沙棘葉中科羅索酸濃縮工藝初探

田曉東，張璐，張瓊姝，王斌，張吉科，郭海利，張小民

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

沙棘葉中科羅索酸濃縮工藝初探

田曉東1，張璐1，張瓊姝1，王斌1，張吉科2，郭海利2，張小民1

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

通過(guò)對(duì)沙棘葉除雜和多種有機(jī)溶劑提取，對(duì)沙棘葉中科羅索酸進(jìn)行了濃縮并通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定其含量。結(jié)果表明，最佳濃縮方法是先將沙棘葉水提去除水溶性雜質(zhì)，再用低醇去除醇溶性雜質(zhì)，最后熱乙醇提取，所得乙醇粗提物中科羅索酸含量為2.14%。該方法安全、簡(jiǎn)便，為從沙棘葉中獲得高純度的科羅索酸奠定了基礎(chǔ)。

沙棘葉；科羅索酸；濃縮；測(cè)定

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）是胡頹子科沙棘屬植物，生長(zhǎng)于半干旱區(qū)域的灌木或喬木，在山西、陜西、青海、甘肅、內(nèi)蒙古等省份廣泛分布，具有重要的生態(tài)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。因其具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和繁殖能力以及在林業(yè)和水土保持領(lǐng)域的卓越貢獻(xiàn)，沙棘在許多省份推廣種植。僅山西省沙棘種植面積就多達(dá)13萬(wàn)hm2[3]。沙棘果和葉中含有多種生物活性物質(zhì)，如黃酮類、萜類、維生素、多糖等[4]。在醫(yī)藥方面，沙棘果和種子的研究報(bào)道較多，而對(duì)沙棘葉研究較少。姚凌云等[5]首次從沙棘葉中分離得到科羅索酸。

科羅索酸（corosofic acid）也稱為2α-羥基熊果酸，是一種存在于多種植物中的三萜酸類化合物，因其在降血糖、抗炎、抗腫瘤、抗心血管疾病方面有著顯著作用而受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥工作者的廣泛關(guān)注。尤其是在降糖方面，科羅索酸被稱作“植物中的胰島素”，開(kāi)發(fā)利用價(jià)值極高。在臨床試驗(yàn)中，Ikeda等[6-7]均發(fā)現(xiàn)科羅索酸具有明顯的降糖效果。吳哲等[8]測(cè)得沙棘葉中科羅索酸的含量為0.055 0%。與富含科羅索酸的枇杷葉[9]和大花紫薇葉[10]相比，沙棘葉中科羅索酸含量較低，純化成本較高?？屏_索酸治療糖尿病的劑量為4 mg/kg[11]，對(duì)于體質(zhì)量70 kg的成年患者，每日劑量為280 mg。如果將沙棘葉用于降糖保健品的開(kāi)發(fā)，考慮到提純科羅索酸的成本較大，只需將沙棘葉中科羅索酸濃縮至1%～3%，方可達(dá)到降低血糖的目的。

本試驗(yàn)將初步探究和比較從沙棘葉中濃縮科羅索酸的不同工藝，并選擇最佳的濃縮方法，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用沙棘葉中的科羅索酸奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

沙棘葉購(gòu)買(mǎi)自山西金科海生物科技有限公司；科羅索酸（標(biāo)品）購(gòu)買(mǎi)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇和甲醇購(gòu)買(mǎi)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-3000型，上海亞榮生化儀器廠）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9076MBE型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；電子分析天平（AB104-N型，瑞士梅特勒-托利多）；恒溫水浴鍋（HHS型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 濃縮工藝方法一：將一定量的干燥沙棘葉粉碎后過(guò)篩（0.18 mm），浸置于蒸餾水中，加熱至80℃，浸泡4 h，過(guò)濾棄濾液后，將沙棘葉在烘箱中60℃烘干。烘干后的沙棘葉置于圓底燒瓶中，按料液比1∶10加入無(wú)水乙醇，90℃水浴煎煮3 h，過(guò)濾后將濾液迅速倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，減壓濃縮提取液，回收無(wú)水乙醇，最后在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥濃縮液，制得浸膏，4℃保存。

