補(bǔ)腎利濕法對(duì)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎MMP3、Caspase-5表達(dá)的影響*

姜德友　馮　濤　陳　飛　韓潔茹　柳成剛　隋方宇

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)(哈爾濱150040)

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補(bǔ)腎利濕法對(duì)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎MMP3、Caspase-5表達(dá)的影響*

姜德友馮濤陳飛韓潔茹柳成剛隋方宇△

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)(哈爾濱150040)

摘要目的：建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis，GA)大鼠模型，研究炎癥因子和抗炎因子的表達(dá)情況，明確補(bǔ)腎利濕法防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為補(bǔ)腎利濕法防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。 方法：將84只SD大鼠隨機(jī)分為7組：依次為空白組、模型組、中藥對(duì)照組、西藥對(duì)照組及中藥低、中、高劑量組，每組各12只采用尿酸鈉聯(lián)合氧嗪酸鉀誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物GA模型，應(yīng)用ELISA法，分別檢測(cè)各組大鼠血清中MMP3、Caspase-5的含量。 結(jié)果：與空白對(duì)照組相比，造模各組血液與滑膜組織中MMP3與Caspase-5的水平均顯著增高。中藥經(jīng)方中劑量組、高劑量組與模型組相比，血液和滑膜組織中MMP3與Caspase-5的濃度有所增加，與秋水仙堿組無差異。而痛風(fēng)舒組和經(jīng)方低劑量組，與模型組相比，血液和滑膜組織中MMP3、Caspase-5的濃度有所下降,但與秋水仙堿組比較仍有差異。但是，痛風(fēng)舒組和經(jīng)方低劑量組MMP3、Caspase-5的濃度與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：補(bǔ)腎利濕法可抑制大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中MMP3、Caspase-5的表達(dá)，對(duì)防治GA有一定的作用。

主題詞 關(guān)節(jié)炎，痛風(fēng)性MMP3Caspase-5@補(bǔ)腎利濕

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于尿酸鈉沉積于關(guān)節(jié)滑膜組織引起的炎癥反應(yīng)，目前仍以西藥為主來控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的急性發(fā)作，如促尿酸排泄劑、抑制尿酸生成劑、秋水仙堿、激素等，但此類藥物副作用多，中毒率高，易引發(fā)腎功能損害、皮膚過敏甚至毒性上皮壞死[1-2]。因此選擇安全有效的中醫(yī)中藥對(duì)于防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是大勢(shì)所趨。本實(shí)驗(yàn)研究目的在于，通過研究補(bǔ)腎利濕法對(duì)防治GA炎的作用機(jī)制，為中藥治療GA提供理論依據(jù)。

1材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康雄性SD大鼠共84只，體重(200±20) g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(黑)2008-0017]。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器多用途高速臺(tái)式離心機(jī)(貝克曼X-22R )，電子分析天平(梅特勒AL204)，酶標(biāo)儀(Gene Company synergy H7)，恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒DHG-9140A)。

1.3實(shí)驗(yàn)藥品與試劑補(bǔ)腎利濕法中藥處方(澤瀉、熟地黃、山茱萸、萆薢等組成，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房)。痛風(fēng)舒片(批號(hào)140301)；秋水仙堿(批號(hào)140807)；微量尿酸鈉結(jié)晶(批號(hào)CAS1198-77-2)、氧嗪酸鉀(批號(hào)CAS2207-75-2)。MMP3 Elisa試劑盒(批號(hào)201501)、Caspase-5 Elisa試劑盒(批號(hào)201501)。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1補(bǔ)腎利濕法處方中藥溶液的制備將每劑處方中藥材置入砂鍋中，加入4倍體積的水后，浸泡30min后分2次煎煮，煎30min/次,去渣后兩煎混合，G4濾器過濾，于60℃水浴中濃縮成含原液3.74g/mL的藥液，取部分藥液稀釋濃度為其濃度0.5倍，另取部分藥液濃縮至其濃度2倍，3組藥液均密封隔水煮沸消毒，4℃冰箱恒溫保存待用。

2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將大鼠隨機(jī)分為7組，每組各12只，分別為空白組、模型對(duì)照組、痛風(fēng)舒對(duì)照組(0.1g/mL)、秋水仙堿對(duì)照組(0.05mg/mL)、中藥低劑量組(2g/kg)、中藥中劑量組(5g/kg)、中藥高劑量組(10g/kg)。 灌胃量根據(jù)大鼠體重?fù)Q算，以1mL/0.1kg為標(biāo)準(zhǔn)劑量，空白組和模型組灌胃生理鹽水，其余各組灌胃相應(yīng)藥物。1d1次，連續(xù)7d，末次給藥后造模。

2.3痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的建立用3%氧嗪酸鉀溶液，以15mL/kg進(jìn)行換算，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射。15min后將其仰臥固定， 碘伏消毒右后肢小腿膝關(guān)節(jié)，用BD針在大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)右后側(cè)從35±5°方向插入至肌腱內(nèi)側(cè),感覺有落空感后，注人10%尿酸鈉溶液0.2mL，制備GA模型。 空白組右后肢膝關(guān)節(jié)注射等體積生理鹽水。

