無靜脈轉流大動物劈離式原位肝移植模型的建立

付建峰，高偉，劉蕾，陳靜，沈中陽（.天津醫(yī)科大學一中心臨床學院，天津3009；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 3009）

器官移植已經(jīng)成為21世紀醫(yī)學發(fā)展的主要方向之一，是根治終末期器官功能衰竭唯一有效的手段[1]。但目前供體嚴重短缺是制約器官移植發(fā)展的重要因素，為此，劈離式肝移植逐步發(fā)展起來。建立穩(wěn)定的劈離式肝移植模型，對最大限度地利用供肝、增加供肝數(shù)量及兒童親體肝移植具有重要意義。豬的肝臟解剖和生理特征與人類相近，是肝移植首選的模型動物。現(xiàn)將天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心2014年10月至2015年8月無靜脈轉流條件下豬劈離式原位肝移植模型建立的經(jīng)驗總結如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：隨機選取40只健康巴馬小型豬，雌雄不限，10～12月齡，體重為30～35 kg。將實驗動物隨機分為供體組和受體組，每組20只，共實施20例劈離式原位肝移植術。

1.2 實驗方法

1.2.1 術前準備與麻醉：術前禁食24小時，禁水12小時。經(jīng)供體臀大肌肌注戊30 mg/kg巴比妥鈉、0.1 mg/kg咪達唑侖和0.03 mg/kg阿托品行麻醉誘導，麻醉后稱重。將供體仰臥位固定于恒溫動物手術臺，胸前連接5導聯(lián)心電監(jiān)護，豬尾連接血氧飽和度探頭用以檢測脈搏和血氧飽和度。耳背靜脈建立外周靜脈通路，給予1 mg/kg氯化琥珀膽堿使其肌肉松弛后行氣管插管，連接呼吸機行間歇正壓通氣，潮氣量為10～12 ml/kg，呼吸頻率為18～20次/分，I/E吸呼比為1：2。七氟烷吸入維持麻醉，間斷靜脈注射維庫溴銨維持肌肉松弛。行右側頸部切口游離頸總動脈、頸內靜脈，經(jīng)頸總動脈置管監(jiān)測術中平均動脈壓及心率。經(jīng)頸內靜脈置三腔管監(jiān)測中心靜脈壓并作為術中、術后補液及取血通路。

1.2.2 供肝獲取及修整

1.2.2.1 供肝獲?。喝「共块L正中切口，公豬切口時應注意避開陰莖及尿道。以濕鹽水紗布保護脾及腸管并將其推向左下腹，于肝十二指腸韌帶下緣游離膽總管、肝動脈及門靜脈。于十二指腸上方離斷膽總管。肝動脈向下游離至胃十二指腸動脈下2 cm處，結扎切斷胃十二指腸動脈及胃左動脈，保留足夠長的殘端以備受體移植物動脈吻合。游離門靜脈主干約5 cm，結扎幽門靜脈。游離肝下下腔靜脈至右腎上腺水平，注意切斷肝下下腔靜脈時應避開肝尾狀葉包繞的下腔靜脈段，以防止肝移植術后血管吻合口滲血。最后游離肝周韌帶。在整個游離過程中應注意避免反復翻動肝臟，造成肝組織損傷，局部微血栓形成，影響供肝灌注。游離完成后經(jīng)頸靜脈通路推注12 500單位肝素行全身肝素化，5分鐘后將灌注管路分別置入肝動脈和門靜脈，1 m高重力灌注4℃乳酸林格液3 000 ml，同時鉗夾肝下下腔靜脈，沿肝上下腔靜脈剪開膈肌，于膈肌孔上方1 cm處離斷肝上下腔靜脈，以使灌注液順利流出，同時輕柔按摩肝臟。乳酸林格液灌注完畢后，繼續(xù)灌注4℃的器官保存液（UW液）1 000 ml。完全離斷肝下下腔靜脈，取出供肝，迅速置于器官保存液中。

