維藥制劑藥渣中蛋白質(zhì)及游離氨基酸的含量測(cè)定

張鳳雪文 娥李柯翱季志紅田樹革

（1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊，830054；2新疆奇康哈博維藥股份有限公司，烏魯木齊，830026；3新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊，830054）

?

維藥制劑藥渣中蛋白質(zhì)及游離氨基酸的含量測(cè)定

張鳳雪1文 娥1李柯翱2季志紅2田樹革3

（1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊，830054；2新疆奇康哈博維藥股份有限公司，烏魯木齊，830026；3新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊，830054）

摘要目的：測(cè)定藥渣中蛋白質(zhì)及氨基酸的含量。方法：用考馬斯亮藍(lán)G-250、茚三酮顯色，分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)及氨基酸的含量。結(jié)果：CBB G-250顯色測(cè)定蛋白質(zhì)線性范圍0. 081～0. 202 mg，加樣回收率102. 06%、RSD為0. 99%；茚三酮顯色測(cè)定氨基酸的線性范圍0. 016～0. 029 mg／mL，加樣回收率99. 83%、RSD為1. 82%。結(jié)論：CBB G-250和茚三酮顯色，均具有簡便、快速、靈敏度高、成本低、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞藥渣；蛋白質(zhì)；氨基酸；茚三酮；考馬斯亮藍(lán)；分光光度法；含量測(cè)定

Determlnatlon of Proteln and Free Amlno Acld wlthln the Resldues of Uygur Medlclne

Zhang Fengxue1，Wen E1Li Ke'ao2，Ji Zhihong2，Tian Shuge3
（1 College of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；2 Xinjiang Qikang Habo Uygur Medicine Limited Liability Company，Urumqi 830026，China；3 The Central Laboratory of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China）

Abstract Objectlve：To determine the content of protein and free amino acid within the residues of the Uygur medicine. Methods：The protein and amino acid content were determined by spectrophotometry with colored by coomassie brilliant blue G-250 and inhydrin. Results：The linear range of protein determined by CBB G-250 chromogenic assay was 0. 081～0. 202mg，recovery was 102. 06%，RSD was 0. 99%；the linear range of free amino acid by Ninhydrin chromogenic assay was 0. 016-0. 029mg／mL，recovery was 99. 83%，RSD was 1. 82%. Concluslon：CBB G-250 and ninhydrin chromogenic assay is simple，rapid with high sensitivity，low cost，fine reproducible characteristics and so on.

Key Words Residues of medicine；Protein；Free amino acid；Ninhydrin；Coomassie brilliant blue；Spectrophotometry；Content determination

我國藥渣根據(jù)原料來源，類型主要有中藥渣、生物制藥藥渣、藏藥渣、抗生素類藥渣等，其中中藥渣所占的比例最大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中藥渣在我國的排放量逐漸增加，平均年排放量已達(dá)3千萬噸［1］。藥渣中含有豐富的粗蛋白、碳水化合物、粗纖維、無機(jī)物和粗脂肪等［2-5］，這些藥渣若被丟棄會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，這些藥渣的處理將是刻不容緩的問題。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì)及氨基酸的含量，有效的解決藥渣的處理難題，易污染等問題，并為后期如何利用藥渣栽培食用菌［6-7］、制成有機(jī)肥［8-9］提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)。

1　儀器與試劑

1. 1 儀器 KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），AL04型萬分之一電子天平（德國梅特勒-托利多儀器有限公司），752紫外可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），B-260型水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠），TDL-40B低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1. 2 試劑 牛血清白蛋白（批號(hào)：0332-201304，上海勵(lì)瑞科技有限公司），精氨基酸（批號(hào)：100080-200908，中國藥品生物制品檢定所），CBB G-250 （Fluka進(jìn)口分裝，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司），茚三酮（批號(hào)：20140216，上?？曝S實(shí)業(yè)有限公司），磷酸，乙醇等均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2. 1 游離氨基酸的含量測(cè)定

2. 1. 1 測(cè)定波長的選擇 取樣品溶液和對(duì)照品溶液適量，在紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行400～800 nm波長掃描，二者均在567 nm附近有最大吸收，因此選擇567 nm為測(cè)定波長［10-11］。

2. 1. 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取10 mg精氨酸對(duì)照品，加蒸餾水溶解于50 mL容量瓶中，搖勻，得精氨酸對(duì)照品溶液的濃度為0. 2 mg／mL的。

2. 1. 3 供試品溶液的制備 精密稱取藥渣粗粉1 g，加25 mL蒸餾水超聲30 min，離心，過濾，濾液備用。

2. 1. 4 顯色劑的配制 2%的茚三酮的配制：精密稱取4 g茚三酮放入200 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，備用。pH＝6. 8的磷酸緩沖液的配制：精密稱取磷酸二氫鉀3. 4 g，氫氧化鈉0. 472 5 g，加蒸餾水并稀釋至500 mL，備用［11-12］。