2.4樣本采集造模成功后對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠于眼眶進(jìn)行取血，室溫下靜置30min，3500r/min離心15min，分離血清取上清液，置于4℃冰箱凍存待測(cè)。

2.5檢測(cè)指標(biāo)取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清及滑膜組織中MMP3、Caspase-5的濃度，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組樣本均數(shù)間比較選擇單因素方差分析，兩組樣本間均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。

3結(jié)果3.1血清中MMP3的表達(dá)情況與空白對(duì)照組相比，造模各組血液中MMP3的水平明顯增高(P<0.05)。補(bǔ)腎利濕法經(jīng)方中劑量組、高劑量組與模型組相比，血液中MMP3的濃度明顯下降(P<0.05)，與秋水仙堿組無差異(P>0.05)。而痛風(fēng)舒組和經(jīng)方低劑量組，與模型組相比，血液MMP3的濃度有所下降(P<0.05),但與秋水仙堿組比較仍有差異(P<0.05)。但是，痛風(fēng)舒組和經(jīng)方低劑量組MMP3的濃度與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2血清中Caspase-5的表達(dá)情況與空白對(duì)照組相比，造模各組血液中Caspase-5的水平顯著增高(P<0.05)。補(bǔ)腎利濕法經(jīng)方中劑量組、高劑量組與模型組相比，血液中Caspase-5的濃度明顯下降(P<0.05)，與秋水仙堿組無差異(P>0.05)。而痛風(fēng)舒組和經(jīng)方低劑量組，與模型組相比，血液中Caspase-5的濃度有所下降(P<0.05),但與秋水仙堿組比較仍有差異(P<0.05)。但是，痛風(fēng)舒組和經(jīng)方低劑量組Caspase-5的濃度與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4討論研究表明關(guān)節(jié)組織中尿酸鈉(Monosodium urate monohydrate，MSU)結(jié)晶沉積是痛風(fēng)發(fā)作的主要誘因，局部粒細(xì)胞吞噬尿酸鹽結(jié)晶會(huì)引起關(guān)節(jié)組織的炎癥反應(yīng)[3]。Caspases家族是近年研究發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，其中Caspases-5，參與白介素前體的活化,是具有一定特異性的炎癥標(biāo)記物，其間接反應(yīng)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者炎癥的病情程度[4]。在骨吸收作用中，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs) 發(fā)揮重要作用，其能夠降解骨關(guān)節(jié)中的骨基質(zhì)，尤其是破骨細(xì)胞表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶 3(Matrix metalloproteinase 3，MMP3) ，研究表明其在骨吸引中起重要作用[5]。Hayami等[6]研究表明，骨質(zhì)中表達(dá)MMP3，其不僅參與骨基質(zhì)的降解同時(shí)導(dǎo)致骨量減少。近幾年學(xué)者對(duì)MMP3的研究也表明，MMP3的水平與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中骨組織損傷的程度具有一定的相關(guān)性。故可認(rèn)為血清中MMP3、Caspase-5水平可以作為判斷急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎病情程度的重要指標(biāo)之一。

最早在朱丹溪的 《格致余論·痛風(fēng)論》中即有“痛風(fēng)”、“歷節(jié)風(fēng)”等論述，并指出血分受熱，污濁凝滯是其主要病因病機(jī)。而近代醫(yī)家普遍認(rèn)為本病多由先天稟賦不足加之后天飲食過于肥甘厚膩，礙脾傷腎。腎氣不化，致濕濁內(nèi)生，蘊(yùn)聚不解，釀生濁毒。濕濁內(nèi)盛或濕濁化熱，流注關(guān)節(jié)、筋骨，致經(jīng)脈閉阻，即可出現(xiàn)關(guān)節(jié)痹痛；水濕不化，水液內(nèi)蓄可致水腫等變證；或濕凝為痰，痰瘀互結(jié)而變生痛風(fēng)石。故本研究以補(bǔ)腎利濕法立方，以漢代醫(yī)家張仲景的腎氣丸組方演變而來，方劑由熟地黃、澤瀉、山藥、山茱萸、萆薢等組成，共奏清熱利濕，祛濁補(bǔ)腎之效。宋艷芳[7]研究表明清熱利濕，祛濁補(bǔ)腎這一治法對(duì)痛風(fēng)的防治都有積極的影響。我們利用補(bǔ)腎利濕法治療大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，在前期實(shí)驗(yàn)中抗炎、消腫及鎮(zhèn)痛都顯示了良好的效果[8]。補(bǔ)腎利濕法處方中藥對(duì)于改善GA的炎癥癥狀方面具有積極效應(yīng)。造模后模型組血清MMP3、Caspase-5表達(dá)顯著上升，本研究結(jié)果表明補(bǔ)腎利濕法處方中藥可能通過抑制MMP3、Caspase-5表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)緩解炎癥，減少骨組織破壞的目標(biāo)，對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有一定的防治作用。本研究為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為痛風(fēng)在臨床上診治提供了新方向。

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[7]宋艷芳.論濁毒與痛風(fēng)尿酸毒性的相關(guān)性[J]. 陜西中醫(yī),2014，35(1)：62-63.

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(收稿2015-10-09；修回2015-12-01)

通訊作者△

【中圖分類號(hào)】R684.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.06.050

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 81173170)