谷子秸稈黃色素提取的響應(yīng)面分析

張春鳳，郝林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

谷子秸稈黃色素提取的響應(yīng)面分析

張春鳳，郝林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

以谷子秸稈為原料，研究微波-乙醇助提秸稈中黃色素的工藝條件。通過單因素試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（V/V）、微波功率、微波輻射時(shí)間、料液比及提取次數(shù)對谷子秸稈中黃色素提取的影響，并由因子篩選試驗(yàn)選出顯著影響因素；在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳工藝。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為：72%乙醇（V/V）為提取劑，料液比為1∶20（g/mL），320 W微波處理30 s，提取3次，得到色素提取液平均吸光度為0.634，與軟件預(yù)測值0.641基本一致（相對誤差1.09%）。

谷子秸稈；微波-乙醇助提；黃色素；響應(yīng)面

近年來，食品中合成色素的安全性已引起越來越多的關(guān)注。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1-4]，合成色素在不同程度上存在慢性毒副作用和致癌性，其應(yīng)用受到限制和禁止；而天然色素主要來自于動(dòng)、植物組織，安全性和營養(yǎng)價(jià)值高，具有一定的生物活性和抑菌、抗菌作用，且其色調(diào)與食品天然色調(diào)接近。這些優(yōu)勢決定了天然色素必將取代合成色素，成為消費(fèi)的主流。黃色素是一類重要的天然色素，占色素總需求量的60%，具有廣闊的應(yīng)用前景[5]。目前，常用的黃色素種類不多，且價(jià)格昂貴。因此，尋求和挖掘天然色素新資源，對保障人民身體健康和促進(jìn)食品工業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

谷子是我國種植面積較大的雜糧作物之一[6]。山西省素有“小雜糧王國”之稱，每年都會(huì)生產(chǎn)得到大量的谷子秸稈。隨著人民生活水平的提高，秸稈已不再適合作為家庭能源使用；而且秸稈回收利用成本高，運(yùn)輸不便，效益不明顯。因此，就地焚燒成為農(nóng)戶的首選，這會(huì)造成嚴(yán)重的大氣污染。有研究表明，谷物中的色素大部分屬于類胡蘿卜素、花色素，其種皮或秸稈、胚芽中含有大量的天然色素[7]。目前，國內(nèi)外對玉米和小米黃色素研究報(bào)道較多，而對谷子秸稈中黃色素的研究尚未見報(bào)道。微波法提取玉米黃色素具有時(shí)間短、耗能少、效率高等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于天然色素的生產(chǎn)中[8]。微波法提取秸稈黃色素，特別是響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝的研究未見報(bào)道。提取谷物中的色素類物質(zhì)，不僅為天然色素開拓了新資源，又為農(nóng)副產(chǎn)物的深細(xì)加工和增值、谷子秸稈的處理方法開辟了一條新途徑[9-11]。

本試驗(yàn)以張雜谷10號的秸稈為原料，以一定濃度的乙醇溶液為提取劑，微波提取黃色素。在單因素試驗(yàn)和因子篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝條件的優(yōu)化，以期獲得最佳提取工藝，為谷子秸稈的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

谷子秸稈（張雜谷10號）來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站；無水乙醇為國產(chǎn)分析純。

UV WinLab V6紫外可見分光光度計(jì)（珀金埃爾默儀器有限公司）；JDG-0.2真空凍干試驗(yàn)機(jī)（蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司）；R2010-Ⅱ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；722 G可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HCP-100型華晨高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠）；ML-2080 EG型微波爐（青島膠南海爾微波制品有限公司）；TDL-4低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)于2014年12月至2015年1月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院實(shí)施完成。

1.2.1 色素提取工藝原料→清洗→40℃熱風(fēng)干燥→粉碎→過篩（0.25 mm）→微波輔助一定濃度乙醇提取→抽濾→離心（4 000 r/min，10 min）→減壓濃縮（45℃，0.08 MPa）→初步純化→冷凍干燥（板溫40℃，真空度40～50 Pa）→黃色素粗提物（橘紅色粉末）。

1.2.2 最大吸收波長的確定將色素提取液稀釋至一定濃度（以吸光度大小計(jì)），用紫外可見分光光度計(jì)在380～800 nm進(jìn)行光譜掃描，確定該色素在可見光范圍內(nèi)的最大吸收波長。

1.2.3 單因素試驗(yàn)分別稱取一定量秸稈粉末，加入相應(yīng)提取劑，于反應(yīng)裝置中反應(yīng)一段時(shí)間，抽濾、離心后取上清液，在最大吸收波長處測其吸光度。每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。以乙醇體積分?jǐn)?shù)（V/V）40%，60%，80%，100%，微波功率160，320，480，640，800 W，微波輻射時(shí)間10，20，30，40，50，60 s，料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35（g/mL）及提取次數(shù)1，2，3次分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定最佳的提取工藝參數(shù)。

