抑制性差減雜交技術(shù)（SSH）及其應(yīng)用研究進(jìn)展

梅冰，陸翔，竇法楷，汪慧蓮，李顯秋，王永喬

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)節(jié)能減排檢測(cè)工程中心，云南昆明650000）

抑制性差減雜交技術(shù)（SSH）及其應(yīng)用研究進(jìn)展

梅冰，陸翔，竇法楷，汪慧蓮，李顯秋，王永喬

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)節(jié)能減排檢測(cè)工程中心，云南昆明650000）

抑制性差減雜交技術(shù)是一種差異性基因克隆的新技術(shù)，它對(duì)研究細(xì)胞生殖、發(fā)育、分化、衰老及死亡等生命過(guò)程中有關(guān)基因的差異表達(dá)及相關(guān)基因的分子克隆提供了有力的技術(shù)工具。簡(jiǎn)要概述了抑制性差減雜交技術(shù)的基本原理、優(yōu)越性、缺陷及其在相關(guān)基因克隆方面的應(yīng)用研究進(jìn)展。

基因克隆；抑制性差減雜交；應(yīng)用

生物體的生命過(guò)程伴有異常復(fù)雜的生物生化變化，是生物體內(nèi)相關(guān)基因的有序表達(dá)和調(diào)控的結(jié)果。對(duì)相關(guān)差異性表達(dá)基因進(jìn)行深入研究，能夠更加深入地了解生物體的生命活動(dòng)規(guī)律。目前，分離差異性表達(dá)基因的主要技術(shù)為雜交技術(shù)（subtrac tive hybridization）和差示篩選技術(shù)（differential screening），但這些技術(shù)存在重復(fù)性差、敏感度低等缺點(diǎn)。隨著現(xiàn)代PCR技術(shù)的發(fā)展，一系列基于PCR技術(shù)的分離差異性基因表達(dá)的新技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)。SSH技術(shù)就是一種利用抑制性PCR和以差減雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的一種簡(jiǎn)單、快速地分離差異性表達(dá)基因的方法，該技術(shù)在研究基因克隆、基因表達(dá)及基因功能等方面有明顯的優(yōu)勢(shì)[1]。筆者對(duì)使用SSH技術(shù)進(jìn)行研究的應(yīng)用現(xiàn)狀及其未來(lái)前景進(jìn)行了簡(jiǎn)單介紹，旨在使SSH技術(shù)的應(yīng)用得到更加深入的認(rèn)識(shí)。

1 SSH技術(shù)的過(guò)程及其優(yōu)缺點(diǎn)

1.1 SSH技術(shù)的過(guò)程

SSH研究應(yīng)用的材料可以是基因組DNA，也可以是cDNA，用于分離克隆2個(gè)樣品中特異基因或者是差異性表達(dá)的基因。基本過(guò)程是：抽提2種不同生物體的DNA或cDNA；將經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化后的Tester DNA分為2個(gè)部分，分別與2種接頭連接；再將這2個(gè)部分序列于過(guò)量酶切的Driver DNA雜交，當(dāng)這2個(gè)部分DNA被最終混合雜交后，就允許了同源性的單鏈DNA分子雜交；通過(guò)PCR擴(kuò)增、克隆即可分析所差減的序列。

1.2 SSH技術(shù)具有的優(yōu)點(diǎn)[2]

高效高速。在一次SSH雜交試驗(yàn)過(guò)程中，就可以同時(shí)分離出上百個(gè)差異性表達(dá)的基因。靈敏度高。在退火時(shí)，高豐度的單鏈DNA同源雜交的速度快于低豐度的單鏈DNA，導(dǎo)致原來(lái)在豐度上有差別的單鏈DNA在相對(duì)含量上能夠達(dá)到一致，從而對(duì)于低豐度的基因也可以通過(guò)基因克隆表達(dá)出來(lái)。假陽(yáng)性率低。經(jīng)過(guò)2次雜交和2次PCR擴(kuò)增選擇性地?cái)U(kuò)增差異表達(dá)目的DNA片段，提高了特異基因的篩出率，使得假陽(yáng)性率大大降低。簡(jiǎn)單易行，對(duì)儀器設(shè)備要求不高。背景低、重復(fù)性高。

1.3 SSH技術(shù)存在的不足[2]

基因組中酶切位點(diǎn)較少的不適用SSH技術(shù)；分離到的差異表達(dá)基因片段，還需要擴(kuò)增全長(zhǎng)；起始材料相對(duì)要求較多，不適于來(lái)源困難的樣品；對(duì)試驗(yàn)材料的要求較高，試驗(yàn)材料間差異性要求較低。