1.2.2.2 供肝修整：灌注完畢后，于供體UW液冰水浴中修整供肝并劈離。沿肝中裂畫一標記線（圖1），銳性割開肝臟表面被膜，用精細的蚊式止血鉗依次鉗夾分離肝實質，用4-0絲線仔細結扎切斷小動脈、小靜脈及肝內膽管分支，至門靜脈左干位置游離徹底后結扎切斷，注意勿損傷門靜脈壁。顯露第二肝門的肝左靜脈主干后，以無損傷血管鉗夾離斷肝左靜脈后，用5-0 prolene縫合左側肝左靜脈，保留右半肝作為供肝植入受體豬。修整肝動脈、門靜脈、肝上下腔靜脈及肝下下腔靜脈便于縫合。結扎膽囊管，剪開膽囊底部，抽凈膽汁后以0號絲線結扎。最后用滴水雙極電凝鑷預處理肝臟斷面，減少再灌注后肝斷面出血及膽瘺的出現(xiàn)。

圖1 劈離線示意圖

1.2.3 受體手術：麻醉、氣管插管、建立術中監(jiān)測后開腹，受體豬手術切口位置選取同供體。依次游離肝膽總管、肝動脈、門靜脈及肝上下腔靜脈、肝下下腔靜脈。無肝期前應充分補液，若無肝期血壓控制不理想，應根據(jù)具體情況泵入多巴酚丁胺維持無肝期平均動脈壓不低于50 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa），如遇頑固性低血壓可適當應用去甲腎上腺素。依次阻斷肝動脈、門靜脈及肝上下腔靜脈、肝下下腔靜脈，此時，無肝期正式開始。離斷相應血管，切除受體肝臟，迅速將供肝原位置入腹腔，用5-0 prolene連續(xù)縫合肝上下腔靜脈，同時用常溫的乳酸林格液沖洗出供肝中殘余的UW液和酸性代謝產(chǎn)物。用6-0 prolene連續(xù)縫合門靜脈，打結時預留約1 cm“生長因子”，以防術后血管狹窄[2]。門靜脈吻合完畢后開放門靜脈，經(jīng)供肝的肝下下腔靜脈殘端放出肝內殘余氣體后夾閉肝下下腔靜脈，開放肝上下腔靜脈，此時無肝期結束。同時靜脈滴入10 mg/kg甲潑尼龍，5%碳酸氫鈉200 ml。劈離斷面應無明顯大量出血，以紗布暫時壓迫。用5-0 prolene連續(xù)縫合肝下下腔靜脈。此時應確切止血，包括檢查各吻合口有無明顯出血，處理肝臟劈離斷面。采用滴水雙極電凝鑷和prolene縫扎結合的方法確切止血，直至無肉眼可見出血。以8-0 prolene吻合肝動脈。最后吻合膽總管，采用潘明新等[3]研究中的套管法吻合，用0號慕絲線固定。復溫水沖洗腹腔，將供肝結扎后的膽囊與腹膜牽拉固定，以擺正肝臟位置，防止吻合血管扭轉及狹窄。放置腹腔引流管，拔除頸內動脈插管并結扎頸內動脈，保留并固定頸內靜脈插管用于術后給藥、補液和取血。

1.2.4 術后管理：動物飼養(yǎng)室的溫度應保持在26～28℃左右，術后豬可自行排尿，第2天自由進食進水。術后每日兩次給予頭孢呋辛鈉0.75 g，連用3天抗感染，抗排斥治療參考經(jīng)典原位肝移植術后的方案[4]，以他克莫司（0.04 mg/kg，每日1次×4天）聯(lián)合甲潑尼龍（劑量每日遞減，每日1次×4天，每日劑量分別為5、4、3、2 mg/kg）抗排斥，根據(jù)每天失血量、血糖水平、血氣分析等結果調整酸堿平衡及補液量。

1.3 術中監(jiān)測：術中持續(xù)監(jiān)測受體的平均動脈壓、中心靜脈壓和心率，分別于無肝期前、無肝期、新肝期10分鐘及關腹前取血，監(jiān)測其血氣分析情況。