1.2.4 Plackett-Burman因子篩選試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、微波功率（X2）、微波輻射時(shí)間（X3）、料液比（X4）和提取次數(shù)（X5）進(jìn)行PB試驗(yàn)，以色素提取液吸光度為響應(yīng)值。每個(gè)因素取2水平（以-1，1編碼），自變量因素水平列于表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝在單因素和因子篩選試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[12]，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波輻射時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)顯著影響因子為自變量，吸光度為評價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，自變量因素水平如表2所示。其他因素條件為：微波輻射功率320 W，料液比1∶20（g/mL）。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

以95%乙醇溶液為提取劑，380～800 nm波長內(nèi)對谷子秸稈黃色素提取液進(jìn)行光譜掃描。該色素在444 nm處有最大吸收峰，即最大吸收波長為444 nm（圖1）。因最大吸收波長處靈敏度大，吸光度隨物質(zhì)濃度變化的幅度最大，也可避免其他物質(zhì)的干擾，所以，選擇最大吸收波長為444 nm。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對色素提取的影響從圖2可以看出，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，色素提取液吸光度逐漸增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，色素提取液吸光度最大；超過80%后，色素提取液的吸光度逐漸減小。這可能是由于乙醇溶液濃度太低時(shí)，水分含量多，不能有效地將色素溶出；若乙醇濃度太高，會(huì)溶出大量醇溶蛋白，蛋白質(zhì)與色素形成復(fù)合物，離心時(shí)會(huì)帶走部分色素，使其含量下降。因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)以80%為宜。

2.2.2 微波輻射功率對色素提取的影響由圖3可知，隨微波功率增大，色素提取液吸光度逐漸增大，在320～640 W之間達(dá)到峰值。這可能是由于隨微波功率逐漸增強(qiáng)，機(jī)械振動(dòng)效應(yīng)加強(qiáng)，當(dāng)功率大于320 W時(shí)，微波對秸稈的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了較強(qiáng)的破壞作用，體系中有微小的淀粉粒析出，這些淀粉粒會(huì)吸附部分色素分子，被吸附的色素分子在隨后的離心過程中會(huì)隨淀粉等大分子顆粒發(fā)生沉降分離，從而導(dǎo)致提取液中色素含量下降[13]；同時(shí)又由于微波功率太大，易導(dǎo)致熱效應(yīng)，使提取物體系因溫度急劇上升而爆沸，破壞了色素結(jié)構(gòu)，且容易發(fā)生危險(xiǎn)[14-15]。因此，最佳微波輻射功率以320W為宜。

2.2.3 微波輻射時(shí)間對色素提取的影響由圖4可知，當(dāng)微波功率一定時(shí)，隨微波輻射時(shí)間的延長，色素提取液的吸光度逐漸增大；當(dāng)微波輻射時(shí)間達(dá)到20 s時(shí)，色素提取液吸光度最大，超過20 s后，色素提取液吸光度又逐漸下降。這可能是由于同等質(zhì)量的物料在相同功率條件下，微波輻射時(shí)間越長，提取物體系吸收的微波能就越多，物料溫度也會(huì)越高，可加快體系擴(kuò)散速度[16]；當(dāng)微波輻射時(shí)間過長，提取物長期處于較高溫度下，色素的部分結(jié)構(gòu)可能遭到破壞。因此，最佳微波輻射時(shí)間以20 s為宜。

2.2.4 料液比對色素提取的影響由圖5可知，隨料液比減少，色素提取液吸光度逐漸增大；當(dāng)料液比為1∶25（g/mL）時(shí)，色素提取液吸光度最大，而小于1∶25（g/mL）時(shí)，吸光度逐漸下降。這可能是由于當(dāng)料液比較高時(shí)，提取劑與物料的濃度差較小，色素提取不完全；隨著料液比的減小，溶劑體系的擴(kuò)散速度增大，有利于色素溶出；但當(dāng)料液比低于1∶25（g/mL）后，吸光度基本不變，可能是色素已完全浸出。當(dāng)料液比為1∶20，1∶25（g/mL）時(shí)，吸光度變化不大，考慮到過大提取劑用量會(huì)造成溶劑浪費(fèi)，后續(xù)濃縮回收困難，生產(chǎn)成本高。因此，最佳料液比以1∶20（g/mL）為宜。

2.2.5 提取次數(shù)的確定由圖6可知，隨提取次數(shù)增加，色素提取液的吸光度逐漸增大，但由于提取次數(shù)過多，導(dǎo)致溶劑浪費(fèi)，浸提時(shí)間延長，且后續(xù)工作繁多。因此，提取次數(shù)以2次為宜。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)因子篩選結(jié)果分析

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示，經(jīng)Minitab 16.0軟件對表3進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。

從表4可以看出，該模型顯著（P＜0.05），說明此模型可以進(jìn)行因子的篩選。乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波輻射時(shí)間和提取次數(shù)對谷子秸稈色素提取液的吸光度影響顯著，而微波功率和料液比對吸光度影響不顯著。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波輻射時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析

