四氯化碳制備不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝纖維化模型的研究

張迪，張全勝，張雅敏（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 009；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植實(shí)驗(yàn)室，天津 009；.天津市第一中心醫(yī)院肝膽外科，天津 009）

由于各種理化因素或炎癥長(zhǎng)期反復(fù)作用于肝臟，引起肝細(xì)胞變性、壞死、增生和肝纖維結(jié)締組織的增生和沉積[1]，稱為肝纖維化。如未及時(shí)對(duì)其進(jìn)行控制和治療，嚴(yán)重者可發(fā)展為肝硬化、肝癌，嚴(yán)重威脅人類的健康與生活質(zhì)量[2]。建立標(biāo)準(zhǔn)和理想的肝纖維化動(dòng)物模型，模擬人類肝纖維化狀態(tài)，對(duì)于研究肝纖維化的致病機(jī)制，篩選有效的抗纖維化藥物，開展肝纖維化防治研究尤為重要。目前以四氯化碳（CCl4）法造模為多，本文主要介紹利用此方法在不同動(dòng)物中建立肝纖維化模型。

1 動(dòng)物選擇

根據(jù)研究目的和檢測(cè)手段的不同，可將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為小動(dòng)物（大鼠、小鼠）和大動(dòng)物（兔、狗等）。不同品系的小動(dòng)物對(duì)CCl4的敏感性不同，因此，模型構(gòu)建的結(jié)果也會(huì)有所差別。研究者在構(gòu)建大鼠肝纖維化模型時(shí)常采用SD和Wistar品系大鼠，在構(gòu)建小鼠肝纖維化模型時(shí)常用C57、BALB/c等品系小鼠。研究發(fā)現(xiàn)純種BALB/c小鼠對(duì)CCl4的敏感性較高，純種FVB/N小鼠對(duì)CCl4反應(yīng)較差，而純種C57小鼠對(duì)CCl4反應(yīng)適中，常用來誘導(dǎo)中等程度的肝纖維化模型[3]。由于小鼠體型小，身體耐受性差，死亡率高，采集血液標(biāo)本少，除特定藥物研究和標(biāo)本檢測(cè)外，一般用大鼠進(jìn)行小動(dòng)物肝纖維化研究。對(duì)于大動(dòng)物來說，具有外科操作簡(jiǎn)便，身體耐受性好，死亡率較低，可解決因動(dòng)物模型體積小而不能進(jìn)行某些實(shí)驗(yàn)研究（如肝性腦病磁共振波譜研究和肝移植的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究）的不足[4]。

2 致病機(jī)制

CCl4是誘導(dǎo)動(dòng)物形成肝纖維化最常用的藥物。CCl4進(jìn)入機(jī)體后被肝細(xì)胞攝取而引起肝細(xì)胞損害。如果CCl4濃度過高，常引起急性中毒死亡。低濃度的CCl4進(jìn)入機(jī)體15分鐘后即可被肝細(xì)胞吸收引起肝細(xì)胞的中毒性損害，48小時(shí)后損害程度可達(dá)到高峰[5]。其主要機(jī)制為：CCl4被肝細(xì)胞吸收后，經(jīng)細(xì)胞色素P450代謝產(chǎn)生CCl3自由基團(tuán)[6]，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜物質(zhì)脂質(zhì)過氧化，引起肝細(xì)胞膜物質(zhì)的損害。影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[7]、線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)合成受抑制，影響甘油三酯和蛋白質(zhì)結(jié)合成脂蛋白的過程，引起肝內(nèi)脂肪聚集，線粒體受損，致使能量產(chǎn)生減少，脂肪代謝障礙，從而加重肝細(xì)胞脂肪變性。長(zhǎng)期給予CCl4可持續(xù)刺激成纖維細(xì)胞I型膠原基因大量表達(dá)，從而使I型膠原基因的合成增多，導(dǎo)致肝纖維化的形成[8]。

3 給藥途徑

CCl4誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝纖維化的成模時(shí)間可依給藥途徑和劑量而定。一般分為口服（灌胃）、腹腔注射和皮下注射3種方法[9-13]，也有研究人員采用CCl4蒸汽吸入法誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的形成[3]?？诜ü辔福┓ㄓ捎谀c道反應(yīng)較大，動(dòng)物不耐受，死亡率較高。腹腔注射法為比較常用的給藥途徑，但因腹腔注射會(huì)引起腹膜黏連，注射部位不準(zhǔn)確會(huì)引起膀胱或腸道損傷，造成動(dòng)物的死亡率也較高。相比之下，諸多研究表明，皮下注射可明顯降低動(dòng)物的死亡率，提高成模數(shù)量，但皮下注射一般需要熟練的手法技巧，切不可過深過淺，過深會(huì)導(dǎo)致進(jìn)入肌肉，使CCl4的藥物吸收濃度降低，過淺會(huì)引起皮膚潰爛或藥物溢出。本研究在采用CCl4皮下注射法誘導(dǎo)小鼠肝纖維化時(shí)發(fā)現(xiàn)，即使注射部位精準(zhǔn)，仍需每次更換刺入部位，否則同樣會(huì)引起皮膚潰爛，不易成活。

