復(fù)方丹參滴丸對(duì)大鼠糖尿病腎病早期的腎臟保護(hù)及作用機(jī)制

路萬(wàn)虹，張曉田，成少利，施秉銀

(西安交通大學(xué)：1. 第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科；2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西西安 710061)

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復(fù)方丹參滴丸對(duì)大鼠糖尿病腎病早期的腎臟保護(hù)及作用機(jī)制

路萬(wàn)虹1，張曉田2，成少利2，施秉銀3

(西安交通大學(xué)：1. 第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科；2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西西安 710061)

目的 探討復(fù)方丹參滴丸對(duì)早期糖尿病腎病的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法 腹腔注射鏈脲佐菌素建立高血糖大鼠動(dòng)物模型。造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、復(fù)方丹參組以及厄貝沙坦組，分別給予蒸餾水、復(fù)方丹參滴丸及厄貝沙坦灌胃。另設(shè)正常對(duì)照組以同體積蒸餾水灌胃。測(cè)定尿白蛋白、血肌酐及血糖；腎臟組織行PAS、Masson染色，電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)，免疫組化檢測(cè)腎組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)。結(jié)果 復(fù)方丹參滴丸大劑量時(shí)可減少尿白蛋白排泄率、減輕腎臟的病理變化。降低腎小球VEGF、CTGF、MCP-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)論 復(fù)方丹參滴丸能有效改善糖尿病所致的腎臟損害，其保護(hù)作用可能與降低生長(zhǎng)因子和炎癥因子有關(guān)。

復(fù)方丹參滴丸；糖尿病腎??；尿白蛋白排泄率；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1

我國(guó)20歲以上人群中，糖尿病及糖尿病前期的發(fā)病率高達(dá)9.7%及15.5%[1]。糖尿病腎病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一。DKD的發(fā)生發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果，各種生長(zhǎng)因子、炎癥趨化因子以及細(xì)胞通路間的交互作用尤為重要。無(wú)論是1型還是2型糖尿病，其腎臟損害相似[2]，累及腎臟實(shí)質(zhì)和間質(zhì)各種細(xì)胞。DKD的病理生理改變?yōu)槟I小球高濾過(guò)、微量白蛋白尿(microalbuminuria, MAU)以及隨之而發(fā)生的腎功能惡化。這種病理生理過(guò)程與腎小球、腎小管間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)功能紊亂相關(guān)[3]。早中期DKD的病理改變包括腎小球肥大、基底膜輕度增厚、系膜基質(zhì)輕度增寬，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性及顆粒變性，腎間質(zhì)及小動(dòng)脈尚無(wú)明顯病變；隨著疾病進(jìn)展，進(jìn)而出現(xiàn)腎小球硬化，腎小管間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮等間質(zhì)改變[4]。通過(guò)治療可延緩和逆轉(zhuǎn)腎臟病理改變并改善腎功能異常指標(biāo)。本研究探討復(fù)方丹參滴丸治療DKD對(duì)腎功能的改善和腎臟病理改變的延緩及逆轉(zhuǎn)作用以及可能的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 糖尿病模型造模與分組

SD大鼠造模按照60 mg/kg一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，1周時(shí)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，即為糖尿病模型造模成功[5-6]；糖尿病模型大鼠應(yīng)用長(zhǎng)效胰島素皮下注射，控制血糖于20～27 mmol/L之間。

常規(guī)喂養(yǎng)12周開始分組干預(yù)，至第24周末。模型大鼠隨機(jī)分為3組：糖尿病對(duì)照組(DC組，n=10)每日給予蒸餾水灌胃；復(fù)方丹參滴丸組(CDDP組，n=10)，500 mg/(kg·d)復(fù)方丹參滴丸灌胃；厄貝沙坦組(IRS組，n=10)，50 mg/(kg·d)厄貝沙坦灌胃。另外，設(shè)立正常對(duì)照組大鼠(NC組，n=10)，每日給予相應(yīng)體積的蒸餾水灌胃。