2. 1. 5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取上述對(duì)照品溶液0. 0、0. 8、1. 0、1. 1、1. 3、1. 4 mL分別置于10 mL具塞試管中，各加入2%的茚三酮乙醇溶液2 mL，搖勻，再加pH＝6. 8的磷酸緩沖液1 mL，搖勻，在沸水浴中加熱15 min，取出，在冷水中迅速放涼，用蒸餾水補(bǔ)足至10 mL，搖勻，在567 nm處用分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值。橫坐標(biāo)為精氨酸對(duì)照品溶液的濃度（mg／mL）縱坐標(biāo)為吸光度值A(chǔ)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得回歸方程：A＝42. 523C-0. 453 9（R2＝0. 999 5），在所測(cè)量的游離氨基酸濃度范圍內(nèi)濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2. 1. 6 方法學(xué)考察

2. 1. 6. 1 精密度 分別精密吸取6份精氨酸對(duì)照品溶液各1. 1 mL于10 mL具塞試管中，按照“2. 1. 5”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法操作，測(cè)定其在567 nm處吸光度值，RSD為1. 02%（n＝6）。

2. 1. 6. 2 重復(fù)性 取3號(hào)樣品1 g，按“2. 1. 3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法操作，得濾液，精密吸取提取液0. 8 mL，按照“2. 1. 5”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法操作，測(cè)定樣品中氨基酸吸光度值，并計(jì)算，RSD為0. 92%（n＝6）。

2. 1. 6. 3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密量取精氨酸對(duì)照品溶液1. 1 mL，按照“2. 1. 5”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法操作，每隔2 h測(cè)定吸光度值，RSD為2. 27%（n＝6）。試驗(yàn)表明在10 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2. 1. 6. 4 加樣回收率試驗(yàn) 利用加標(biāo)回收法，分別吸取已知氨基酸含量已知的藥渣提取液0. 3 mL，共6份，各加入對(duì)照品溶液0. 6 mL，按照“2. 1. 5”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法操作，測(cè)定吸光度值，并計(jì)算其回收率，結(jié)果見表1。

2. 1. 6. 5 樣品含量測(cè)定 取樣品1 g，按“2. 1. 3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法方法操作，得濾液，精密吸取一定量的提取液，按照“2. 1. 5”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法操作，測(cè)定吸光度值，并計(jì)算樣品中游離氨基酸的含量，結(jié)果見表3。

2. 2 蛋白質(zhì)的含量測(cè)定

2. 2. 1 測(cè)定波長的選擇 取樣品溶液和對(duì)照品溶液適量，在紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行400～800 nm波長掃描，二者均在595 nm附近有最大吸收，因此選擇595 nm為測(cè)定波長［13-14］。

2. 2. 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取牛血清白蛋白（BSA）對(duì)照品10 mg置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0. 1 mg／mL的BSA對(duì)照品溶液。

2. 2. 3 供試品溶液的制備 精密稱取藥渣粗粉1 g，加25 mL蒸餾水超聲30 min，離心，過濾，濾液備用。

2. 2. 4 顯色劑的配制 CBB G-250染料試劑：稱50 mg CBB G-250，溶于25 mL 95%的乙醇后，再加入50 mL 85%的磷酸，用水稀釋至500 mL［15］。

2. 2. 5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取上述溶液0. 0、0. 8、1. 0、1. 2、1. 4、1. 6、1. 8、2 mL分別置于10 mL具塞試管中，各加入CBB G-250染料5 mL，用蒸餾水補(bǔ)足至10 mL，輕微振搖，混勻，在595 nm處用分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值。橫坐標(biāo)為BSA對(duì)照品溶液的含量（mg），縱坐標(biāo)為吸光度值A(chǔ)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得回歸方程：A＝3. 410 1C＋0. 097 5（R2＝0. 999 5），在所測(cè)量的游離氨基酸濃度范圍內(nèi)濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2. 2. 6 方法學(xué)考察

2. 2. 6. 1 精密度 精密量取BSA對(duì)照品溶液6份，各1. 2 mL于10 mL具塞試管中，按“2. 2. 5”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定其在595 nm處吸光度值，RSD為0. 97%（n＝6）。

2. 2. 6. 2 重復(fù)性 取3號(hào)樣品1 g，按“2. 2. 3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法操作，得濾液，精密量取0. 8 mL提取液，按照“2. 2. 5”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定蛋白質(zhì)在樣品中吸光度值，并計(jì)算，1. 63%（n＝6）。

2. 2. 6. 3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密量取BSA對(duì)照品溶液1. 4 mL，按照“2. 2. 5”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法操作，每隔5 min測(cè)定吸光度值，RSD為2. 02%（n＝6）。試驗(yàn)表明在15 min內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2. 2. 6. 4 加樣回收率試驗(yàn) 利用加標(biāo)回收法，分別吸取已知蛋白質(zhì)含量的藥渣提取液0. 3 mL，共6份，各加入對(duì)照品溶液0. 8 mL，按照“2. 2. 5”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法操作，測(cè)定吸光度值，并計(jì)算其回收率，結(jié)果見表2。