方法二：方法同方法一，只是水提烘干后的沙棘葉再用甲醇提取。

方法三：取水提后烘干的沙棘葉，用25%的乙醇在索氏提取器中回流浸提3次，將沙棘葉再次在60℃烘箱中烘干，置于圓底燒瓶中，按料液比1∶10加入無(wú)水乙醇，90℃煎煮3 h，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮提取液，回收乙醇，制得浸膏，4℃保存。

方法四：取水提后烘干的沙棘葉，經(jīng)25%的乙醇回流浸提后，再次烘干，置于圓底燒瓶中，按料液比1∶10加入甲醇，90℃煎煮3 h，過(guò)濾，濃縮提取液，回收甲醇，制得浸膏，4℃保存。

1.2.2 色譜檢測(cè)條件流動(dòng)：甲醇∶1%冰醋酸為83∶17；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；流速為1 mL/min；柱溫為30℃；色譜柱為Agilent20RBA×SB-C18（4.6mm× 250 mm，5 μm）。

1.2.3 樣品的處理精密稱取方法一、方法二、方法三和方法四所得到的浸膏各3 g，分別加25 mL的石油醚，浸泡40 min，重復(fù)2次。倒去石油醚，干燥后，用甲醇冷浸超聲提取2次，每次25 mL，冷浸30 min，超聲40 min，合并提取液，過(guò)濾，濾液用甲醇定容至100 mL容量瓶，待測(cè)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用電子天平準(zhǔn)確稱取純科羅索酸18.7 mg，溶解于甲醇中并定容至25 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.748 mg/mL的科羅索酸標(biāo)準(zhǔn)液，取0.5，1，2，4，6 mL分別置于容量瓶中，加甲醇定容至10 mL，各進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。橫坐標(biāo)為進(jìn)樣濃度（X），縱坐標(biāo)為標(biāo)品色譜圖峰面積（Y），可以得到線性方程：Y＝4 805.2X＋37.015（R2＝0.999 65）。

2 結(jié)果與分析

參照標(biāo)品色譜圖，保留時(shí)間在15 min處的峰所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)是科羅索酸（圖1）。樣品處理后，用高效液相色譜在1.2.2色譜條件下測(cè)試。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上述4種方法制得浸膏中科羅索酸的含量，其中，方法一所得浸膏科羅索酸含量為0.51%（圖2）；方法二所得浸膏科羅索酸含量為0.57%（圖3）；方法三所得浸膏科羅索酸含量為2.14%（圖4）；方法四所得浸膏科羅索酸含量為1.77%（圖5）。水提除雜后科羅索酸含量較低，醇提除雜后科羅索酸含量明顯升高。

3 討論

科羅索酸屬α-香樹(shù)脂醇型或?yàn)跛雇樾臀瀛h(huán)三萜類化合物，結(jié)構(gòu)為多氫蒎的五環(huán)母核[12]。純科羅索酸為白色粉末狀，不溶于水，可以溶于熱乙醇、甲醇。