1.2 標(biāo)本的留取

于實(shí)驗(yàn)干預(yù)起點(diǎn)及24周末，收集各組大鼠尿液并記錄24 h尿量。腹腔注射100 g/L水合氯醛(0.3～0.4 mL/100 g體質(zhì)量)麻醉，經(jīng)心臟取血留存。迅速摘除兩側(cè)腎臟，分別進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察和各種染色。

1.3 生化指標(biāo)檢測(cè)

留取的血標(biāo)本用于測(cè)定血糖和腎功指標(biāo)；尿標(biāo)本用于測(cè)定24 h尿微量白蛋白排泄率(放射免疫法)。尿微量白蛋白排泄率(UAER)變化倍數(shù)：藥物干預(yù)及觀察終點(diǎn)(24周)及起點(diǎn)(12周)UAER的比值(UAER24周/UAER12周)。

1.4 腎組織標(biāo)本處理與電鏡檢測(cè)及各種染色

將左腎上極取4～5塊1 mm3組織置于25 mL/L戊二醛固定液固定，常規(guī)制作超薄切片，用于電子顯微鏡檢查。

左腎其余部分經(jīng)橫斷面切開后置于乙醇-甲醛-醋酸固定液固定，分別用于常規(guī)PAS、Masson，并同時(shí)進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)蛋白表達(dá)。免疫組化染色具體步驟為，組織石蠟切片常規(guī)脫蠟后，采用30 mL/L H2O2封閉，微波熱修復(fù)抗原10 min。羊血清于37 ℃恒溫封閉1 h后，依次滴加一抗(1∶500稀釋)，4 ℃過(guò)夜，以PBS漂洗，再滴加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶500稀釋)恒溫孵育，然后經(jīng)DAB 顯色和蘇木素復(fù)染，于顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 圖像分析及數(shù)據(jù)測(cè)定

1.5.1 腎小球基底膜厚度測(cè)定及腎小球面積計(jì)算 在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠中隨機(jī)選擇2只大鼠腎組織進(jìn)行電子顯微鏡觀察及照像，每只大鼠選取相互不重疊的15個(gè)視野，通過(guò)圖像分析系統(tǒng)，測(cè)定腎小球基底膜厚度，每組取其平均值。在每例切片中尋找并選擇血管極和尿極均切到的腎小球，計(jì)算出所選腎小球的相對(duì)面積(μm2)，每組取其平均值。

1.5.2 腎小球系膜區(qū)面積計(jì)算 PAS染色中，每例腎組織切片在高倍鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)腎小球，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)選擇PAS陽(yáng)性物質(zhì)的紅染區(qū)域，計(jì)算腎小球系膜及基底膜面積所占腎小球球叢總面積的百分比，每組取其平均值。

1.5.3 腎間質(zhì)膠原纖維組織面積計(jì)算 Masson染色中，每例切片低倍鏡下(×100)隨機(jī)觀察10個(gè)相互不重疊的腎小管區(qū)域視野，計(jì)算腎間質(zhì)膠原纖維組織面積占整個(gè)視野的百分比，每組取其平均值。

1.5.4 免疫組化結(jié)果半定量分析 每張切片隨機(jī)選5 個(gè)含腎小球的不重復(fù)視野(×400)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)測(cè)定并計(jì)算陽(yáng)性染色累積吸光度(IA)值和陽(yáng)性染色的面積(area)，分別取其平均值進(jìn)行分析，蛋白相對(duì)量以平均吸光度(IA/area)表示。

以上測(cè)量均在Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)照像并計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 造模結(jié)果

共196只大鼠STZ腹腔注射進(jìn)行糖尿病造模，其中143只造模大鼠在1周時(shí)血糖≥16.7 mmol/L確定為造模成功，成功率73.0%。實(shí)驗(yàn)24周結(jié)束時(shí)，DC組死亡2只，剩余8只；CDDP組死亡1只，剩余9只；IRS組死亡2只，剩余8只，NC組無(wú)死亡，為10只。

2.2 血糖、尿素氮和肌酐的檢測(cè)結(jié)果

第24周末，監(jiān)測(cè)NC組大鼠血糖為(5.88±0.37)mmol/L，DC組、CDDP組、IRS組大鼠的血糖較NC組大鼠均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；后3組大鼠均需應(yīng)用胰島素皮下注射控制血糖于20～27 mmol/L，3組間血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.932)。

