新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓與KCNMB1基因多態(tài)性的關(guān)系

王立杰，張文雯，錢燕飛，張 亮，趙 磊，馬克濤，李 麗，司軍強(qiáng)

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆石河子 832002)

?

新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓與KCNMB1基因多態(tài)性的關(guān)系

王立杰，張文雯，錢燕飛，張 亮，趙 磊，馬克濤，李 麗，司軍強(qiáng)

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆石河子 832002)

目的 探討新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓與大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance Ca2+-activated potassium channel, BKCa)KCNMB1基因多態(tài)性位點rs11739136的相關(guān)性。方法 分別提取原發(fā)性高血壓組(essential hypertension group, EH,n=277)和正常組(normotensive group, NT,n=247)血液中的基因組DNA，運(yùn)用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技術(shù)檢測KCNMB1-rs11739136多態(tài)性位點的基因型。應(yīng)用非條件Logistic回歸分析新疆哈薩克族高血壓相關(guān)危險因素。結(jié)果 非條件Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，KCNMB1-rs11739136位點基因型、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)和總膽固醇等與高血壓無關(guān)聯(lián)；體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)和甘油三酯是影響高血壓的危險因素。新疆哈薩克族人群中普遍存在KCNMB1-rs11739136位點的基因多態(tài)性(P>0.05)。在EH組該位點CC、CT、TT基因型頻率及C、T等位基因頻率分別為74.00%、23.83%、2.17%、85.92%、14.08%，與NT組相比較，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 KCNMB1基因rs11739136多態(tài)性位點可能與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓無關(guān)聯(lián)。

高血壓；大電導(dǎo)鈣激活鉀通道；KCNMB1；哈薩克族

原發(fā)性高血壓(essential hypertension, EH)是由遺傳和環(huán)境因素共同影響形成的，它不僅是一種病，而且還是心血管疾病最常見的危險因素。EH的基本病理生理機(jī)制是阻力動脈的血管張力持續(xù)增加。然而控制血管緊張性的一個主要因素就是大電導(dǎo)鈣激活的鉀通道(large-conductance Ca2+-activated potassium channel, BKCa)。BKCa是由離子介導(dǎo)的α亞基和不同的β亞基構(gòu)成，β1亞基主要表達(dá)于平滑肌細(xì)胞并影響其特性。有研究表明，編碼β1亞基的KCNMB1基因突變與心率變異和壓力反射功能相關(guān)聯(lián)[1]。KELLEY等[2]研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，KCNMB1基因多態(tài)性位點rs11739136(E65K)變異降低動脈血管阻抗。因此，KCNMB1基因多態(tài)性在高血壓的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的作用。近來流行病學(xué)調(diào)查顯示，新疆哈薩克族人群是高血壓病的高發(fā)人群[3]，故本研究選取遺傳異質(zhì)性較小的新疆哈薩克族人群為對象，從基因水平探討B(tài)KCa遺傳變異是否與新疆哈薩克族人群EH相關(guān)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以新疆沙灣博爾通古鄉(xiāng)的哈薩克族人群為研究對象，高血壓診斷參照《中國高血壓防治指南2010》，以病例對照研究的方法按照相關(guān)納入標(biāo)準(zhǔn)分別選取277例高血壓患者(EH組)，年齡(46.97±8.46)歲；247例血壓正常者(NT組)，年齡(45.35±8.71)歲。各研究對象之間無血緣關(guān)系，且所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA 采用DNA提取試劑盒提取血液基因組DNA，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，并通過紫外分光光度計鑒定產(chǎn)物純度。

1.2.2 引物設(shè)計 應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由于KCNMB1-rs11739136多態(tài)性位點沒有適宜的限制性內(nèi)切酶，故本研究在上游引物第27個堿基處設(shè)置了錯配堿基，以便于引入限制性內(nèi)切酶識別位點。引物序列為，上游引物：5′-GGTACTGGGGCACCTTCTTGCACTTCCGCT-3′，下游引物：5′-CGGGGACTGTGGGGTCATGTGCCTTT-3′，由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和限制性酶切 所有PCR反應(yīng)體系均為25 μL，具體包含上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，DNA模板3 μL(10 ng/μL)，DNase/RNase-free去離子水8.5 μL，PCR Master Mix 12.5 μL。PCR反應(yīng)條件滿足95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共36個循環(huán)，最終72 ℃充分延伸10 min。30 μL的酶切體系包含限制性內(nèi)切酶MbiI 1 μL，10×buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，DNase/RNase-free 去離子水17 μL，混勻后37 ℃孵育12 h。PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物分別經(jīng)20 g/L、25 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像儀成像加以鑒定[4]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用χ2檢驗進(jìn)行組間頻率的比較；計算各組等位基因頻率及基因型頻率，進(jìn)一步確認(rèn)是否符合Hardy-Weinberg平衡；用非條件Logistic回歸分析計算OR值及95%CI，并分析高血壓相關(guān)危險因素。P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組基本特性的比較