2 SSH技術(shù)的應(yīng)用

2.1 SSH技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

孫守娟等[3]采用SSH技術(shù)，構(gòu)建了舌鱗癌Tca 8113細(xì)胞系中高、低醛脫氫酶活性細(xì)胞差異表達(dá)基因cDNA文庫(kù)，用Trizol分別提取2個(gè)細(xì)胞的總RNA；用SSH技術(shù)對(duì)2組RNA進(jìn)行差異基因篩選和擴(kuò)增，克隆片段均勻分布在250～750 bp，無(wú)假陽(yáng)性克隆。測(cè)序結(jié)果經(jīng)同源性比對(duì)分析可知，與腫瘤有關(guān)的基因有SLC25，A13 NPC1，KLHL2，BARD1，WAPL，Notch2，EEF2K。車(chē)紅花等[4]通過(guò)SSH技術(shù)，克隆了受病毒攻擊的宿主細(xì)胞中被中藥有效成分調(diào)控的基因，結(jié)果顯示，核糖體蛋白L27a在中藥組中高表達(dá)，病毒組中表達(dá)減弱或被抑制；益氣活血中藥復(fù)方能夠影響受CVB3攻擊的宿主細(xì)胞核糖體蛋白L27a的表達(dá)，有效保護(hù)心肌、阻斷病程進(jìn)度，實(shí)現(xiàn)治療病毒性心肌炎的目的。

李守明等[5]采用抑制性差減雜交技術(shù)，鑒定母鼠鉛暴露后代海馬差異表達(dá)基因，構(gòu)建了一個(gè)近200個(gè)克隆的差減基因文庫(kù)，得到93個(gè)有效克隆，從中克隆和鑒定了母鼠鉛暴露致使學(xué)習(xí)和記憶能力顯著下降的幼鼠中海馬差異表達(dá)的基因，共43種不同的基因以及4種未知功能基因。這些基因包括一些看家基因和一些與細(xì)胞蛋白折疊、信號(hào)傳導(dǎo)、應(yīng)激響應(yīng)及DNA甲基化相關(guān)功能的基因。

2.2 SSH技術(shù)在植物學(xué)上的應(yīng)用

劉蕾等[6]應(yīng)用SSH篩選植物青枯菌致病相關(guān)基因，研究該菌株致病力分化機(jī)理，以Po82為待測(cè)菌株，構(gòu)建了抑制性差減雜交文庫(kù)，結(jié)果表明，具有較高的接頭連接以及文庫(kù)構(gòu)建效率，插入片段平均長(zhǎng)度為300 bp，文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量較好。對(duì)文庫(kù)中隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，共篩選出44個(gè)Po82菌株差異基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，所得差異基因主要涉及新陳代謝、膜結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)坐酶、毒力、分泌蛋白、轉(zhuǎn)錄因子以及未知功能等。閔卓等[7]以赤霞珠葡萄新梢上冬芽和夏芽為材料（夏芽作為驅(qū)動(dòng)方，冬芽作為試驗(yàn)方），采用SSH技術(shù)構(gòu)建冬芽和夏芽的cDNA文庫(kù)，篩選冬芽和夏芽差異表達(dá)的基因片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一些在冬芽中表達(dá)頻率較高的基因，如編碼MADS FLC-like蛋白、鈣依賴(lài)蛋白激酶、NADP依賴(lài)型的蘋(píng)果酸酶、細(xì)胞壁水解酶、細(xì)胞壁松弛蛋白、外被體蛋白β亞基、熱激蛋白、衰老相關(guān)蛋白、細(xì)胞色素P450、細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)蛋白等基因；同時(shí)還認(rèn)為，線粒體蛋白基因、開(kāi)花相關(guān)基因、未知蛋白基因、ATP合成酶β亞基基因、MADs FLC-like蛋白基因等與葡萄芽生理休眠具有相關(guān)性。葉曉明等[8]以溫敏雄性不育系K121S在可育溫度10℃下和不育溫度26℃下三核期花蕾為材料，以可育溫度下的cDNA為驅(qū)動(dòng)子，采用SSH技術(shù)構(gòu)建了不育溫度下SSH文庫(kù)，隨機(jī)挑選97個(gè)陽(yáng)性菌落測(cè)序，得到20個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽（EST），包括與ATP合成酶β亞基、Rubp羧化酶小亞基同源的EST等，為進(jìn)一步獲得育性轉(zhuǎn)換相關(guān)基因和揭示K121S的育性轉(zhuǎn)換分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

