高效液相色譜法對(duì)生脈膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測(cè)定

孫彩華　　付　迎　　蔣毅超.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，浙江杭州　30004；.正大青春寶藥業(yè)有限公司，浙江杭州　3003

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高效液相色譜法對(duì)生脈膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測(cè)定

孫彩華1付迎2蔣毅超2
1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，浙江杭州310004；2.正大青春寶藥業(yè)有限公司，浙江杭州310023

[摘要]目的探究和分析高效液相色譜（HPLC）法對(duì)生脈膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測(cè)定。方法應(yīng)用HPLC法，優(yōu)化色譜條件，色譜柱采用Agilent 1100 C18（5μm，4.6 mm×250mm），流動(dòng)相選擇乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78），檢測(cè)波長(zhǎng)是203 nm，色譜柱溫度為30℃，流速1mL/min，計(jì)算回收率采用的是外標(biāo)法，按峰面積計(jì)算。結(jié)果人參皂苷Rg1在0.0412～0.412μg范圍內(nèi)與其峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（r=0.999 96），其平均回收率達(dá)97.88%（RSD=1.06%）；人參皂苷Re在0.1618～1.618μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（r=0.999 98），平均回收率達(dá)98.21%（RSD=1.16%）。結(jié)論HPLC法操作簡(jiǎn)單、快速，所得結(jié)果準(zhǔn)確，適用于生脈膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜；生脈膠囊；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；含量測(cè)定

生脈膠囊主要由人參、麥冬、五味子經(jīng)科學(xué)方法精制而成，具有益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津的功效，臨床上主要應(yīng)用于休克、冠心病、心力衰竭等疾病的治療[1-3]。方中人參為君藥，能夠大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、生津益肺、安神益智，是生脈膠囊發(fā)揮療效的重要組成部分。人參的主要活性成分有20多種[4]，包括人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rd等[5-6]，這些人參皂苷的含量與人參的療效密切相關(guān)?！吨袊?guó)藥典》（2010版）明確提出將人參皂苷Rg1與Re作為測(cè)定制劑中含有人參分量多少的指標(biāo)，測(cè)定藥材中人參皂苷Rg1和Re含量成為評(píng)估藥品優(yōu)劣及判定給藥劑量的重要環(huán)節(jié)[7]。人參皂苷Rg1和Re含量的測(cè)定方法很多，包括薄層層析法、分光光度法、比色法等，近年來(lái)高效液相色譜（HPLC）法以其速度快、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而被用于人參皂苷Rg1和Re含量的測(cè)定，取得了較為滿意的效果[8]。本研究通過(guò)HPLC法測(cè)定人參皂苷Rg1 和Re的含量，為生脈膠囊的質(zhì)量控制提供有效方法，具體報(bào)道如下：

1　儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1100系列高效液相色譜議（濟(jì)南上地電子科技有限公司）包括：四元泵、真空脫氣泵、柱溫箱、VWD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent化學(xué)工作站；Bolong USC-502超聲清洗機(jī)（濟(jì)寧萬(wàn)和超聲電子設(shè)備有限公司）；BS224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；LD5000/6S多效蒸餾水機(jī)（吉林省華通制藥設(shè)備有限公司）。

1.2藥物與試劑

生脈膠囊（正大青春寶藥業(yè)有限公司；規(guī)格：0.3g/粒；批號(hào)：20140702、20140710、20140716）；人參皂苷Rg1對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所；批號(hào)：110703-201027，含量測(cè)定用）；人參皂苷Re對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所；批號(hào)：110754-201123，含量測(cè)定用）；甲醇、乙腈為色譜純（德國(guó)Merck公司），水為注射用水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent1100C18（5μm，4.6mm×250mm，），柱溫為30℃，將人參皂苷Rg1及Re的檢測(cè)靈敏度作為考慮因素，綜合判斷并選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，流速為1mL/min，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸（22∶78）。理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。對(duì)照品、供試品與陰性樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備分別對(duì)10 g的人參皂苷Rg1對(duì)照品、10 g人參皂苷Re對(duì)照品進(jìn)行精密的測(cè)量，后將其放置于10 mL容量瓶中，向其中加入甲醇使上述Rg1及Re對(duì)照品得到充分的溶解與搖勻。同樣，給予精密測(cè)量1.0mL的對(duì)照品溶液置入5mL容量瓶中，向其中加入甲醇至刻度并搖勻，作為對(duì)照品溶液存放在4℃的冰箱中。