與NC組相比，DC組與IRS組的血清尿素氮水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而CDDP組血清尿素氮較NC組有所上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.150)；CDDP組血清肌酐水平較NC組有顯著下降(P<0.01)，較DC組也明顯下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.3 尿UAER的變化及比較

第12周時(shí)，各干預(yù)組及模型組UAER水平較NC組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各干預(yù)組及模型組大鼠組間UAER水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至24周時(shí)，各干預(yù)組及模型組大鼠UAER明顯升高，UAER變化倍數(shù)均較NC組有明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。組間比較結(jié)果顯示，DC組大鼠UAER上升程度最為顯著，而CDDP組與IRS組UAER雖仍有明顯上升，但其升高程度顯著低于DC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；3組中以IRS組的上升程度較小，CDDP組次之，這兩組間的UAER變化倍數(shù)未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.357，表2)。

表1 各組大鼠24周時(shí)血糖、血尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)的比較

Tab.1 Comparison of BS, BUN and SCr at week 24 in different groups

組別血糖(mmol/L)BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)正常對(duì)照組5.88±0.377.35±0.6871.30±8.46糖尿病組25.37±3.24*10.03±0.76*70.25±10.55復(fù)方丹參滴丸組24.95±5.95*8.08±1.0452.34±8.36#△厄貝沙坦組26.40±4.91*10.63±0.62*62.65±6.25

與正常對(duì)照組比較，*P<0.0001；與正常對(duì)照組比較，#P=0.002；與糖尿病組比較，△P=0.025。

表2 各組尿微量白蛋白排泄率的比較

Tab.2 Comparison of UAER between different groups

組別UAER(mg/24h,Median,25per,75per)12周24周UAER變化倍數(shù)(x±s)正常對(duì)照組(NC)0.1505,0.1132,0.17570.1702,0.1167,0.19281.14±0.39糖尿病組(DC)0.7411*,0.3354,0.54793.4437*,1.6279,5.44774.25±1.78**復(fù)方丹參滴丸組(CDDP)0.7951*,0.5133,1.10162.2822*,0.9579,2.84962.45±0.82##△厄貝沙坦組(IRS)0.7803*,0.4354,1.25221.1709*,0.8761,2.32441.87±0.48#△

DC、CDDP、IRSvs. NC，*P=0.006；DCvs. NC，**P=0.0001；IRSvs. NC，#P=0.024；CDDPvs. NC，##P=0.010；CDDPvs. DC，△P<0.01,P=0.008；IRSvs. DC，P=0.001。

2.4 腎臟超微病理改變

DC組大鼠腎臟基質(zhì)增多，基底膜增厚。足細(xì)胞腫脹，足突融合、脫落。腎小管管腔縮小。IRS組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)尚可，基質(zhì)輕度增多，基底膜輕度增厚。足細(xì)胞可見(jiàn)部分足突融合現(xiàn)象。腎小管管腔開放良好。CDDP組大鼠腎基質(zhì)有所增多，基底膜節(jié)段性增厚。足細(xì)胞易見(jiàn)足突融合現(xiàn)象，較IRS組明顯。腎小管管腔開放良好(圖1)。

圖1 各組大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化

Fig.1 The ultrastructure of rat kidney in different groups
A：正常對(duì)照組；B：糖尿病組；C：復(fù)方丹參滴丸組；D：厄貝沙坦組。

