliaceae）植物破布葉（Microcos paniculata L.）的干燥葉。性涼、味微酸，歸脾、胃經(jīng)。有消食化滯，清熱利濕的功效，可用于治療飲食積滯，感冒發(fā)熱，濕熱黃疸［1-2］。布渣葉分布于廣東、海南、廣西、云南等地［3］。其中以廣東分布資源最為豐富，廣東的陽西、湛江是主產(chǎn)地。生于叢林中、灌叢中或路旁。本品無毒，民間有將其采葉曬干泡茶飲的習(xí)慣，亦是涼茶配方的常見材料，有清熱、解渴、開胃的作用。

目前2010版中國藥典對(duì)評(píng)價(jià)布渣葉質(zhì)量的含量檢測(cè)成分僅牡荊苷一項(xiàng)，牡荊苷具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、降糖等與布渣葉功效相關(guān)的藥理作用［4-6］，但并無直接證據(jù)可表明牡荊苷為布渣葉的有效成分［7］，且以單一成分的檢測(cè)來評(píng)價(jià)中藥過于片面［8］，因此建立布渣葉指紋圖譜具有科學(xué)意義。本研究采用UPLC建立布渣葉指紋圖譜，與現(xiàn)時(shí)布渣葉指紋圖譜的研究相比較，具有分析時(shí)間更短，分析能力更強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)［9-10］。研究通過相似度計(jì)算、主成分分析等方法對(duì)指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，為布渣葉質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供一種快速、高效的新方法。

1　資料與方法

1. 1 儀器 ACQUITY UPLC（Waters，配有二極管數(shù)組檢測(cè)器，Empower2色譜工作站）；MILLIPORE純水機(jī)（美國）；冷凍干燥機(jī)（TriadTM）；分析天平（AdventurerTM）；離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5810）；高速離心機(jī)Eppendorf Centrifuge 5417R，超聲儀（CREST）。

1. 2 試劑 甲醇為分析純（RCI Labscan Limited）；液相色譜用的甲醇、乙腈、甲酸為色譜純（RCI Labscan Limited）；水為超純水。

1. 3 藥品 布渣葉藥材經(jīng)廣州醫(yī)藥大學(xué)周勁松博士鑒定為椴樹科植物破布葉（Microcos paniculata L.）的干燥葉，樣品來源見表1，其中18至21號(hào)為新鮮采摘后冷凍干燥品，10號(hào)樣本為偽品。牡荊苷（上海同田生物技術(shù)有限公司，13082932）；異牡荊苷（成都瑞芬思生物科技，Y-116-131015）；布渣葉對(duì)照藥材（中國藥品生物制品檢定所，QUZL-8E3N）。

表1　布渣葉藥材樣品來源表

1. 4 方法

1. 4. 1 色譜條件 色譜儀：ACQUITY UPLC（Waters）；色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（2. 1 mm×100 mm，1. 7 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0. 1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，按表2進(jìn)行梯度洗脫；柱溫：20℃；流速：0. 3 mL／min；檢測(cè)波長：278 nm；進(jìn)樣量：2 L。

表2　梯度洗脫條件

1. 4. 2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取牡荊苷、異牡荊苷適量，加入100%甲醇溶解，配成每1 mL含0. 1 g的混合對(duì)照品溶液，即得。

1. 4. 3 供試品溶液的制備 取各批次布渣葉樣品粉末（過40目篩）約1 g，置于50 mL離心管中，精密加入100%甲醇20 mL，稱定重量，超聲（220 W，40 kHz）60 min，冷卻，用100%甲醇補(bǔ)足減少的重量，以3 000 r／min離心5 min，取上清液1 mL至2 mL離心管中，再以12 000 r／min離心10 min，取上清液，即得。

圖1　22批藥材樣品UPLC色譜圖

圖2　對(duì)照品UPLC色譜圖

圖3　典型布渣葉UPLC指紋圖譜

2　結(jié)果

2. 1 精密度試驗(yàn) 取同一份布渣葉樣品供試品溶液（3號(hào)樣品），連續(xù)進(jìn)樣3次。記錄主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積，各色譜峰保貿(mào)時(shí)間RSD為0. 02% ～0. 19%；各色譜峰峰面積RSD為3. 08%～8. 04%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2. 2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份布渣葉供試品溶液（3號(hào)樣品）分別在0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣分析。記錄主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積，各色譜峰保貿(mào)時(shí)間RSD為0. 09%～0. 42%；各色譜峰峰面積RSD 為3. 33%～8. 58%。結(jié)果表明各成分在48 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2. 3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的布渣葉樣品粉末3份（3號(hào)樣品），分別按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析。記錄主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積，各色譜峰保留時(shí)間RSD為0. 04%～3. 23%；各色譜峰峰面積RSD為0. 44%～7. 43%。結(jié)果表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2. 4 布渣葉指紋圖譜分析

2. 4. 1 布渣葉指紋圖譜建立 取布渣葉藥材21批以及對(duì)照藥材，共22批，按1. 4. 3項(xiàng)下制備供試品溶液，以1. 4. 1項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，得22批樣品（含對(duì)照藥材和偽品）色譜圖，見圖1。取對(duì)照品溶液，以相同條件檢測(cè)，見圖2。從圖1可明顯看出10號(hào)樣品為偽品，18～21號(hào)樣品為新鮮采摘后冷凍干燥品，圖譜與其他布渣葉樣品的比較有差異。從其余17批樣品中可見典型布渣葉UPLC指紋圖譜，存在11個(gè)共有峰，根據(jù)對(duì)照品色譜圖，指認(rèn)出其中2個(gè)共有峰，分別為牡荊苷、異牡荊苷，見圖3。