2.2.2供試品溶液的制備取30粒生脈膠囊進(jìn)行研細(xì)并混勻，取其中3.0 g左右給予精密稱定，將其放置于具塞錐形瓶中，向其中加入25mL的70%乙醇溶液后給予密塞，常規(guī)進(jìn)行0.5 h的超聲處理，將超聲功率及頻率分別設(shè)置在250W、50 kHz，濾過(guò)處理（必要時(shí)先離心再濾過(guò)）。采用20mL的70%乙醇溶液對(duì)容器及濾器進(jìn)行清洗，蒸干后向殘?jiān)屑铀?0mL幫助其溶解，采用水飽和的正丁醇振搖提取5次，第1次劑量為20mL，第2次劑量為20mL，第3次劑量為20mL，第4次劑量為15 mL，第5次劑量為15 mL，合并正丁醇提取液，放置在水浴上蒸干，向殘?jiān)屑尤脒m當(dāng)?shù)募状歼m量促進(jìn)溶解，后將其轉(zhuǎn)移至10mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度后搖勻。對(duì)該溶液使用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，將其作為供試品溶液存放在4℃的冰箱中保存。

2.2.3陰性樣品溶液的制備按生脈膠囊處方組成取除去人參藥材外的藥材和輔料，按生脈膠囊的制備工藝和供試品溶液的制備制成陰性對(duì)照溶液。2.3線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液（人參皂苷Rg1和Re），吸取的劑量分別為1、5、10、15、20、25、30μL注入到液相色譜儀中。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析并對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定。分別以峰面積、對(duì)照品溶液含量作為縱坐標(biāo)及橫坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線后給予回歸計(jì)算。計(jì)算所得回歸方程，人參皂苷Rg1：Y= 4615.25 X-126.31（r=0.999 96），結(jié)果提示，人參皂苷Rg1在0.0412～0.412μg之間具有良好的線性關(guān)系。結(jié)果得人參皂苷Re的回歸方程Y=3906.13 X-225.62 （r=0.999 98），提示人參皂苷Re在0.1618～1.618μg之間具有良好的線性關(guān)系。

圖1　對(duì)照品、供試品與陰性樣品的色譜

2.4方法學(xué)考查

2.4.1精密度試驗(yàn)取批號(hào)為20140710生脈膠囊的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件注入高效液相色譜儀連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，依法測(cè)定。計(jì)算人參皂苷Rg1峰面積的RSD 為1.20%；人參皂苷Re峰面積的RSD為1.03%，表明精密度良好。

2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn)取該生脈膠囊的同一批供試品（批號(hào)：20140710），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算人參皂苷Rg1峰面積的RSD為1.65%；人參皂苷Re峰面積的RSD為1.74%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)選取同一批供試品該生脈膠囊（批號(hào)：20140710），一共6份，完全按照按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并在相同的色譜條件下測(cè)定，后準(zhǔn)確計(jì)算人參皂苷Rg1及Re的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果提示，在樣品中人參皂苷Rg1平均含量為0.6859mg/mL，RSD 為1.10%；人參皂苷Re平均含量為0.2605mg/mL，RSD 為1.23%（n=6）。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.4加樣回收率試驗(yàn)取該生脈膠囊的同一批供試品（批號(hào)：20140710）適量，研細(xì)，精密稱取粉末6份，每份約1.50 g，精密稱定，分別精密加入人參皂苷Rg1對(duì)照品和人參皂苷Re對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得加樣回收試驗(yàn)的供試品溶液，每次進(jìn)樣10μL，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，取平均值，人參皂苷Rg1的平均加樣回收率為97.88%，人參皂苷Re的平均加樣回收率為98.21%。見(jiàn)表1。