2.5 光鏡下腎臟病理改變

觀察24周后，可見(jiàn)NC組大鼠腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管管腔開放良好；DC組大鼠腎臟毛細(xì)血管腔形態(tài)不規(guī)則、開放減少，系膜細(xì)胞數(shù)局部增多、系膜區(qū)基質(zhì)明顯增寬、基底膜明顯增厚；CDDP組、IRS組與DC組相比，系膜細(xì)胞增生及基質(zhì)增寬程度減少，但與NC組大鼠相比仍有所增多。PAS染色結(jié)果顯示NC組大鼠腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，小球毛細(xì)血管腔開放良好，系膜區(qū)不寬，系膜細(xì)胞數(shù)1～2個(gè)，偶見(jiàn)局部系膜細(xì)胞增生表現(xiàn)，腎小管排列整齊，管腔通暢；DC組大鼠腎臟毛細(xì)血管腔不規(guī)則、開放減少，系膜細(xì)胞明顯增多、系膜區(qū)明顯增寬、PAS陽(yáng)性物質(zhì)沉積明顯增加，基底膜增厚；CDDP組、IRS組與DC組相比系膜細(xì)胞增生減少，PAS陽(yáng)性物質(zhì)的沉積也減少，但與NC組大鼠相比仍增多。Masson染色結(jié)果顯示各組大鼠間質(zhì)腎小管排列整齊，間質(zhì)膠原纖維有所增多，未見(jiàn)明顯的腎小管萎縮、擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等改變(圖2)。

圖2 各組大鼠腎臟PAS染色和Masson染色的比較

Fig.2 Comparison of PAS- and Masson-stained renal structures in different groups
標(biāo)尺：腎小球(PAS染色)100 μm，間質(zhì)(Masson染色)200 μm。

2.6 腎小球基底膜厚度、腎小球面積及腎小管間質(zhì)膠原纖維的變化

與NC組大鼠基底膜厚度(256.99±17.55)nm相比，模型及各干預(yù)組均顯著增厚(P<0.01)；IRS組為(306.30±32.67)nm，增厚程度較小，CDDP組次之，為(356.32±45.45)nm，DC組增厚程度最為明顯，為(456.63±95.18)nm；IRS和CDDP組基底膜增厚程度較DC組明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；IRS組與CDDP組相比，IRS組基底膜增厚程度更小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

IRS組[(10 859.18±872.66)μm3]大鼠的腎小球橫斷面積與NC組[(10 818.80±803.46)μm3]相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，DC組[(11 768.43±841.55)μm3]及CDDP組[(12 358.79±989.62)μm3]腎小球面積較NC組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.006，0.000，即P<0.01)。與DC組相比，IRS組腎小球面積有明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045，即P<0.05)，CDDP組較DC組腎小球面積稍大，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

糖尿病及各干預(yù)組大鼠的腎小管間質(zhì)膠原纖維面積比例均較NC組[(7.18±1.67)%]明顯增多(P<0.01)，DC組[(15.86±4.04)%]大鼠膠原纖維增加的程度最為明顯； IRS組[(11.55±2.34)%]膠原纖維比例與DC組相比減少，有明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IRS組對(duì)膠原纖維比例的改善也優(yōu)于CDDP組[(14.29±3.16)%](P<0.01)，CDDP組的膠原纖維比例較DC組有所減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.7 免疫組化結(jié)果

CTGF、MCP-1在近端腎小管、腎小球細(xì)胞胞質(zhì)中有表達(dá)。NC組大鼠的3個(gè)細(xì)胞因子在腎小球中表達(dá)水平較低，CTGF、MCP-1的表達(dá)很弱(圖3)。糖尿病及各干預(yù)組大鼠的腎小球VEGF、CTGF、MCP-1的表達(dá)水平與NC組相比均明顯增高，以DC組的增高程度最為顯著(P<0.01)。

與NC組比較，DC組、CDDP組的VEGF增高程度很明顯(P<0.01)，IRS組也有明顯增高，但程度稍低(P<0.05)；與DC組相比，IRS和CDDP的VEGF平均吸光度值顯著降低(P<0.05)，以IRS的降低更為明顯(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

與NC組比較，糖尿病及各干預(yù)組大鼠的CTGF均顯著增高，DC組的增高最明顯(P<0.01)；與DC組比較，IRS組和CDDP組CTGF水平有顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

與NC組相比，糖尿病及各干預(yù)組大鼠的MCP-1均顯著增高(P<0.01)，DC組的增高最明顯；與DC組相比，IRS組和CDDP組MCP-1的增高程度明顯降低，有顯著改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IRS組與CDDP組相比，3種細(xì)胞因子表達(dá)水平的改善以IRS組更顯著，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

圖3 各組大鼠腎臟VEGF、CTGF、MCP-1的表達(dá)變化

Fig.3 Expressions of VEGF, CTGF and MCP-1 in rat kidney of different groups (×400)