4 造模方法

4.1 小鼠用藥及劑量：30% CCl4橄欖油溶液或玉米油溶液，10μl/g，2次/周，共12周[14]。

飲食的控制：注射CCl4前4周，開始乙醇液體飼料喂養(yǎng)。乙醇液體飼料的熱量構(gòu)成比為：乙醇36%，蛋白質(zhì)18%，脂肪35%，碳水化合物11%[15]。

4.2 大鼠用藥及劑量：40% CCl4棉籽油或玉米油溶液，實(shí)驗(yàn)第1天皮下注射5 μl/g CCl4，以后每隔4天皮下注射3 μl/g CCl4，共注射10次。以單純玉米面作為飼料，前2周為80%玉米面、20%豬油并混以0.5%膽固醇，以30%乙醇為飲料[16]。

有研究人員對(duì)上述飲食結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改良，用50% CCl4棉籽油溶液以3 μl/g的量進(jìn)行皮下注射，2次/周，普通顆粒飼料，以5%乙醇作為飲料，約8周后可獲大鼠肝纖維化模型。

4.3 兔用藥及劑量：純CCl40.5 μl/g皮下注射，2 次 /周，約 12 周[17]。

飲食的控制：低蛋白，高脂肪膳食，配以10%乙醇作為飲料飲用。

4.4 狗用藥及劑量：以0.12 μl/g劑量腹腔注射50%CCl4花生油溶液，2次/周，約8周[18]。

飲食的控制：米飯拌豬油，含豬油10%，配以10%乙醇作為飲料飲用。

本文所列以上方法為各研究者采用的最適方法。關(guān)于CCl4法構(gòu)建各種類型動(dòng)物肝纖維化模型的方法，各研究者采用不同的用藥濃度、給藥劑量、給藥頻次和給藥周期，一般為20%～50% CCl4油溶液1～5 μl/g，2～3次/周，時(shí)間約為8～12周。雖然各研究方法不一，但最終均可成功建模。另外，配以低蛋白，高脂肪飲食，乙醇飲料作為飲食控制可增加各種動(dòng)物對(duì)CCl4的敏感性，從而縮短建模周期[19]。

5 注意事項(xiàng)

5.1 動(dòng)物稱重與健康評(píng)估，呼吸頻率改變、毛發(fā)粗糙、行為活動(dòng)異常者不宜納入造模范圍[3]。

5.2 每次注射藥物，應(yīng)重新稱量動(dòng)物體重，以避免藥物劑量過大引起中毒性死亡。隨肝臟損害不斷加重，動(dòng)物體重會(huì)逐漸下降。

5.3 采用皮下注射時(shí)，針頭深度須適宜，注射完畢后針頭應(yīng)在皮下停滯一會(huì)，避免藥物滲出影響注射劑量，待下次注射時(shí)應(yīng)更換注射部位，避免引起皮膚壞死。

5.4 采用灌胃時(shí)，須注意防止藥物誤入氣管而使動(dòng)物死亡。

5.5 采用腹腔注射時(shí)，應(yīng)避免損傷膀胱及腸道，引起動(dòng)物死亡。

5.6 注射藥物期間，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)食欲下降，體重減輕，行為異常，體質(zhì)下降等現(xiàn)象，需注意飼養(yǎng)條件的清潔，以免引起感染。

5.7 配制藥物時(shí)，操作者應(yīng)注意防護(hù)措施，應(yīng)在通風(fēng)的房間里進(jìn)行操作，以減少操作者對(duì)揮發(fā)性藥物的吸入。

6 結(jié) 語

動(dòng)物肝纖維化模型的建立對(duì)于臨床肝纖維化疾病的防治研究具有重要意義。近年來，國內(nèi)外采用多種方法誘導(dǎo)肝纖維化模型，主要包括化學(xué)中毒性肝纖維化（CCl4、二甲基硝銨[20]、D-半乳糖胺）、乙醇法[21]、免疫法、膽管阻塞法[22]等，但以CCl4誘導(dǎo)化學(xué)中毒建立肝纖維化模型居多。雖然方法不一，但病理發(fā)展過程一致，分為三期：肝細(xì)胞變性壞死期、纖維增生期和假小葉形成期。本研究采用40% CCl4玉米油溶液皮下法誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型時(shí)，前2周給予3 μl/g急性誘導(dǎo)肝細(xì)胞變性壞死，后期給予2 μl/g劑量維持，3次/周，普通飲食，6周左右病理可見成模。目前由于價(jià)格低廉、造模周期短，小動(dòng)物肝纖維化模型較多，但肝臟體積小，血容量少限制某些檢測(cè)手段，大動(dòng)物模型的構(gòu)建將成為以后研究肝纖維化疾病的趨勢(shì)。