表1　人參皂苷R g 1和R e加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5樣品的測(cè)定

分別選取該生脈膠囊的3批樣品（批號(hào)分別為20140702、20140710、20140716），按照上述方法給予精密稱定，同時(shí)按照上述“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液，按外標(biāo)法計(jì)量樣品中人參皂苷Rg1和Re的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　生脈膠囊中人參皂苷R g 1和R e含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3　討論

3.1色譜柱的選擇

有資料證實(shí)，HPLC法的色譜柱越長(zhǎng)，所需要的流速就越大，使用的流動(dòng)相的量就越多，這樣色譜柱就越高，因此，選擇短的色譜柱較為合理[9]。而筆者分析以15 cm和25 cm長(zhǎng)度的色譜柱進(jìn)行分離，結(jié)果兩種長(zhǎng)度的色譜柱均能分離樣品中人參皂苷Rg1和Re，且都達(dá)到了1.5倍以上的分離度[10]。鑒于兩種長(zhǎng)度色譜柱都達(dá)到了想要的分離效果，筆者認(rèn)為長(zhǎng)度為15 cm的色譜柱更為合適。

3.2提取方法的選擇

筆者先查閱了文獻(xiàn)及藥典，并先后嘗試采用萃取法、大孔吸附樹(shù)脂柱、中性氧化鋁柱或大孔吸附樹(shù)脂柱與中性氧化鋁柱共同參與等各種要求下的層析法提取生脈膠囊中的人參皂苷Rg1和Re，相比之下，對(duì)人參皂苷Rg1和Re的選擇性較高且干擾性小的方法是萃取法，且萃取法專屬性好，研究員認(rèn)為萃取法制備供試品所達(dá)到的效果更為滿意。

3.3流對(duì)相的選擇

為了達(dá)到人參皂苷Rg1和Re檢測(cè)要求，需要減少液相色譜儀檢測(cè)的干擾雜質(zhì)，所以脫脂所用溶液的選擇同樣重要，筆者對(duì)比了應(yīng)用三氯甲烷、乙醚以及三氯甲烷和乙醚按照9∶1、3∶1、2∶1、1∶1比例組合后的溶液進(jìn)行提取脫脂，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三氯甲烷與乙醚按照3∶1比例混合的溶液進(jìn)行提取脫脂后在液相色譜儀檢測(cè)到的干擾成分是這些成分中最少的，用此比例脫脂非常合適[11-12]。

3.4流動(dòng)相及柱溫的選擇

筆者曾選用《中國(guó)藥典》2010年版（一部）人參含量測(cè)定項(xiàng)下所用乙腈-水的洗脫方法，但譜峰拖尾較嚴(yán)重，分離效果不理想。后采用文獻(xiàn)報(bào)道的乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸（22∶78）作為流動(dòng)相，對(duì)樣品的分離較好[13]。進(jìn)一步摸索發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中乙腈濃度變化對(duì)人參皂苷Rg1和Re分離度的影響不容忽視，如果乙腈的濃度在19%（0～35 min）能使人參皂苷Rg1和Re的分離度達(dá)到1.5倍以上，但是存在干擾峰，若將乙腈設(shè)定為19%～28%（35～50 min）時(shí)，避免干擾峰的影響，人參皂苷Rg1和Re的分離度也相應(yīng)提高[14-15]。筆者在此基礎(chǔ)上，對(duì)柱溫進(jìn)行考察，分別將柱溫設(shè)置在20、25、30℃，進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)柱溫為30℃時(shí)液相色譜儀的分離度明顯比20℃和25℃時(shí)所得的結(jié)果要好，所以30℃為較合適的色譜柱溫度。

本研究選擇生脈膠囊為供試品的原材料，生脈膠囊中所含人參對(duì)于其藥效的發(fā)揮起著重要作用，人參發(fā)揮藥理作用主要是因?yàn)楹谢钚猿煞帧藚⒃碥誟16]。人參皂苷是固醇類化合物，關(guān)于人參皂苷的提取分離方法是近年來(lái)相對(duì)研究較多的一個(gè)領(lǐng)域[17]。HPLC法作為新型的檢測(cè)物質(zhì)成分的方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用和開(kāi)展，HPLC法的靈敏度高、測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確，并且具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)[18-19]。本研究通過(guò)多次試驗(yàn)優(yōu)化了HPLC法的條件，在色譜柱、流動(dòng)相、柱溫、提取方法等工藝發(fā)面進(jìn)行多次的嘗試并選擇最優(yōu)的條件，對(duì)人參皂苷Rg1和Re含量的測(cè)定取得了良好的效果，總結(jié)研究所得的成果，HPLC法以其多個(gè)優(yōu)勢(shì)而用于測(cè)定人參皂苷Rg1和Re的含量，供生產(chǎn)工藝改造和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂作出參考。