1.4 統(tǒng)計：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包處理，計量資料均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，不同時間點間差異采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩組之間比較采用最少顯著性差異法，P＜0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 手術基本情況：供肝冷缺血時間為（246.30±34.58）分鐘，修肝及劈離時間為（32.25±3.41）分鐘，無肝期時間為（19.35±4.09）分鐘，受體手術時間為（282.75±31.14）分鐘。劈離后用于移植的右半肝體積占完整供肝體積的（53.20±5.48）%。無肝期結束后數(shù)分鐘內可見金黃色膽汁引出。20只豬劈離式原位肝移植模型受體中，術后2只由于肝劈離面出血過多導致麻醉復蘇失敗，其余18只復蘇成功并拔管，術后第2天受體可正常進食水，術后第3天有3只受體豬因腹腔感染死亡，術后5天存活率為65%。

2.2 術中血流動力學參數(shù)變化（表1）：與無肝期前相比，無肝期受體豬的平均動脈壓、中心靜脈壓明顯降低，心率明顯增快 （均P＜0.05）。新肝期后，平均動脈壓、中心靜脈壓逐漸上升，心率逐漸下降，通過快速輸注膠體液（羥乙基淀粉），關腹前恢復至無肝期前水平。

表1 20只受體豬術血流動力學變化（±s）

表1 20只受體豬術血流動力學變化（±s）

注：與無肝期前比較，aP＜0.05

檢測時間 平均動脈壓（mmHg）中心靜脈壓（cmH2O）心率（次/分）無肝期前 105.3±10.0 5.51±4.06 121.9±8.8無肝期 58.5±8.2a 2.17±2.11a 151.3±16.0a新肝期 85.1±14.8a 4.62±3.20 136.0±10.1a關腹前 97.9±12.9 5.67±3.17 121.3±11.7

2.3 術中血氣分析指標變化（表2）：與無肝期前相比，術中無肝期各項指標無明顯變化；與無肝期相比，新肝期時，pH值顯著下降，K+濃度、乳酸濃度顯著升高（均P＜0.05）；隨著補液調整，至手術結束時pH值、K+濃度恢復正常，乳酸維持在較高水平。

表2 20只受體豬術中血氣分析變化（±s）

表2 20只受體豬術中血氣分析變化（±s）

注：與無肝期比較，aP＜0.05

檢測時間 pH值 K+（mmol/L）乳酸（mmol/L）無肝期前 7.534±0.078 3.52±0.31 3.51±1.54無肝期 7.514±0.071 3.36±0.28 3.39±1.03新肝期 7.307±0.083a 5.86±0.71a 6.53±1.54a關腹前 7.438±0.076 3.64±0.36 6.38±1.55a

3 討 論

肝移植是目前治療終末期肝病唯一有效的手段，隨著這項技術的成熟，等待移植的患者數(shù)量迅速增加，越來越多的患者在等待移植過程中死亡。為此劈離式肝移植應運而生，此術式是基于肝臟為功能性分段器官的理論，將一個完整的尸體供肝分割成2個或2個以上的解剖功能單位，分別移植給不同受者，以達到“一肝兩受”或“一肝多受”的目的。該術式的出現(xiàn)有效地增加了兒童患者的供肝來源，同時又不減少成人供肝的數(shù)量。隨著劈離式肝移植技術的發(fā)展，相關的實驗研究也逐步發(fā)展起來。

