祛腐生肌方促進(jìn)慢性皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合機(jī)制研究*

朱　頡　曹　億　于萌蕾　黃都平　彭吉才　羅自通　曾　兵

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院(廣州 510289)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

祛腐生肌方促進(jìn)慢性皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合機(jī)制研究*

朱頡曹億于萌蕾黃都平彭吉才羅自通曾兵△

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院(廣州 510289)

摘要目的：分析祛腐生肌方對(duì)慢性皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。方法：60只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、祛腐生肌方組，每組30只，依據(jù)文獻(xiàn)復(fù)制慢性皮膚潰瘍模型，造模成功后各組每天換藥1次，共計(jì)15d，觀察各組用藥后5d、10d、15d創(chuàng)面愈合率；采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、白介素-1(IL-1)水平含量；水解法測(cè)定大鼠皮膚肉芽組織羥脯氨酸(HyP)含量。結(jié)果：祛腐生肌方組第5d創(chuàng)面愈合率與對(duì)照組比較，無(wú)顯著差異；第10、15 d與對(duì)照組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與對(duì)照組比較，祛腐生肌方組第5、10d血清TNF-a、IL-1水平含量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；第15d與對(duì)照組相比無(wú)差異；祛腐生肌方組第5、10、15dHyP含量均高于對(duì)照組。結(jié)論：祛腐生肌方能促進(jìn)慢性皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合，其作用機(jī)制可能與改善炎癥狀態(tài)、增加創(chuàng)面膠原蛋白，提高局部微循環(huán)有關(guān)。

主題詞潰瘍/中醫(yī)藥療法@祛腐生肌方動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)大鼠

慢性皮膚潰瘍是指2周以上創(chuàng)面未愈合的皮膚軟組織缺損，是臨床難治性疾病之一。本病以病程長(zhǎng)，反復(fù)發(fā)作，治療費(fèi)用高為特點(diǎn)，給患者生活、工作帶來(lái)嚴(yán)重影響[1]。祛腐生肌法是中醫(yī)皮膚科的常用方法，通過(guò)局部用藥，能促進(jìn)創(chuàng)面腐爛壞死組織脫落，在局部創(chuàng)面形成相對(duì)潔凈的微環(huán)境，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[2-3]，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本課題在前期研究基礎(chǔ)上，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，觀察祛腐生肌方對(duì)慢性皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合率、炎性因子、羥脯氨酸的影響。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠60只，體重190±20g，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物祛腐生肌方(煅爐甘石、白芷、鍛龍骨、當(dāng)歸各20g，血竭、乳香、冰片各10g，黃芪30g)，購(gòu)于本院中藥房，并經(jīng)中藥房主管藥師鑒定，將各藥研極細(xì)末，混勻分裝備用。生理鹽水(本院藥劑科提供)。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑大鼠TNF-a、IL-1的ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20130621、20130923)、HyP含量測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20130319)，均購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4動(dòng)物造模方法參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[4-5]，實(shí)驗(yàn)前用脫毛膏將大鼠背部進(jìn)行脫毛，面積約4.0cm×4.0cm。第二天用4%水合氯醛(0.4mL/100g)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，然后在脫毛區(qū)用3cm×3cm 的塑料框架蘸龍膽紫標(biāo)記造模面積，無(wú)菌條件下剪去造模區(qū)皮膚，深達(dá)筋膜，并在筋膜下噴灑金黃色葡萄球菌(4mL/kg)，三層醫(yī)用紗布覆蓋創(chuàng)面，用橡皮膏包扎固定，隨后每只大鼠股肌注氫化可的松(0.4mL/100g)，連續(xù)3d，造模結(jié)束。造模成功后第二天兩組開(kāi)始換藥，對(duì)照組給予生理鹽水處理創(chuàng)面，祛腐生肌方組在創(chuàng)口處使用祛腐生肌方藥粉，兩組再以生理鹽水濕紗布外敷，外覆蓋干紗布，并以繃帶包扎固定，每日給藥1次，共計(jì)15d。

1.5觀察指標(biāo)1.5.1觀察各組大鼠第5、10、15d創(chuàng)面愈合率:創(chuàng)面附標(biāo)尺，采用數(shù)碼相機(jī)拍照，記錄大鼠創(chuàng)面情況，運(yùn)用imagepro-plus軟件分析處理。