對(duì)本研究中存在的不足進(jìn)行分析，HPLC法在人參皂苷Rg1和Re的測(cè)量中已經(jīng)達(dá)到了很高的分離標(biāo)準(zhǔn)，提高了檢測(cè)的精確性，但是，HPLC法操作過(guò)程所用儀器的成本較高，昂貴的價(jià)格限制了它在一些地區(qū)的應(yīng)用，其在各地普及還需要一定的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)條件。近年來(lái)以HPLC法為基礎(chǔ)，已經(jīng)出現(xiàn)液-質(zhì)聯(lián)用高效液相色譜（HPLC-MS/MS）法、超高效液相色譜（UPLC）法等新技術(shù)，這些新方法同樣用于有效成分的測(cè)量，液-質(zhì)聯(lián)用高效液相色譜（HPLC-MS/MS）法能夠同時(shí)測(cè)量人工皂苷Rg1和Re的檢測(cè)，超高效液相色譜法則比高效液相色譜法的檢測(cè)靈敏度更高、檢測(cè)速度更快、操作也更為簡(jiǎn)單，不失為人參皂苷Rg1 和Re的更好辦法，超高效液相色譜法值得我們做進(jìn)一步的探討[20-23]。本研究只針對(duì)人參中人參皂苷Rg1 和Re兩種活性成分進(jìn)行測(cè)定，而其主要活性成分有20多種，有關(guān)人參中其他類型人工皂苷含量的檢測(cè)方法也有文獻(xiàn)記載，但是有些種類的檢測(cè)技術(shù)還在研究探索階段，后續(xù)可以對(duì)人參中其他活性成分的檢測(cè)做進(jìn)一步的研究。

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Determ ination of Ginsenoside Rg1 and Ginsenoside Re in Shengmai Capsules by HPLC

SUN Caihua1FU Ying2JIANG Yichao2
1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Zhejiang Province, Hangzhou310004,China;2.Chiatai Qingchunbao Pharmaceutical Co.Ltd.,Zhejiang Province,Hangzhou310023, China

[Abstract]Objective To develop a HPLCmethod for determination of ginsenosides Rg1&Re from Shengmai Capsule. M ethods The separation was performed on Agilent 1100 C18(5μm,4.6 mm×250 mm)column eluted with themobile phase consisting of acetonitrile and-0.1%phosphoric acid solution(22∶78)at the flow rate of 1mL/min.The detection wavelength was 203 nm and the column temperature was 30℃,extemal standard method was used tomeasure recovery according to the peak area calculution.Results Ginsenoside Rg1 had a good linear relationship with the peak area within 0.0412-0.412μg(r=0.999 96),the average recovery was 97.88%(RSD=1.06%);Ginsenoside Re had a good linear relation with the peak area within 0.1618-1.618μg(r=0.999 98),the average recovery was 98.21%(RSD= 1.16%).Conclusion The HPLCmethod is simple,rapid and accurate,which is suitable for the determination of Ginsenoside Rg1&Re from Shengmai Capsule.

[Key words]High performance liquid chromatography;Shengmai Capsules;Ginsenosides Rg1;Ginsenoside Re;Determination

收稿日期：（2015-09-18本文編輯：趙魯楓）

[作者簡(jiǎn)介]孫彩華（1974-），男，浙江中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)中藥學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生，副主任中藥師；主攻方向：藥物鑒定與臨床藥學(xué)。

[基金項(xiàng)目]浙江省中醫(yī)藥科技立項(xiàng)課題（2015ZB045）。

[中圖分類號(hào)]R927.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-7210（2016）01（a）-0009-04