2. 2. 6. 5 樣品含量測(cè)定 取樣品1 g，按“2. 2. 3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法方法操作，得濾液，精密吸取一定量的提取液，按照“2. 2. 5”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法操作，測(cè)定吸光度值，并計(jì)算樣品中總蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果見表3。

表1　藥渣中總游離氨基酸回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2　藥渣中總蛋白質(zhì)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表3　游離氨基酸及蛋白質(zhì)含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

3　小結(jié)

3. 1 用茚三酮顯色法測(cè)定藥渣中游離氨基酸的含量的原理 弱酸性溶液中茚三酮與氨基酸共熱，可引起氨基酸的脫氨、脫羧反應(yīng)，最終與還原性茚三酮發(fā)生作用，生成紫色物質(zhì)，顏色深淺與氨基酸含量成正比。該方法簡便、快捷、靈敏度高、檢測(cè)成本低，可用于大樣本的檢測(cè)。

3. 2 用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的基本原理考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)直接結(jié)合，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，因此，測(cè)定結(jié)果不受樣品中非蛋白氮的影響，結(jié)果更準(zhǔn)確［15］。用考馬斯亮藍(lán)G-250，作為蛋白質(zhì)的顯色劑，靈敏度高、簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)。與古老的經(jīng)典的測(cè)定蛋白質(zhì)的方法相比，考馬斯亮藍(lán)法，不需要消化且用時(shí)用時(shí)較短，加入顯色劑后立刻就能測(cè)定，可用于蛋白質(zhì)的檢識(shí)，靈敏度高，且迅速而簡便。

4　討論

在檢測(cè)氨基酸過程中，混勻時(shí)輕微的震蕩，使混合均勻，劇烈震蕩會(huì)產(chǎn)生氣泡，不易定容；水浴溫度每次做要保持一致，溫度對(duì)顯色影響較大。在測(cè)定蛋白質(zhì)過程中，加入CBB G-250后，立即輕微震蕩混勻，再定容，若劇烈震蕩會(huì)產(chǎn)生大量的氣泡，干擾定容。測(cè)定時(shí)要迅速，該顯色反應(yīng)隨時(shí)間增長，吸光度值在逐漸降低。

參考文獻(xiàn)

［1］蔡景義，周安國.中草藥渣在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（1）：56-57.

［2］曹德賓，王廣來，李艷秋，等.中藥廢渣栽培平菇試驗(yàn)初報(bào)［J］.中國食菌，2008，27（4）：17-18.

［3］王小晶，鄧宇，方德華.急支糖漿藥渣栽培野生平菇的效應(yīng)研究［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2008，16（3）：36-38.

［4］潘華峰，鄧喬丹，馮毅種，等.中藥渣綜合利用的可行性分析［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（8）：2026-2027.

［5］陸景偉，王遠(yuǎn)會(huì)，張遠(yuǎn)陵，等.中藥渣在農(nóng)業(yè)上的綜合利用研究進(jìn)展［J］.南方農(nóng)業(yè)，2013，7（12）：64-67.

［6］吳焱鑫，冀彥錫，任昂，等.中藥渣栽培食（藥）用真菌研究的概述［J］.中國食用菌，2011，30（4）：3-6.

［7］譚永忠，陳今朝，韓宗先，等.中藥渣栽培平菇試驗(yàn)［J］.北方園藝，2012（9）：168-170.

［8］王茂，郭鑫，韓峰，等.中藥渣有氧發(fā)酵有機(jī)肥中試及田間肥效試驗(yàn)研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（18）：217-218.

［9］唐懋華，成維東.中藥渣基質(zhì)對(duì)蔬菜育苗及產(chǎn)量的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（4）：81-82.

［10］胡京枝，董小海，余大杰，等.紫外分光光度法測(cè)定含乳飲料中游離氨基酸含量［J］.中國食品添加劑，2007（6）：164-166，64.

［11］張永芳，張琪，王潤梅，等.茚三酮呈色法測(cè)定谷子種子中的游離氨基酸含量［J］.種子，2014，33（1）：111-113，126.

［12］梁英麗，李艷，高孟婷，等.西歸中總氨基酸含量測(cè)定方法研究［J］.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，8（10）：7-9.

［13］李娟，張耀庭，曾偉，等.應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白含量［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2000，13（2）：118-120.

［14］王孝平，邢樹禮.考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量的研究［J］.天津化工，2009，23（3）：40-42.

［15］王艾平，周麗明.考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定茶籽多糖中蛋白質(zhì)含量條件的優(yōu)化［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（3）：150-153.

（2015－06－17收稿 責(zé)任編輯：王明）

中圖分類號(hào)：R284. 1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 039

通信作者：田樹革（1968. 05—），男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥化學(xué)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，E-mail：tsgyz＠sina. com

作者簡介：張鳳雪（1990. 01—），女，2014級(jí)在讀碩士研究生，中藥化學(xué)與中藥分析學(xué)，E-mail：1165025478＠qq. com

基金項(xiàng)目：新疆醫(yī)科大學(xué)中藥化學(xué)教學(xué)團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)資助（編號(hào)：JXTD2013-3）