1.5.2血清TNF-a、IL-1水平測(cè)定:分別于給藥5、10、15d后，兩組分別麻醉10只動(dòng)物，大鼠腹主動(dòng)脈取血，靜置30min后離心(2000r/min，20min)，取上清分裝于EP管，-70°C保存，采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，指標(biāo)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5.3皮膚肉芽組織HyP測(cè)定:分別于給藥5、10、15d后，兩組分別麻醉10只動(dòng)物，剪取潰瘍區(qū)約4～6cm皮膚肉芽組織。各組精確稱量肉芽組織，采用水解法測(cè)定，指標(biāo)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2結(jié)果

2.1各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較從表l可以看出，與對(duì)照組比較，祛腐生肌方組第5d無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；第10、15d與對(duì)照組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。

2.2各組血清TNF-α、IL-1水平含量比較從表2可以看出，與對(duì)照組比較，祛腐生肌方組第5、10d相比，各組血清TNF-α、IL-1水平含量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；第15d與對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0.05)。

2.3各組皮膚肉芽組織中HyP含量比較從表3可以看出，與對(duì)照組比較，祛腐生肌方組第5、10、15dHyP含量高于對(duì)照組(P<0.05)。

3討論中醫(yī)學(xué)治療本病有悠久的歷史，對(duì)慢性皮膚潰瘍優(yōu)勢(shì)明顯，現(xiàn)已得到廣泛運(yùn)用[6]。對(duì)于慢性潰瘍而言，由于創(chuàng)面遷延不愈，臨床表現(xiàn)為皮膚暗黑，創(chuàng)口下陷，腐肉難脫，新肌不生，創(chuàng)面難以愈合為特點(diǎn)[7]。《醫(yī)學(xué)入門》[8]認(rèn)為：“瘡口不斂，由于肌肉不生，肌肉不生，由于腐肉不祛?！薄夺t(yī)宗金鑒》更有“腐不祛則肌不生”之說(shuō)。此外，也有醫(yī)家認(rèn)為影響潰瘍不愈的局部因素還有“瘀”。如陳實(shí)功《外科正宗》[9]中記載“化瘀腐，方可得愈”的論述。因此對(duì)于慢性潰瘍治療，離不開(kāi)祛腐和生肌，祛腐中蘊(yùn)含活血，即祛腐活血是前提，生肌是根本。

我們?cè)陟罡》街羞\(yùn)用當(dāng)歸、乳香、血竭活血化瘀，其目的在于改善血液循環(huán)，擴(kuò)張血管，促進(jìn)被破壞組織的修復(fù)及重建正常生理功能[10]，另可加用補(bǔ)氣藥黃芪，以達(dá)氣能生血、氣能行血之效，且黃芪能抑制細(xì)胞增殖作用，改善血供，提高內(nèi)皮細(xì)胞表面整合素活性，加速創(chuàng)面愈合[11]。本研究中，與對(duì)照組比較，祛腐生肌方組第5d雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但創(chuàng)面愈合率優(yōu)于對(duì)照組，且隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，第10、15d創(chuàng)面愈合率明顯優(yōu)于對(duì)照組，提示祛腐生肌方能加速潰瘍傷口的愈合。

對(duì)于慢性潰瘍患者而言，其中醫(yī)辨證多屬陰證、虛證，屬瘡瘍的陰中之陰證[12]，患者免疫功能多低下。而瘡面愈合是一發(fā)展過(guò)程，其中炎癥反應(yīng)是瘡面愈合的初始階段。在此期，若傷口能適當(dāng)分泌炎癥因子，可加強(qiáng)創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，有助于壞死組織的清理，為新生肉芽組織的生長(zhǎng)提供支持，即體現(xiàn)既祛腐又生肌的作用[13]。此次研究結(jié)果顯示，祛腐生肌方組早期就可發(fā)揮對(duì)創(chuàng)面的促炎作用，提高IL-1和TNF-α水平，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，刺激瘡面四周上皮的生長(zhǎng)，發(fā)揮生肌作用。其原因可能與方中黃芪、當(dāng)歸所含的多糖能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞因子基因表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[14]。祛腐生肌方組在后期IL-1和TNF-α表達(dá)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與瘡面愈合后期主要和基質(zhì)形成和重塑期有關(guān)。