目前，科羅索酸的來(lái)源主要是從天然植物中提取和有機(jī)合成，含科羅索酸的植物主要有大葉紫薇和枇杷等，其中，科羅索酸與同為五環(huán)三萜類化合物的齊墩果酸并存，提純分離難度較大。鞠建華等[13]將枇杷葉采用95%的乙醇回流提取獲得浸膏，后經(jīng)萃取、洗脫、低壓柱色譜分離得到了科羅索酸。陳龍勝等[14]研究了乙醇提取枇杷葉中科羅索酸的提取工藝?？v偉等[10]從大葉紫薇葉中，采用薄層色譜分離方法得到了科羅索酸。劉博等[15]提取山茱萸中科羅索酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇、丙醇這3種提取溶劑均可以提取出中藥材中的三萜類物質(zhì)。孫宏斌等[16]發(fā)明了利用化學(xué)有機(jī)合成法制備科羅索酸。陳劍鋒[17]發(fā)明了將植物水煮除雜、有機(jī)溶劑提取、大孔吸附樹(shù)脂富集純化等方法獲得科羅索酸。賀建榮等[18]以枇杷葉為原料，先水煮去除水溶性雜質(zhì)，后低醇去除部分醇溶性雜質(zhì)，最后甲醇提取得到科羅索酸粗品。朱力杰等[19]從五味子中運(yùn)用高效逆流色譜分離制得科羅索酸。林國(guó)榮等[20]通過(guò)乙醇浸提法提取枇杷葉中的熊果酸和科羅索酸。在上述方法中多數(shù)使用了甲醇、石油醚等有機(jī)溶劑，雖然提取、濃縮的效果比較好，但是工藝較為復(fù)雜，有機(jī)溶劑的殘留不易去除。加之沙棘葉中科羅索酸含量較低，故不適合使用。

在本試驗(yàn)中，第一步都是用水提法除雜，可以去除29.85%的水溶性雜質(zhì)。由于科羅索酸溶于熱乙醇和甲醇，將水提后的沙棘葉棄濾液烘干后，用90℃熱乙醇提取，科羅索酸含量0.51%；用90℃甲醇提取，科羅索酸含量為0.57%。由于低醇可以去除部分醇溶性雜質(zhì)，將水提法除雜后烘干的沙棘葉再次用25%的乙醇除雜，可去除21.36%醇溶性雜質(zhì)；棄濾液烘干后的沙棘葉用90℃熱乙醇提取，科羅索酸含量為2.14%，用90℃甲醇提取，科羅索酸含量為1.77%。由于科羅索酸在熱乙醇中的溶解度略高于熱甲醇中溶解度，并且考慮到甲醇的毒性和殘留量，都會(huì)給提取和后期檢測(cè)帶來(lái)諸多不便。因此，選用熱乙醇作為提取沙棘葉中科羅索酸的提取溶劑。最佳提取方案為：先用水提除雜，再用25%乙醇除雜，最后用熱乙醇提取。

該最佳濃縮方法中只使用了水和乙醇，故不存在有毒物殘留；而且制備工藝簡(jiǎn)單、安全、成本低，鑒于科羅索酸在醫(yī)藥領(lǐng)域的重要性，本研究為沙棘葉在醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步拓展奠定了基礎(chǔ)。

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Preliminary Study on Concentration Process of Corosolic Acid of Sea Buckthorn Leaves

TIAN Xiao-dong1，ZHANG Lu1，ZHANG Qiong-shu1，WANG Bin1，ZHANG Ji-ke2，GUO Hai-li2，ZHANG Xiao-min1
（1.College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Shanxi Jinkehai Biological Technology Co.，Ltd.，Taiyuan 030006，China）

Through purifying sea buckthorn leaves and using various organic solvent extraction methods,corosolic acid is concentrated.The content of corosolic acid from crude extracts made by four kinds of different concentration method is determined by high performance liquid chromatography.The results indicate that the optimum concentration method is:first using water formulation to remove water soluble impurities in sea buckthorn leaves,and then using low alcohol tore move alcohol soluble impurities,finally using hot ethanol to extract.As a result,the corosolic acid content of ethanol crude extract is 2.14%.This method is safe and simple,and lays a foundation for further obtaining high purity corosolic acid from sea buckthorn leaves.

sea buckthorn leaves;corosolic acid;concentration;determination

S793.6；TQ463

A

1002-2481（2016）02-0239-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.28

2015-09-25

田曉東（1990-），男，山西呂梁人，在讀碩士，研究方向：天然植物降血糖成分提取。張小民為通信作者。