豬的肝臟解剖與人相近，病理生理特點也與人相似，所以常用豬作為大動物肝移植模型，而小型巴馬豬是理想的實驗動物[5]。小型巴馬豬的肝分為右外側葉、中葉、左外側葉和尾狀葉。其中，中葉有肝中裂，把中肝又分為左中葉和右中葉，尾狀葉很小并與右外側葉相連。膽囊位于右中葉。門靜脈由脾靜脈和腸系膜上靜脈匯合而成，門靜脈在接近肝實質處分出左右兩個主要分支，在左右肝葉間門靜脈幾乎沒有交通支[6]，這一結構有利于自肝中裂將豬肝分離為左右兩半肝。由于我們只做右半肝移植，所以不必將劈離線選為Taira線[7]，而是參照Kelly等[8]將劈離線選在肝中裂（圖1）的位置，發(fā)現(xiàn)經(jīng)該位置劈離肝實質內血管膽管交通支較少，可較徹底地對其進行結扎切斷，降低出血及膽瘺的可能。劈離至門靜脈向左的分支處，此處門靜脈無其他側支，游離徹底后以絲線結扎切斷即可。向上劈離至第二肝門的肝左靜脈主干，由于此靜脈較寬扁，直徑較大，以無損傷血管鉗夾離斷后需用5-0 prolene縫合，止血較為確切。劈離式肝移植的目的是“一肝兩受”或“一肝多受”，右半肝行原位肝移植，左半肝的移植行背駝式肝移植。但是由于豬的肝臟并不像人，能完全劈離成兩個可用的肝臟，如將左半肝行背駝式肝移植，需保留完整的下腔靜脈，而肝臟與下腔靜脈交通支極多，處理后難以完全止血；或者重建下腔靜脈，則增加手術難度和時間，致使無肝期時間過長。我們的研究目的主要是探究肝臟劈離的過程，只需對比同側肝臟移植后的效果，因此，本研究僅行右半肝移植手術，便于手術成功及進一步研究的順利進行。

豬肝動脈與人的解剖有差異，其較早發(fā)出數(shù)個分支，故全肝移植時多從腹腔動脈起始處開始游離，結扎胃十二指腸動脈及胃左動脈，并保留胃左動脈發(fā)出的至左肝的分支。但由于本研究中劈離式肝移植只需要右半肝，故可只在肝十二指腸韌帶處游離肝動脈，胃左動脈發(fā)出至左肝的分支亦可結扎切斷。

無肝期開始后，由于下腔靜脈阻斷，血液回心受阻，導致平均動脈壓和中心靜脈壓迅速下降，此時血壓下降并非血容量不足造成的，故應盡量減少補液，適當應用血管活性藥物可保持血流動力學相對穩(wěn)定。門靜脈開放后，血液回心增多，平均動脈壓和中心靜脈壓迅速回升。此時應減慢補液速度，并逐步減少血管活性藥物的使用。劈離后的肝臟體積小，術野好，故應盡量減少無肝期時間以降低對機體的打擊，一般將無肝期控制在30分鐘之內[9-10]。本研究將無肝期時間控制在（19.35±4.09）分鐘，能夠較好地保證手術的成功率。無肝期結束后，應確切止血。除了對各個血管吻合口確切止血，劈離式原位肝移植還需要對劈離面進行確切止血，有時劈離面出血較嚴重，可對豬行額外補液或輸血，然而由于門靜脈的高灌注，補液過多會導致微血管壓力增高，止血難度增加，所以應嚴格控制補液量及補液速度，整個受體手術過程中總補液量約為5 000 ml。

由于劈離后肝臟體積減小約1/2，移植后肝臟所占空間變小，肝臟容易移位導致吻合血管狹窄及血栓的形成，經(jīng)驗表明，將結扎后的膽囊壁與左側腹膜固定，可以使肝臟處于一個相對固定的狀態(tài)，從而防止此類術后并發(fā)癥的發(fā)生。

目前，國內外關于豬劈離式肝移植的研究很少，小動物難以完成劈離式肝移植，所以研究劈離式肝移植的相關內容必須使用大動物模型。而大動物減體積肝移植的存活率不高[8，11]，我們建立了無靜脈轉流豬劈離式原位肝移植模型，實驗初期由于對劈離面的處理經(jīng)驗不足，導致術中止血難度增加從而對肝功能產(chǎn)生較大的影響。此外，術中尤其是無肝期前后血流動力學和血氣分析結果波動大，應通過無肝期快速補液、適量給予血管活性藥物以維持血流動力學穩(wěn)定，并盡量縮短無肝期時間，這樣建立的模型術后存活率較高。