EH組和NT組的年齡、總膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。收縮壓、舒張壓、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、甘油三酯在兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。而且除了HDL指標(biāo)外，EH組其余相關(guān)指標(biāo)平均水平明顯高于NT組(表1)。

表1 兩組基本特征的比較

項目EH組(n=277)NT組(n=247)t值P值年齡(歲)47.15±8.7145.82±9.261.6940.091收縮壓(mmHg)149.65±18.40117.20±11.3624.5750.000*舒張壓(mmHg)95.22±11.4375.24±7.3324.0700.000*身高(cm)163.23±8.20161.37±10.702.2560.025*體質(zhì)量(kg)69.75±13.4966.29±14.462.8300.005*BMI(kg/m2)26.13±4.4425.09±4.092.7570.006*甘油三酯(mmol/L)1.36±0.901.21±0.761.9820.048*總膽固醇(mmol/L)4.70±1.254.57±1.041.2950.196LDL(mmol/L)2.31±0.782.25±0.700.8510.395HDL(mmol/L)1.54±0.511.56±0.46-0.4180.674

體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)，低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)，高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)；EH組與NT組相比較，*P<0.05。

2.2 高血壓相關(guān)危險因素的分析

以是否患有高血壓作為因變量，年齡、BMI、HDL、LDL和基因型等因素作為自變量進(jìn)行非條件Logistic回歸分析，結(jié)果表明，KCNMB1-rs11739136位點基因型、年齡、性別、體質(zhì)量、LDL、HDL和總膽固醇與高血壓無相關(guān)性；BMI(OR=1.061，95%CI：1.018～1.106)和甘油三酯(OR=1.251，95%CI：1.001～1.563)是影響高血壓的危險因素(表2)。

表2 新疆哈薩克族EH多因素Logistic回歸分析

Tab.2 The multivariate logistic regression analysis of EH in Xinjiang Kazakh

因素BSEWaldsP值OR值95%CIBMI0.0590.0217.9220.0051.0611.018～1.106甘油三酯0.2240.1143.8830.0491.2511.001～1.563

2.3 PCR及酶切產(chǎn)物的電泳分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增片段分子量為256 bp(圖1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶MbiⅠ酶切后獲得3種基因型：TT型(256 bp)、CC型(228 bp、28 bp)及CT型(256 bp、228 bp、28 bp)。由于28 bp分子量相對較小，結(jié)果未能顯示(圖2)。PCR產(chǎn)物經(jīng)反向測序驗證與酶切分型結(jié)果一致(圖3)。

圖1 KCNMB1-rs11739136 PCR產(chǎn)物的電泳圖

Fig.1 PCR products electrophoresis of rs11739136 polymorphism of KCNMB1
M：Marker；1～4：樣本。

圖2 KCNMB1(rs11739136)PCR產(chǎn)物MbiⅠ酶切圖

Fig.2 PCR products of rs11739136 polymorphism of KCNMB1 was digested by MbiI enzyme
M：Marker；1、5：TT型；2、6：CC型；3、4：CT型。

圖3 擴(kuò)增產(chǎn)物反向測序結(jié)果

Fig.3 Reverse sequence chromatograms of PCR products

2.4 基因型分布

KCNMB1基因多態(tài)性位點rs11739136基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，具有群體代表性(P>0.05)。EH組CC、CT和TT基因型頻率分別為74.00%、23.83%、2.17%，與NT組相比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。EH組等位基因C、T頻率分別是85.92%、14.08%，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，表3)。

表3 KCNMB1基因多態(tài)位點rs11739136的基因型分布

Tab.3 Genotypes distribution of rs11739136 polymorphism of KCNMB1

基因EH組(n=277)NT組(n=247)P值χ2值OR值95%CI基因型 CC205(74.00%)177(71.66%) CT66(23.83%)60(24.29%)0.8020.0630.9500.635～1.422 TT 6(2.17%)10(4.05%)0.2041.6110.5180.185～1.454等位基因 C476(85.92%)414(83.81%) T78(14.08%)80(16.19%)0.3400.9120.8480.604～1.190

3 討 論

血管張力的調(diào)節(jié)主要依賴于血管平滑肌細(xì)胞離子通道的活動。目前已證實，廣泛分布于平滑肌組織中的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)在維持膜電位及調(diào)節(jié)肌緊張等生理過程中發(fā)揮著重要的作用[5]。血管平滑肌上的BKCa主要由成孔的α亞基和調(diào)節(jié)性β1亞基組成，其中β1亞基發(fā)揮重要的輔助調(diào)節(jié)效應(yīng)[6-7]。正常生理狀態(tài)下，β1亞單位與細(xì)胞內(nèi)局部鈣離子濃度升高偶聯(lián)來增加通道的活性，而引起細(xì)胞舒張[8]。