2.4 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.4.1 回歸模型的建立及方差分析按照表5進(jìn)行組合試驗(yàn)，采用Design Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，擬合后得到乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)和微波輻射時(shí)間的二次多項(xiàng)式回歸方程。

對回歸模型（1）進(jìn)行方差分析，結(jié)果列于表6。從表6可以看出，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬相對于純誤差不顯著（P＞0.05），說明試驗(yàn)誤差小?；貧w模型的決定系數(shù)R2為0.992 6，說明響應(yīng)值的變化有99.26%來自于自變量。該回歸模型的自變量與響應(yīng)值之間存在良好的線性關(guān)系，對試驗(yàn)的擬合度較好，可以客觀地描述各自變量與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。

從表6可以看出，一次項(xiàng)A和C對秸稈黃色素吸光度的影響極顯著，B對秸稈黃色素的影響不顯著；交互相AC對秸稈黃色素的影響極顯著，而AB和BC對其的影響不顯著；二次項(xiàng)A2對其影響極顯著，B2和C2對其影響不顯著。說明各因素對谷子秸稈黃色素提取工藝的影響不是簡單的線性關(guān)系[17]。

表5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

表6 回歸模型的方差分析

2.4.2 各因素交互項(xiàng)的響應(yīng)面分析[18]從圖7可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取次數(shù)的交互作用對該色素的提取影響極顯著，該曲面較陡，響應(yīng)值變化越大，且軸向等高線密集；乙醇體積分?jǐn)?shù)對色素提取的影響不及提取次數(shù)顯著，曲面緩和，軸向等高線相對稀疏。

由圖8可知，微波輻射時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對該色素的提取影響不顯著；微波輻射時(shí)間對秸稈黃色素吸光度的影響不顯著。圖7，8結(jié)果與回歸方程的方差分析結(jié)果相吻合，說明響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以較好地反映自變量對響應(yīng)值的影響。

2.4.3 提取工藝的優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)通過回歸方程的預(yù)測，谷子秸稈黃色素的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)72%，料液比1∶20（g/mL），微波輻射功率320 W，微波輻射時(shí)間30 s，提取3次。按最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，得色素提取液平均吸光度為0.634，與軟件預(yù)測值0.641基本一致（相對誤差1.09%）。這也說明響應(yīng)面法適合對色素的提取進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 討論與結(jié)論

體積分?jǐn)?shù)高的乙醇提取會(huì)造成大量醇溶蛋白溶出，且試驗(yàn)成本較高，而體積分?jǐn)?shù)低的乙醇因水分含量高，物料吸收微波能少，色素溶出也較少。本試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為72%，既減少了醇溶蛋白等雜質(zhì)，降低了成本，又保證了提取效果。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了多個(gè)單因素試驗(yàn)，并采用Plackett-Burman因子篩選試驗(yàn)確定出主要影響因子，避免了因?yàn)閱我蛩剡x擇不佳而造成響應(yīng)面模型的不顯著，進(jìn)而不能真實(shí)地描述自變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

本研究在單因素和因子篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，建立各影響因素的二次回歸模型。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對該模型進(jìn)行回歸分析，得出該回歸模型可以客觀地描述各自變量與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。一次項(xiàng)A和C對秸稈黃色素吸光度的影響極顯著，B影響不顯著；交互相AC影響極顯著，AB和BC影響不顯著；二次項(xiàng)A2影響極顯著，B2和C2影響不顯著。說明各因素對谷子秸稈黃色素提取工藝的影響不是簡單線性關(guān)系。通過響應(yīng)面分析可知，微波-乙醇助提法可實(shí)現(xiàn)高效、快速提取。響應(yīng)面分析結(jié)果表明，秸稈黃色素最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為72%（V/V），料液比1∶20（g/mL），微波功率320 W，微波處理時(shí)間30 s，提取3次。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到黃色素提取液的吸光度為0.634，這與預(yù)測值0.641基本一致。

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Analysis of Response Surface about Yellow Pigment Extracted From Millet Straw

ZHANG Chun-feng，HAO Lin
（College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The paper took the millet straw as raw material to study the extraction technology of yellow pigment by microwave-ethanol solution.Through the single factor experiments,it investigated the influence of some factors on the extraction of yellow pigment from millet straw,such as ethanol content（V/V）,microwave power,microwave processing time,solid-liquid ratio and extraction times.Then it chose significantly influencing factors by factor screening test.Based on that,the paper used the Box-Behnken response surface method to design the experiment to determine the best process.The result showed that the optimum extracted conditions was as follows:72%ethanol（V/V）was extracting agent,solid-liquid ratio was 1∶20（g/mL）,320 W microwave processed 30 s,extracting 3 times.The average absorbance of pigment extracting solution was 0.634,which was similar with the predicted value（the relative error was 1.09%）.

millet straw;microwave-ethanol extraction;yellow pigment;response surface

S515

A

1002-2481（2016）02-0242-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.29

2015-10-13

張春鳳（1990-），女，山東濟(jì)寧人，在讀碩士，研究方向：現(xiàn)代雜糧生產(chǎn)。郝林為通信作者。