表3 糖尿病腎病相關(guān)細(xì)胞因子半定量分析結(jié)果(平均吸光度值IA)的比較

組別VEGFCTGFMCP-1正常對(duì)照組1.15±0.160.071±0.0480.112±0.053糖尿病組1.69±0.17**0.195±0.058**0.397±0.071**復(fù)方丹參滴丸組1.47±0.19**△0.141±0.051*△0.300±0.057**△△厄貝沙坦組1.31±0.13*△△0.128±0.061*△0.287±0.068**△△

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01；與糖尿病組比較，△P<0.05；△△P<0.01。

3 討 論

UAER是DKD發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo)，在很大程度上預(yù)示著DKD的進(jìn)展，即使是在正常范圍內(nèi)的增高變化(<30 mg/d)也仍然會(huì)增加進(jìn)展至晚期慢性腎臟病的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。本研究模型組大鼠均出現(xiàn)了UAER增加的早期DKD表現(xiàn)，可以用于早期DKD的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究各糖尿病大鼠的UAER呈進(jìn)行性增加，出現(xiàn)了DKD的早期表現(xiàn)，復(fù)方丹參滴丸干預(yù)后，雖然UAER仍有增加，但其增加的程度明顯低于DC組，說(shuō)明復(fù)方丹參滴丸具有延緩早期DKD進(jìn)展的作用。當(dāng)然，厄貝沙坦延緩UAER進(jìn)展的作用更為突出。有學(xué)者應(yīng)用復(fù)方丹參滴丸對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)，得到了相同的改善效果[9]。

從早期DKD大鼠的腎功變化來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)中各組大鼠的腎功能基本穩(wěn)定，均未出現(xiàn)腎功能不全現(xiàn)象。相比之下，CDDP組大鼠血肌酐水平顯著低于NC組，但這并不意味著對(duì)腎功能的改善，而提示可能CDDP干預(yù)組大鼠出現(xiàn)了腎小球高濾過(guò)狀態(tài)。DKD的早期改變表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率增加，腎小球體積增大，呈現(xiàn)高灌注、高濾過(guò)、高跨膜壓的“三高”狀態(tài)。本研究DC組大鼠腎小球面積增大，提示了這種高濾過(guò)的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)；IRS組的腎小球面積與NC組相當(dāng)，可能是厄貝沙坦的干預(yù)改善了早期DKD的高濾過(guò)改變。但確切的腎小球三高狀態(tài)仍需要通過(guò)微穿刺下球內(nèi)壓測(cè)定進(jìn)行證實(shí)。本研究CDDP組的腎小球面積也有所增大，且血肌酐水平較其他組有所下降，這提示腎小球可能存在高濾過(guò)的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，使肌酐、尿素氮等代謝產(chǎn)物的排泄增多。諸多研究提示復(fù)方丹參滴丸有改善心血管等微循環(huán)的作用，但對(duì)DKD微循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)的改善與腎臟的遠(yuǎn)期預(yù)后的作用還有待進(jìn)一步研究分析。

對(duì)腎小球及腎小管病理變化的比較顯示，DC組大鼠的腎小球系膜區(qū)面積比例和GBM厚度較正常組顯著增加；經(jīng)復(fù)方丹參滴丸及厄貝沙坦干預(yù)后的上述指標(biāo)仍較正常組明顯增加，但與DC組大鼠比較，其增加的程度有顯著改善；復(fù)方丹參滴丸對(duì)系膜區(qū)面積的改善作用與厄貝沙坦相當(dāng)，對(duì)GBM厚度的改善不及厄貝沙坦。這提示復(fù)方丹參滴丸對(duì)DKD腎小球細(xì)胞外基質(zhì)沉積有改善作用，可能是其延緩早期DKD進(jìn)展及降低微量白蛋白尿的病理基礎(chǔ)。

腎小管間質(zhì)膠原沉積同樣是DKD的主要病理改變之一，逐步進(jìn)展為間質(zhì)纖維化、小管萎縮，最終引起腎功衰竭。本研究中的模型組大鼠膠原纖維沉積比例僅有輕度變化，CDDP組的間質(zhì)膠原纖維比例與DC組相比有減少趨勢(shì)，但未見(jiàn)顯著改善，IRS組的改善作用顯著。