人類編碼BK通道β1亞基的基因(KCNMB1)定位于5q34，全長約11.5 kb。目前已經(jīng)證實，在KCNMB1第3外顯子處堿基A替換為堿基G，等同于蛋白E65K的突變。BKCa通道的功能改變對高血壓及心率不齊等多種心血管疾病發(fā)揮著調(diào)控作用[9-10]。

大量研究表明，由于β1亞基的下調(diào)或缺失，引起B(yǎng)KCa通道開放概率以及產(chǎn)生的瞬時外向鉀電流均降低，使得BKCa通道負(fù)反饋抑制作用降低，從而引發(fā)細(xì)胞膜去極化，血管平滑肌收縮，致使血壓升高[11]。FERNANDEZ等[12]關(guān)于基因KCNMB1-E65K變異與高血壓之間的相關(guān)分析，顯示β1E65K突變導(dǎo)致BK通道對鈣離子的敏感性增加，使得血管更易于舒張從而得出β1E65K通道對血管平滑肌收縮性起負(fù)反饋作用，而且此作用與K等位基因?qū)Φ褪鎻垑旱谋Ｗo(hù)作用一致。SENT等[13]表明55歲以上的女性K等位基因攜帶者患中度以上舒張壓增高的危險性相對較低。此外，NIELSEN等[14]研究不僅證實K等位基因?qū)κ鎻垑河斜Ｗo(hù)效應(yīng)，而且還驗證了K等位基因攜帶者的收縮壓明顯低于未攜帶者。同時，ZHAO等[15]研究進(jìn)一步表明K等位基因攜帶者作為保護(hù)因素降低中國人群高血壓的患病率。這些結(jié)果提示，KCNMB1基因多態(tài)性與高血壓的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。

本研究以遺傳異質(zhì)性小的新疆哈薩克族人群為研究對象，探討KCNMB1基因多態(tài)性與新疆哈薩克族人群EH的關(guān)聯(lián)。本文對新疆哈薩克族高血壓相關(guān)危險因素分析，顯示KCNMB1-rs11739136位點基因型與高血壓無相關(guān)性，而BMI和甘油三酯作為危險因素影響高血壓。該位點基因型分布結(jié)果表明，EH組與NT組基因型(CC、CT+TT)及等位基因(C、T)頻率分布無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。該現(xiàn)象與KOKUBO等[16]關(guān)于KCNMB1基因變異與日本人群高血壓的相關(guān)研究結(jié)果一致，但與上述K等位基因?qū)κ鎻埰诟哐獕旱谋Ｗo(hù)作用不相符[12-14]。存在相互矛盾的原因可能是：①EH是多基因、多因素的復(fù)雜性疾病，KCNMB1基因rs11739136多態(tài)性位點可能只作為微效位點發(fā)揮效應(yīng)；②樣本量相對較?。虎鄯N族地區(qū)差異。因此，需要更多、更大的樣本來驗證這一基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。

綜上所述，KCNMB1基因多態(tài)性位點rs11739136與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓可能無關(guān)聯(lián)。

[1] GOLLASCH M, ANK J, LUFT FC, et al. The BK channel beta1 subunit gene (KCNMB1) is associated with human baroreflex and blood pressure regulation[J]. Hypertension, 2002, 20(5):927-933.

[2] KELLEY-HEDGEPETH A, PETER I, MONTEFUSCO MC, et al. The KCNMB1 E65K variant is associated with reduced central pulse pressure in the community-based Framingham Offspring Cohort[J]. Hypertension, 2009, 27(1):55-60.

[3] 馬曉佳，張眉，郭淑霞. 新疆農(nóng)村地區(qū)維吾爾族、哈薩克族與漢族人群高血壓患病率[J]. 中華高血壓雜志, 2013, 21(12):1164-1168.

[4] 張文雯，石文艷，劉衛(wèi)東，等. 新疆哈薩克族人群縫隙連接蛋白40基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)系[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 30(11):1783-1785.

[5] LORCA RA, STAMNES SJ, PILLAI MK, et al. Pillai MK N-terminal isoforms of the large-conductance Ca2+-activated K+channel are differentially modulated by the auxiliary β1-subunit[J]. J Biol Chem, 2014, 289(14):10095-10103.

[6] CASTILLO K, CONTRERAS GF, PUPO A, et al. Molecular mechanism underlying β1 regulation in voltage- and calcium-activated potassium (BK) channels[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(15):4809-4814.

[7] GRUSLOVA A, SEMENOV I, WANG B. An extracellular domain of the accessory β1 subunit is required for modulating BK channel voltage sensor and gate[J]. J Gen Physiol, 2012, 139(1):57-67.