2. 4. 2 共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積計(jì)算

以6號(hào)共有峰為參照，分別計(jì)算各批布渣葉樣品和對(duì)照藥材圖譜中11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表3、表4。結(jié)果顯示11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1%，共有峰的平均相對(duì)保留時(shí)間（min）為：0. 36、0. 46、0. 61、0. 63、0. 78、1. 00（牡荊苷）、1. 03（異牡荊苷）、1. 24、1. 45、1. 54、 1. 61。11個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積變異較大，顯示不同來源的布渣葉樣品之間，其質(zhì)量差異較大。

表3　11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表4　11個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積

表5　布渣葉色譜圖與對(duì)照藥材色譜圖相似度計(jì)算

2. 4. 3 相似度分析 把21批布渣葉樣品色譜圖導(dǎo)入中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)軟件，以對(duì)照藥材為參照?qǐng)D譜，用全圖譜夾角余弦法計(jì)算各樣品與之的相似度，見表5。結(jié)果顯示10號(hào)樣品的相似度明顯低于其他樣品，支持10號(hào)樣品為偽品的結(jié)論。

2. 4. 4 主成分分析 把22批（含對(duì)照藥材）布渣葉指紋圖譜導(dǎo)入IBM SPSS 21 Statistics軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，見圖4。由于10號(hào)樣品外觀性狀上與正品布渣葉也存在明顯不同，可明確其為偽品。主成分分析結(jié)果顯示10號(hào)樣品的指紋圖譜特征明顯與其他樣品不同，本研究所建立的化學(xué)指紋圖譜明顯可以區(qū)分布渣葉偽品。同時(shí)，相似度分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致，2種方法得到了相互驗(yàn)證。見圖4。

圖4　22批（含對(duì)照藥材）布渣葉主成分分析結(jié)果

3　討論

實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件和樣品制備方法進(jìn)行了考察。色譜檢測(cè)采用DAD檢測(cè)器作全波長掃描，其中278 nm，色譜峰較多，峰面積較大，峰形較好，色譜信息豐富，故選擇278 nm作為檢測(cè)波長。

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液3種流動(dòng)相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-甲酸水溶液系統(tǒng)色譜峰信息最為豐富，并最終選擇乙腈-0. 1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。另甲醇-水系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致柱壓較高，縮短色譜柱使用壽命，不建議使用。

實(shí)驗(yàn)還考察了柱溫分別為20℃、30℃、40℃時(shí)對(duì)色譜圖的影響，發(fā)現(xiàn)隨著柱溫升高，保留時(shí)間減少，部分色譜峰峰面積減少甚至消失，綜合考慮，選擇20℃作為柱溫。

在樣品制備方面，比較了用不同濃度甲醇提取樣品和不同提取方法對(duì)色譜圖的影響。當(dāng)中以100%甲醇提取樣品所得的色譜圖色譜峰最多，峰面積最大，選定為提取溶劑。又考察了超聲與加熱回流兩種提取方法，發(fā)現(xiàn)無明顯差異，由于超聲方法操作較為簡(jiǎn)便，故選作為樣品提取方法，超聲時(shí)間為60 min。

本研究采用超高效液相色譜法對(duì)21批布渣葉樣品進(jìn)行分析，建立布渣葉指紋圖譜，通過相似度計(jì)算和主成分分析對(duì)指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)方法通過方法學(xué)考察，結(jié)果良好，成功建立了布渣葉超高效液相指紋圖譜，確立了11個(gè)共有峰。圖譜評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10號(hào)樣品相似度明顯較其他樣品低，主成分分析亦表明10號(hào)樣品與其他樣存在較大差異，兩種評(píng)價(jià)方法結(jié)果一致。因此該方法能從布渣葉樣品中把偽品區(qū)分開來，達(dá)到鑒別和質(zhì)量控制的目的。

觀察圖1可得不同布渣葉樣品之間色譜峰差異主要體現(xiàn)在25～40 min這段時(shí)間內(nèi)，表明出該部份化學(xué)成分及其含量的不同，在比較藥材粉末后發(fā)現(xiàn)，不同樣品粉末顏色有所不同，從褐至墨綠不等，這提示成分差異可能與植物色素或其他物質(zhì)有關(guān)。

另外，四批新鮮采摘后經(jīng)冷凍干燥的18～21號(hào)樣品相似度相對(duì)較低，原因可能與采收時(shí)間和干燥方法有關(guān)。

中藥指紋圖譜與以往的單一成分檢測(cè)相比較，更能體現(xiàn)中藥的復(fù)雜性和整體性，更好地中藥質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)?，F(xiàn)時(shí)中藥色譜指紋圖譜中以高效液相色譜法的研究較多，已有關(guān)于布渣葉高效液相指紋圖譜的文獻(xiàn)報(bào)道［11］。本次研究運(yùn)用的超高效液相色譜法較以往的高效液相色譜法具有分析時(shí)間短，分離度、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，研究應(yīng)用前景廣闊［12］。本研究建立的布渣葉超高效液相指紋圖譜經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，為布渣葉質(zhì)量控制的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

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（2015－05－25收稿 責(zé)任編輯：張文婷）

思路與方法

中圖分類號(hào)：R285. 5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 040

通信作者：趙中振，男，博士，教授，研究方向：中藥鑒定和中藥品質(zhì)控制方面的研究，Tel：（00852）34112424；E-mail：zzzhao＠hkbu. edu. hk

作者簡(jiǎn)介：陳偉韜（1990—），男，碩士，研究方向：中藥質(zhì)量分析的研究；E-mail：chenwt009＠126. com

基金項(xiàng)目：廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省項(xiàng)目（編號(hào)：20142012）