影響細(xì)胞損傷以及ECM沉積的因素多而復(fù)雜，其中各種細(xì)胞因子如生長(zhǎng)因子、炎癥因子的作用非常重要。VEGF在腎臟中主要由足細(xì)胞分泌，改變內(nèi)皮細(xì)胞的通透性調(diào)節(jié)和維持足細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)[10]。研究表明VEGF 在DKD發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[11]。從單純糖尿病、DKD到DKD合并腎衰竭患者的CTGF呈現(xiàn)顯著性逐漸升高趨勢(shì)[12]，說(shuō)明CTGF水平升高與DKD進(jìn)展密切相關(guān)。MCP-1趨化單核/巨噬細(xì)胞在腎組織浸潤(rùn)，與細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、腎小球的硬化密切相關(guān)[13]。本研究DKD對(duì)照組大鼠腎小球內(nèi)的生長(zhǎng)因子VEGF、CTGF及炎癥因子MCP-1的表達(dá)均顯著增高。復(fù)方丹參滴丸和厄貝沙坦干預(yù)后，雖然以上細(xì)胞因子的表達(dá)仍較NC組明顯增加，但與DKD大鼠相比，兩種藥物的治療性干預(yù)都顯著降低了VEGF、CTGF、MCP-1表達(dá)增加的程度。復(fù)方丹參滴丸對(duì)VEGF的改善作用不及厄貝沙坦，對(duì)于CTGF和MCP-1表達(dá)的下調(diào)作用都很顯著，尤其是對(duì)MCP-1的表達(dá)。有體外實(shí)驗(yàn)表明，三七皂苷PNS能夠抑制尿毒血清誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞增生和總膠原的分泌，還能夠抑制TGF-β1和CTGF的表達(dá)[14-15]，那么推測(cè)在早期DKD中，對(duì)腎小球CTGF的下調(diào)作用一方面可能來(lái)自于三七皂苷。復(fù)方丹參滴丸在控制心血管疾病中顯示出了良好的抗氧化應(yīng)激損傷的作用，其中丹參能夠使血漿中的脂質(zhì)過(guò)氧化物水平降低，而使超氧化物歧化酶上升，提示丹參是良好的氧自由基清除劑。有研究表明在人腎小球系膜細(xì)胞中，糖基化終產(chǎn)物通過(guò)其受體激活氧化應(yīng)激效應(yīng)誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá)上調(diào)[16]，是DKD發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。因此，推測(cè)復(fù)方丹參滴丸對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用可能會(huì)下調(diào)MCP-1表達(dá)，進(jìn)而減輕細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，復(fù)方丹參滴丸改善DKD腎臟細(xì)胞的形態(tài)功能及減少ECM沉積的作用機(jī)制，可能與該藥對(duì)生長(zhǎng)因子VEGF、CTGF及炎癥因子MCP-1表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。而CDDP對(duì)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的具體機(jī)制還需要體外實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步明確。

總之，復(fù)方丹參滴丸能夠有效延緩STZ誘導(dǎo)的早期DKD大鼠微量白蛋白尿的發(fā)展，并且對(duì)DKD腎小球系膜基質(zhì)增多及腎小球基底膜增厚具有改善作用，這些作用可能與下調(diào)生長(zhǎng)因子VEGF、CTGF及炎癥因子MCP-1有關(guān)。

[1] YANG W, LU J, WENG J, et al. Prevalence of diabetes among men and women in China[J]. N Engl J Med, 2010, 362(12):1090-1101.

[2] FIORETTO P, MAUER M. Histopathology of diabetic nephropathy[J]. Semin Nephrol, 2007, 27(2):195-207.

[3] MASON RM, WAHAB NA. Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2003, 14(5):1358-1373.

[4] 鄒萬(wàn)忠. 糖尿病腎病的病理與分型[J]. 中國(guó)糖尿病雜志, 2009, 17(6):423-425.

[5] 張靜，吳靖芳，鄭慧娥，等. 鏈脲佐菌素致大鼠糖尿病模型的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 河北北方學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 23(4):6-8.