膠原在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中起重要作用。HyP是膠原合成的重要原料，它能間接反映膠原的含量，是較好的創(chuàng)面評(píng)價(jià)指標(biāo)。從本次中祛腐生肌方組在5、10、15d能明顯提高傷口肉芽組織中HyP含量，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其作用可能與方中冰片增加肉芽組織結(jié)構(gòu)和表皮細(xì)胞再生，修復(fù)皮膚附屬器官，黃芪多糖膠原可提高組織中Hyp含量，促進(jìn)膠原合成及肉芽生長(zhǎng)，血竭能改善創(chuàng)面肉芽結(jié)構(gòu)和膠原排列方式有關(guān)[15]。

綜上，祛腐生肌方能促進(jìn)慢性皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合，其作用機(jī)制可能與改善炎癥狀態(tài)、增加創(chuàng)面膠原蛋白，提高局部微循環(huán)有關(guān)，然其作用途徑仍有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]安波,李勇,范立僑,等.無(wú)機(jī)活性元素對(duì)大鼠慢性潰瘍組織乏氧誘導(dǎo)因子-1α及細(xì)胞因子的影響及機(jī)制[J].河北醫(yī)藥,2012,34(6):805-807.

[2]馬拴全,劉梅杰.創(chuàng)愈膏對(duì)大鼠體表潰瘍創(chuàng)面轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的作用[J]. 中醫(yī)學(xué)報(bào),2014,34(6):805-807.

[3]張朝暉,徐強(qiáng).李競(jìng)教授祛腐生肌理論在瘡瘍?cè)\治中的應(yīng)用[J].湖南中醫(yī)雜志,2011,27(5):30-31.

[4]張旭輝,董建勛,李健.等,回陽(yáng)生肌方藥對(duì)慢性皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合及炎癥因子的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(3):170-173.

[5]張美吉.回陽(yáng)生肌脂質(zhì)體凝膠促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性大鼠慢性皮膚潰瘍愈合機(jī)制探討[D].北京： 北京中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[6]張?jiān)平?中醫(yī)藥治療慢性皮膚潰瘍研究概況[J].山東中醫(yī)雜志,2014,33(12) 1040-1042.

[7]柏志玉,王粵湘,彭錦繡,等.拔毒生肌膏治療慢性皮膚潰瘍療效觀察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014, 23(6):641-643.

[8]明·李梃撰,金嫣莉,何源.喬站兵校注.醫(yī)學(xué)入門[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,1995:46.

[9]明·陳實(shí)功.外科正宗[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1964:247.

[10]韓曉明,孫加洪,李明宏,等.瘡愈速治療慢性皮膚潰瘍的臨床研究[J].新中醫(yī),2008,40(1):27-28.

[11]朱瑾波,李玉鼎,李玉書(shū),等.黃芪治療慢性皮膚潰瘍對(duì)血管生成過(guò)程的機(jī)制研究[J].河北中醫(yī),1996,18(4):21-22.

[12]董建勛,路廣林,張美吉,等.回陽(yáng)生肌脂質(zhì)體凝膠促進(jìn)慢性皮膚潰瘍愈合的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(11):752-756.

[13]劉宸,章宏偉,徐寧,等.糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)變化[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2014,27(10):1033-1037.

[14]常娟,李應(yīng)東.黃芪、當(dāng)歸多糖促生細(xì)胞因子作用研究綜述[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2010,28(11):93-95.

[15]楊志光.復(fù)元活血湯聯(lián)合生肌玉紅膏治療糖尿病足的臨床觀察[J].陜西中醫(yī),2015,36(9):1176-1177.

(收稿2016-01-08；修回2016-02-25)

通訊作者：△廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院(清遠(yuǎn) 511518)

【中圖分類號(hào)】R364.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.06.047

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81401996)

廣東省自然科學(xué)基金(2015A030310099)

吳階平醫(yī)學(xué)基金(320.6750.14139)