2.3 SSH技術(shù)在微生物學(xué)上的應(yīng)用

李淼等[9]采用SSH技術(shù)尋找副豬嗜血桿菌的毒力基因，以無(wú)毒力菌株H465和有毒力菌株SW124為材料，構(gòu)建了SSH文庫(kù)，使用Southern雜交和PCR鑒定對(duì)差異基因片段進(jìn)行篩選結(jié)果顯示，從構(gòu)建的文庫(kù)中得到7個(gè)特異性差異基因片段，其中，2個(gè)差異基因片段與功能未知蛋白基因有關(guān)，5個(gè)片段分別與膜多糖磷酸酶/糖基轉(zhuǎn)移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、莢核糖體蛋白丙氨酸、轉(zhuǎn)移酶噬菌體重組蛋白和ABC型硝酸鹽，碳酸氫鹽/磺酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)周質(zhì)蛋白等編碼的基因有同源性。

祝昊丹[10]采用SSH技術(shù)將無(wú)毒株SH040917SS9與強(qiáng)毒株SH040917進(jìn)行雜交，共獲得61個(gè)毒力特異的基因片段，結(jié)果表明，這些片段與30種不同的蛋白編碼基因具有同源性，包括類(lèi)枯草桿菌絲氨酸蛋白酶、DNA核酸酶、溶血素相關(guān)蛋白酶、蘇氨酸磷酸化蛋白酶等。

戴建君[11]采用SSH技術(shù)對(duì)禽致病性大腸桿菌菌株和人尿源性大腸桿菌差異性表達(dá)基因序列進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了28個(gè)新毒力基因片段，并對(duì)這些基因片段流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)大部分新的毒力基因與流行病學(xué)有較大的相關(guān)性。

2.4 SSH技術(shù)在動(dòng)物學(xué)上的應(yīng)用

曲憲成等[12]應(yīng)用SSH技術(shù)構(gòu)建了黃鱔IV期卵巢和間期性腺的差減cDNA文庫(kù)，正向差減雜交以間期性腺為試驗(yàn)方，IV期卵巢為驅(qū)動(dòng)方；反向差減雜交以IV期卵巢為試驗(yàn)方，間期性腺為驅(qū)動(dòng)方，將獲得的差減cDNA片段連接質(zhì)粒載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，最后獲得的正、反向差減文庫(kù)分別含461，678個(gè)重組子。經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定，插入片段范圍為200～2 000 bp。隨機(jī)選取正、反文庫(kù)共100個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序分析，得到90個(gè)有效基因片段，與GenBank進(jìn)行BLASTx和BLASTn同源比對(duì)，進(jìn)一步從文庫(kù)中選取2個(gè)基因用于半定量RT-PCR，對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，所建文庫(kù)能夠達(dá)到富集IV期性腺差異表達(dá)基因的目的。黃鱔性腺差減文庫(kù)的構(gòu)建，為進(jìn)一步分離、鑒定黃鱔性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)的相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。

李超等[13]利用SSH技術(shù)，以鏈球菌疫苗免疫前后羅非魚(yú)白細(xì)胞cDNA為材料，構(gòu)建了羅非魚(yú)免疫前后正、負(fù)2個(gè)cDNA差減文庫(kù)，并采用地高辛（DIG）標(biāo)記差減文庫(kù)cDNA作為探針，進(jìn)行差異表達(dá)片段的篩選鑒定，結(jié)果顯示，2個(gè)文庫(kù)重組率均在90%以上，插入片段在300～900 bp，接頭連接效率超過(guò)50%，差減效率非常高，陽(yáng)性率均超過(guò)70%。雜交篩選后，對(duì)正、負(fù)文庫(kù)各挑選30個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序組裝聚類(lèi)，正、負(fù)文庫(kù)分別獲得16，18條EST，所得序列經(jīng)GenBank同源性分析，正、負(fù)文庫(kù)分別有10，11條EST獲得功能注釋?zhuān)曳謩e有6，7條unigene沒(méi)有同源性匹配，定為未知新基因。

劉晶等[14]采用SSH技術(shù)，研究營(yíng)養(yǎng)素對(duì)皺紋盤(pán)鮑基因表達(dá)的影響，對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)中48個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了32個(gè)已知功能基因和16個(gè)新基因。王嘉等[15]采用SSH技術(shù)研究皺紋盤(pán)鮑Vc缺乏誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因，共獲得了63個(gè)基因片段，其中，已知功能基因有34個(gè)；在cDNA文庫(kù)中獲得39個(gè)片段，其中，已知功能基因有21個(gè)，包括細(xì)胞代謝、生物調(diào)節(jié)等相關(guān)基因。

另外，梅冰[16]利用SSH技術(shù)對(duì)溶藻弧菌的毒力相關(guān)基因進(jìn)行篩選和鑒定研究，構(gòu)建溶藻弧菌毒力菌株SSH文庫(kù)，結(jié)果顯示，所構(gòu)建的溶藻弧菌毒力菌株的SSH文庫(kù)含有8個(gè)已知的常見(jiàn)毒力相關(guān)功能基因，該文庫(kù)還含有166個(gè)未知新基因，占文庫(kù)中總基因數(shù)的68.44%，溶藻弧菌的毒力基因很可能存在于這些未知新基因中。說(shuō)明構(gòu)建的SSH文庫(kù)中166個(gè)未知新基因很有可能包含有溶藻弧菌的關(guān)鍵毒力基因，為溶藻弧菌毒力基因的鑒定和今后開(kāi)展溶藻弧菌基因工程疫苗的研制奠定了重要的基礎(chǔ)。