[6] 張冬梅，魏素文，段好剛，等. 鏈脲佐菌素誘導(dǎo)制備糖尿病大鼠模型方法學(xué)考察[J]. 蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2008, 34(3):17-19.

[7] ANAVEKAR NS, GANS DJ, BERL T, et al. Predictors of cardiovascular events in patients with type 2 diabetic nephropathy and hypertension: a case for albuminuria[J]. Kidney Int Suppl, 2004, 66(92):S50-S55.

[8] KARALLIEDDE J, VIBERTI G. Hypertension and microalbuminuria: risk factors for cardiovascular disease in diabetes[J]. Curr Hypertens Rep, 2005, 7(1):1-2.

[9] 周小軍，李良，周玲娟，等. 復(fù)方丹參滴丸對(duì)2型糖尿病腎病患者微量蛋白尿的療效[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2009, 18(15):1427-1429.

[10] ADVANI A. Vascular endothelial growth factor and the kidney: something of the marvellous[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2014, 23(1):87-92.

[11] TUFRO A, VERON D. VEGF and podocytes in diabetic nephropathy[J]. Semin Nephrol, 2012, 32(4):385-393.

[12] 張席軍，安文軍. 中期因子及CTGF與糖尿病腎病患者纖維化相關(guān)因子關(guān)系探討[J]. 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 36(4):61-63.

[13] JIAO B, WANG YS, CHENG YN, et al. Valsartan attenuated oxidative stress, decreased MCP-1 and TGF-beta1 expression in glomerular mesangial and epithelial cells induced by high-glucose levels[J]. Biosci Trends, 2011, 5(4):173-181.

[14] 劉海燕，陳孝文，劉華鋒，等. 三七總甙對(duì)尿毒血清誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖及總膠原分泌的影響[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志, 2004, 5(3):143-145.

[15] 劉海燕，陳孝文，劉華鋒，等. 三七總苷對(duì)尿毒血清誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、CTGF基因表達(dá)和蛋白分泌的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2005, 21(11):1366-1370.

[16] 馮敏，徐成波，溫俊平，等. 糖基化終產(chǎn)物對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激及MCP-1表達(dá)的影響及機(jī)制[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2014, 30(4):306-310.

(編輯 國(guó) 榮)

Protective effects of Compound Danshen Dripping Pills on early diabetic kidney disease and its underlying mechanism

LU Wan-hong1, ZHANG Xiao-tian2, CHENG Shao-li2, SHI Bing-yin3

(1. Department of Nephrology, the First Affiliated Hospital; 2. School of Basic Medical Sciences; 3. Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital,Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To explore the effects of Compound Danshen Dripping Pills (CDDP) on early diabetic kidney disease in streptozocin-induced rats of hyperglycemia, and its underlying mechanism. Methods Hyperglycemic rat animal model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin. The model rats were then randomly divided into model group, Compound Danshen Dripping group and irbesartan group. They were then given distilled water, compound Danshen Dripping Pills and irbesartan by intragastric administration, respectively. An additional control group received the same volume of distilled water instead. Urinary albumin, serum creatinine and blood glucose were determined; kidney tissues were observed by PAS and Masson staining; the renal ultrastructures were assessed by electron microscopy. The VEGF, CTGF, and MCP-1 expressions were immunohistochemically detected. Results Compound Danshen Dripping Pills in large doses reduced blood sugar and urinary albumin excretion rate. The renal pathological changes were ameliorated by Compound Danshen Dripping pills. VEGF, CTGF, MCP-1 protein expression levels were decreased. Conclusion Compound Danshen Dripping Pills can effectively reduce renal damage caused by diabetes, which may be related to the decreased expressions of VEGF and inflammatory factors.

Compound Danshen Dripping Pill; diabetic kidney disease; urinary albumin excretion rate; VEGF; CTGF; MCP-1

2014-12-22

2015-09-07

陜西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2007K14-04) Supported by Science-technology Plan of Shaanxi Province (No.2007K14-04)

施秉銀. E-mail: shibingy@126.com

R285

A

10.7652/jdyxb201601025

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151208.1747.014.html(2015-12-08)