[8] SWEET TB, COX DH. Measuring the influence of the BKCa beta1 subunit on Ca2+binding to the BKCa channel[J]. J Gen Physiol, 2009, 133(2):139-150.

[9] SAKAMOTO K, OHYA S, MURAKI K, et al. A novel opener of large-conductance Ca2+-activated K+(BK) channel reduces ischemic injury in rat cardiac myocytes by activating mitochondrial K(Ca) channel[J]. J Pharmacol Sci, 2008, 108(1):135-139.

[10] TOMAS M, VAZQUEZ E, FERNANDEZ-FERNANDEZ JM, et al. Genetic variation in the KCNMA1 potassium channel alpha subunit as risk factor for severe essential hypertension and myocardial infarction[J]. J Hypertens, 2008, 26(11):2147-2153.

[11] YOLIMA PT, MORERA FJ, CARVACHO I, et al. A marriage of convenience: beta-subunits and voltage-dependent K+channels[J]. J BioChem, 2007, 282(34):24485-24489.

[12] FERNANDEZ-FERNANDEZ JM, TOMAS M, VAZQUEZ E, et al. Gain-of-function mutation in the KCNMB1 potassium channel subunit is associated with low prevalence of diastolic hypertension[J]. J Clin Investi, 2004, 113(7):1032-1039.

[13] SENT M, FERNANDEZ-FERNANDEZ JM, TOMS M, et al. Protective effect of the KCNMB1 E65K genetic polymorphism against diastolic hypertension in aging women and its relevance to cardiovascular risk[J]. Circ Res, 2005, 97(12):1360-1365.

[14] NIELSEN T, BURGDORF KS, GRARUP N, et al. The KCNMB1 Glu65Lys polymorphism associates with reduced systolic and diastolic blood pressure in the Inter99 study of 5729 Danes[J]. J Hypertens, 2008, (11):2142-2146.

[15] ZHAO Q, WANG L, YANG W, et al. Interactions among genetic variants from contractile pathway of vascular smooth muscle cell in essential hypertension susceptibility of Chinese Han population[J]. Pharmacogenet Genomics, 2008, 18(6):459-466.

[16] KOKUBO Y, IWAI N, TAGO N, et al. Association analysis between hypertension and CYBA, CLCNKB, and KCNMB1 functional polymorphisms in the Japanese population the Suita-Study[J]. Circ J, 2005, 69(2):138-142.

(編輯 卓選鵬)

Association between KCNMB1 polymorphism and essential hypertension in Xinjiang Kazak population

WANG Li-jie, ZHANG Wen-wen, QIAN Yan-fei, ZHANG Liang,ZHAO Lei, MA Ke-tao, LI Li, SI Jun-qiang

(Department ofPhysiology, School of Medicine of Shihezi University; Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease of Ministry of Education, Shihezi 832002, China)

Objective To explore the correlation between the single nucleotide polymorphism of large-conductance Ca2+-activated potassium channel (BKCa)-rs11739136 and essential hypertension in Xinjiang Kazak population. Methods Genomic DNA was extracted from the blood of essential hypertension group (EH group,n=277) and normal group (NT group,n=247), respectively. The polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was used to detect genotypes of rs11739136 polymorphism of KCNMB1. The unconditional logistic regression analysis was used to evaluate the risk factors associated with Xinjiang Kazak hypertension. Results The unconditional logistic regression analysis showed that KCNMB1-rs11739136 genotypes, high-density lipoprotein ( HDL), low-density lipoprotein (LDL) and cholesterol were not associated with hypertension, while body mass index (BMI) and triglyceride were risk factors for hypertension. KCNMB-rs11739136 polymorphism existed extensively in Xinjiang Kazakh population (P>0.05). The frequencies of CC, CT, TT genotypes and those of alleles C and T were 74.00%, 23.83%, 2.17%, 85.92%, 14.08% in EH group, respectively. NT and EH groups did not significantly differ (P>0.05). Conclusion The rs11739136 polymorphism of KCNMB1 may not be related to essential hypertension in Xinjiang Kazak population.

hypertension; large-conductance Ca2+-activated potassium channel; KCNMB1; Kazak

2015-05-10

2015-08-20

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(973計劃項目)(No.2012CB26600)；兵團(tuán)博士基金項目(No.2010JC16)；兵團(tuán)醫(yī)藥專項(No.2012BA021) Supported by the National Key Basic Research Program (973 Program) (No.2012CB26600), Corps Doctor Foundation (No.2010JC16), and Corps Special Medicine of China (No.2012BA021).

司軍強(qiáng). E-mail: sijunqiang@shzu.edu.cn

R181.3+3

A

10.7652/jdyxb201601015

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.r.20151210.1001.002.html(2015-12-10)