3 展望

在現(xiàn)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中，差異基因的篩選和鑒定已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。SSH技術(shù)操作簡(jiǎn)單、所需試驗(yàn)儀器廉價(jià)、試驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單、陽(yáng)性率高，分離差異基因提供了一種強(qiáng)有力的工具。隨著SSH技術(shù)的不斷改進(jìn)，在生物研究的各個(gè)領(lǐng)域，如微生物學(xué)、動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了大力的推廣。在未來(lái)的發(fā)展中，SSH將與其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，各取所長(zhǎng)，為研究差異基因的表達(dá)提供新的技術(shù)手段。

［1］顧克余，翟虎渠.抑制性扣除雜交技術(shù)（SSH技術(shù)）及其在基因克隆上的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，1999，15（2）：13-16.

［2］Diatchenko L，Lau Y F，Campbell A P.Suppression subtractive hybridization：a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].Proc Natl Sci USA，1996，93（12）：6025-6030.

［3］孫守娟，季平，鄧誠(chéng)，等.基于舌鱗癌Tca8113細(xì)胞醛脫氫酶活性不同構(gòu)建差異表達(dá)基因cDNA文庫(kù)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（3）：226-230.

［4］車(chē)紅花，張明雪，何偉，等.益氣活血中藥復(fù)方對(duì)CVB3大鼠心肌細(xì)胞感染模型核糖體蛋白L27a表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2012，39（9）：1862-1864.

［5］李守明，劉昌英，謝國(guó)秀，等.應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)鑒定母鼠鉛暴露后代海馬差異表達(dá)基因[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2010，12（10）：820-824.

［6］劉蕾，徐進(jìn)，許景升，等.應(yīng)用抑制性差減雜交法篩選植物青枯菌致病相關(guān)基因[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，20（7）：745-755.

［7］閔卓，耿萬(wàn)剛，房玉林，等.應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)篩選葡萄冬芽和夏芽生理休眠相關(guān)基因[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（5）：1029-1040.

［8］葉曉明，彭少丹，陳升位，等.不育溫度下油菜溫敏雄性不育系SSH文庫(kù)的構(gòu)建[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，29（1）：6-10.

［9］李淼，李春玲，宋帥，等.應(yīng)用抑制性差減雜交篩選副豬嗜血桿菌4型菌株可能毒力基因[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，27（1）：57-62.

［10］祝昊丹.豬鏈球菌9型毒力基因的篩選及鑒定[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［11］戴建君.禽致病性大腸桿菌IMT5155疑似毒力基因的鑒定及分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［12］曲憲成，尚曉莉，程翠，等.黃鱔性腺抑制差減文庫(kù)的構(gòu)建和分析[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2011，18（1）：23-28.

［13］李超，陳明，李莉萍，等.羅非魚(yú)免疫前后白細(xì)胞cDNA差減文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，23（4）：1286-1292.

［14］劉晶，張文兵，麥康森，等.皺紋盤(pán)鮑外套膜耐維生素E缺乏消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2007，14（3）：383-389.

［15］王嘉，馬洪明，麥康森，等.皺紋盤(pán)鮑肝胰腺和腎臟維生素C缺乏誘導(dǎo)的差異表達(dá)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2010，17（4）：619-629.

［16］梅冰.溶藻弧菌的分離鑒定及其毒力菌株SSH文庫(kù)的構(gòu)建[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2009.

Research Progress on Suppression Subtractive Hybridization（SSH）and Its Application

MEI Bing，LU Xiang，DOU Fa-kai，WANG Hui-lian，LI Xian-qiu，WANG Yong-qiao
（Engineering Center of Energy Saving and Emission Reduction Detection，College of Architecture and Engineering，Yunnan Agricultural University，Kunming650000，China）

Suppression subtractive hybridization is a new technique of differential gene cloning,which has provided powerful technical tools for the study of differential expression of the genes and the molecular cloning of related genes in the process of cell reproduction,development,differentiation,aging and death.This papper briefly outlines the basic principles,advantages and disadvantages of suppression subtractive hybridization and its application in the cloning of related genes.

gene cloning;suppression subtractive hybridization;application

S334

A

1002-2481（2016）02-0271-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.35

2015-09-16

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（A1103）

梅冰（1982-），男，湖北武漢人，講師，博士，主要從事生物質(zhì)能源研究工作。